魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的dapi染色方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法，其特征在于：所述的方法按如下步驟進(jìn)行：受精10min后開(