一種磷脂酶Dα活性的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種磷脂酶Dα活性的測(cè)定方法，是使用酶聯(lián)比色法測(cè)定磷脂酶Dα活性的方法。其技術(shù)方案是以磷脂酰膽堿為底物，磷脂酶Dα催化水解其末端的磷酸二酯鍵生成磷脂酸和膽堿，膽堿在膽堿氧化酶的催化作用下生成甜菜堿和H2O2，生成的H2O2在過氧化物酶催化下將4-氨基安替匹林和重蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì)，測(cè)定該粉紅物質(zhì)的吸光度值，并根據(jù)事先制作的膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，來確定相應(yīng)的膽堿含量，并以此推算出磷脂酶Dα的活性。在200ul磷脂酶Dα的反應(yīng)體系中，蛋白含量和Ca2+濃度在10ug和10mM為宜。本發(fā)明是一種高效便捷，靈敏度高，危害低，結(jié)果穩(wěn)定，適于同時(shí)測(cè)定大量樣品的磷脂酶Dα活性檢測(cè)方法。
【專利說明】一種磷脂酶Da活性的測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種測(cè)定磷脂酶Da活性的方法，具體涉及用酶聯(lián)比色法測(cè)定磷 脂酶Da的活性以及涉及測(cè)定過程中關(guān)鍵參數(shù)的選擇。

【背景技術(shù)】
[0002] 磷脂酶D (PLD)，即磷脂酰膽堿磷脂水解酶（EC3. 1. 4. 4)，是催化磷酸二酯鍵水解 和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱。最先由Hanahan和Chaikoff從胡蘿卜根和菠菜葉的提 取物中得到磷脂酶D。磷脂酶D廣泛存在于從原核細(xì)菌到高等動(dòng)植物在內(nèi)的多種生物中，是 植物中主要的磷脂酶，主要存在于細(xì)胞膜上，細(xì)胞質(zhì)中也存在少量。研究表明，在植物中磷 脂酶D具有參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、生物膜形成和抗逆境脅迫等生理功能。而磷脂酶 D α是植物體內(nèi)最主要的磷脂酶D，它具有可催化自然的或人工合成的磷脂類的水解作用， 人們通過直接或間接測(cè)定水解作用生成物的量來表示磷脂酶Da的活性。目前PLDa活性 測(cè)定方法主要有，薄板層析法、放射性同位素標(biāo)記法。薄板層析法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但操作費(fèi) 時(shí)，易受外源性磷脂的干擾。放射性同位素標(biāo)記法測(cè)定靈敏度高，誤差小，重復(fù)性好，但易對(duì) 操作人員身體造成傷害，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高很難普及。
[0003] 本發(fā)明選用磷脂酰膽堿為磷脂酶D a的水解底物，以4-氨基安替匹林和重蒸酚為 顯色劑來制作的膽堿含量與測(cè)得的相應(yīng)的紅色物質(zhì)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線，以此推 算出待測(cè)物中磷脂酶Da的活力。該方法易于操作，靈敏度高，可快速測(cè)定磷脂酶Da的活 性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)已有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供了一種磷脂酶Da活性的測(cè)定方法， 該方法采用酶聯(lián)比色法來測(cè)定磷脂酶Da的活性。
[0005] 本發(fā)明一種磷脂酶Da活性的測(cè)定方法，其特征在于具有以下的過程和步驟:A， 制作用酶聯(lián)比色法測(cè)得的紅色產(chǎn)物的吸光度值與其相應(yīng)的膽堿含量標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線；B，用酶 聯(lián)比色法檢測(cè)待測(cè)磷脂酶D a催化水解磷脂酰膽堿一系列反應(yīng)后產(chǎn)生的紅色物質(zhì)的吸光 度值，根據(jù)上一步驟制作的膽堿含量與測(cè)得的相應(yīng)的紅色物質(zhì)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲 線，確定生成膽堿的含量，以此推算出待測(cè)磷脂酶Da的活性。
[0006] 上述步驟A的具體步驟是；取50%磷脂酰膽堿水溶液按照梯度系列稀釋成11組不 同濃度的膽堿水溶液，編號(hào)，分別加入顯色液〇. 8mL(含45mmol/L的pH8. 0 Tris-HCL〈三 羥甲基氨基甲烷-鹽酸混合溶液〉、〇. 8單位膽堿氧化酶、2. 4單位HRP〈辣根過氧化酶〉、 0· 24mg4_ATT〈4-氨基安替匹林〉和0· 16mg重蒸酚）；30°C反應(yīng)90min，色澤穩(wěn)定后加 lmL Tris-HCL (含2g/L Triton X-100〈聚乙二醇辛基苯基醚〉，ρΗ8· 0);用0· 22 μ m孔徑濾膜 濾去蛋白質(zhì)，測(cè)吸光度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；根據(jù)膽堿的含量與所測(cè)得的吸光度值 之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線； 上述步驟B的具體步驟是；取200 μ 1磷脂酶D a反應(yīng)系（做三個(gè)平行樣)，其中含終濃 度為 0· lmmol/LDMG (ρΗ6· 5)，10mmol/LMgCL2,10mmol/LCaCL2, 5mmol/L 亞油酸，10 μ gPLD 粗 酶液；最后加入12mmol/L憐脂醜膽喊；封口后30 C保溫反應(yīng)30min，沸水浴lOmin終止反 應(yīng)；冷卻后加入顯色液〇. 8mL (含45mmol/L的pH8. 0 Tris-HCL、0. 8單位膽堿氧化酶、2. 4單 位 HRP、0. 24mg4-ATT 和 0· 16mg 重蒸酚），30°C反應(yīng) 90min，色澤穩(wěn)定后加 lmL Tris-HCL(含 2g/L Triton X-100, pH8. 0);用0. 22 μ m孔徑濾膜濾去蛋白質(zhì)，測(cè)吸光度值；根據(jù)A步驟制 作的膽堿含量與測(cè)得的相應(yīng)的紅色物質(zhì)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線，確定生成膽堿的含 量，以此推算出待測(cè)磷脂酶D α的活性。
[0007] 上述200 μ 1磷脂酶D α中Ca2+濃度為10mM。
[0008] 上述200 μ 1磷脂酶Da中蛋白質(zhì)含量為1〇 μ g。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明用酶聯(lián)比色法對(duì)磷脂酶Da水解磷脂酰膽堿后所產(chǎn)生的 膽堿的含量進(jìn)行檢測(cè)以此確定磷脂酶Da的活性，因此對(duì)膽堿含量檢測(cè)的靈敏度直接決定 著對(duì)磷脂酶Da活性檢測(cè)的靈敏度。該方法快速，易于操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低易普及，而 且靈敏度極高。

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1吸光度與膽堿的物質(zhì)的量的關(guān)系； 圖2蛋白含量對(duì)水蜜桃果實(shí)磷脂酶Da活性的影響； 圖3不同Ca2+濃度對(duì)水蜜桃果實(shí)磷脂酶Da活性的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 主要儀器：756CRT紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；磷脂酰膽堿 (PC)、二甲基戊二酸（DMG)、膽堿氧化酶、辣根過氧化酶（HRP)、亞油酸購自Sigma公司；50% 膽堿水溶液，安譜科學(xué)儀器有限公司的日本進(jìn)口試劑；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。 [0011] 配制11組不同濃度的膽堿水溶液，編號(hào)，分別加入顯色液〇. 8mL (含45mmol/L的 ρΗ8· 0 Tris-HCL、0. 8 單位膽堿氧化酶、2. 4 單位 HRP、0. 24mg4-ATT 和 0· 16mg 重蒸酚），30°C 反應(yīng) 90min，色澤穩(wěn)定后加 lmL Tris-HCL(含 2g/L Triton Χ-100，ρΗ8·0)，用 0.22 μ m 孔徑 濾膜濾去蛋白質(zhì)，測(cè)吸光度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；以膽堿的含量為橫坐標(biāo)，以500nm 的吸光度值為縱坐標(biāo)作圖1。
[0012] 從圖1可見，測(cè)膽堿的靈敏度為1. 3365nmol，線性范圍為1. 3365nmol?267. 3mmol， 膽堿含量與吸光度值之間具有很好的線性相關(guān)關(guān)系，直線回歸方程y=〇. 0026X+0. 1005,相 關(guān)系數(shù) R2=〇. 9998。
[0013] 有關(guān)附加實(shí)驗(yàn)例 附加實(shí)驗(yàn)例1蛋白含量測(cè)定 在4°C下，取水蜜桃果實(shí)7g用HEPES緩沖液（pH7. 0,含0. 32mol/L蔗糖，二硫代蘇糖醇、 苯甲基磺酰氟、EGTA各lmmol/L)，制成20%勻漿，12000g離心45min，上清再以105000g離 心1小時(shí)，沉淀部分為細(xì)胞膜的膜性組分，溶于100mmol/LpH6. 5的DMG，得PLD α粗酶提取 液，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，磷脂酶Da的活性為橫坐標(biāo)作 圖2。
[0014] 在圖2中，BA表示用正丁醇浸泡處理，在4°C貯藏28天后的水蜜桃果實(shí)，CK表示 不作任何處理，在4°C貯藏28天后的水蜜桃果實(shí)。
[0015] 從圖2可見，在200μ 1反應(yīng)體系中，磷脂酶Da的活性隨著蛋白質(zhì)含量的增加而 迅速增長；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量達(dá)10 μ g時(shí)，不同處理的磷脂酶D a活性都表現(xiàn)出最大值，隨后隨 著蛋白質(zhì)含量的增加而下降。在桃果實(shí)磷脂酶Da的活性測(cè)定反應(yīng)系中以蛋白質(zhì)含量在 10 μ g為宜。
[0016] 附加實(shí)驗(yàn)例2 Ca2+濃度的測(cè)定 在200μ 1反應(yīng)體系中，分別加入的鈣離子終濃度為0、0· 05mM、0. lmM、lmM、10mM、50mM， 以鈣離子終濃度為橫坐標(biāo)，以磷脂酶D α的活性為縱坐標(biāo)作圖3。
[0017] 從圖3可見，磷脂酶D α活性隨著Ca2+濃度的增加呈現(xiàn)波動(dòng)增長趨勢(shì)，當(dāng)Ca2+濃 度達(dá)到10mM時(shí)，磷脂酶Da表現(xiàn)出最大活性，見圖3。桃果實(shí)磷脂酶Da活性測(cè)定反應(yīng)系中 Ca2+濃度為10mM為宜。
【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)磷脂酶Da活性的方法，其特征是；具有以下的過程和步驟： A. 制作用酶聯(lián)比色法測(cè)得的紅色產(chǎn)物的吸光度值與其相應(yīng)的膽堿含量標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線； 具體步驟是；取50%磷脂酰膽堿水溶液按照梯度系列稀釋成11組不同濃度的膽堿水溶液， 編號(hào)，分別加入顯色液〇. 8mL(含45mmol/L的pH8. 0 Tris-HCL〈三羥甲基氨基甲烷-鹽 酸混合溶液〉、〇. 8單位膽堿氧化酶、2. 4單位HRP〈辣根過氧化酶〉、0. 24mg 4-ATT〈4-氨 基安替匹林〉和〇· 16mg重蒸酚）；30°C反應(yīng)90min，色澤穩(wěn)定后加 lmL Tris-HCL (含2g/L Triton X-100〈聚乙二醇辛基苯基醚〉，pH8.0);用0.22 μ m孔徑濾膜濾去蛋白質(zhì)，測(cè)吸光 度值；每個(gè)濃度做三個(gè)平行樣；根據(jù)膽堿的含量與所測(cè)得的吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn) 關(guān)系曲線； B. 用酶聯(lián)比色法檢測(cè)待測(cè)磷脂酶D a催化水解磷脂酰膽堿一系列反應(yīng)后產(chǎn)生的紅 色物質(zhì)的吸光度值，根據(jù)上一步驟制作的膽堿含量與測(cè)得的相應(yīng)的紅色物質(zhì)吸光度值之間 的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線，確定生成膽堿的含量，以此推算出待測(cè)磷脂酶Da的活性；具體步驟是： 取200μ1磷脂酶Da反應(yīng)系(做三個(gè)平行樣)，其中含終濃度為〇. lmmol/L DMG (二甲基戊 二酸，pH6. 5)，10mmol/L MgCL2,10mmol/L CaCL2, 5mmol/L 亞油酸，10 μ g PLD 粗酶液；最后 加入12mmol/L磷脂酰膽堿；封口后30°C保溫反應(yīng)30min，沸水浴10min終止反應(yīng)；冷卻后 加入顯色液0. 8mL(含45mmol/L的pH8. 0 Tris-HCL、0. 8單位膽堿氧化酶、2. 4單位HRP、 0· 24mg4-ATT 和 0· 16mg 重蒸酚），30°C 反應(yīng) 90min，色澤穩(wěn)定后加 lmL Tris-HCL (含 2g/L Triton X-100, pH8. 0);用0. 22 μ m孔徑濾膜濾去蛋白質(zhì)，測(cè)吸光度值；根據(jù)A步驟制作的 膽堿含量與測(cè)得的相應(yīng)的紅色物質(zhì)吸光度值之間的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線，確定生成膽堿的含量， 以此推算出待測(cè)磷脂酶Da的活性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)磷脂酶D a活性的方法，其特征是；在200 μ 1磷脂 酶Da的活性測(cè)定反應(yīng)系中蛋白質(zhì)含量為l〇yg。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)磷脂酶D a活性的方法，其特征是；在200 μ 1磷脂 酶Da的活性測(cè)定反應(yīng)系中Ca2+濃度為10mM。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104155291SQ201410210646
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年5月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月19日
【發(fā)明者】萬嗣寶, 張宏宇, 李偉麗, 朱月瑩 申請(qǐng)人:上海大學(xué)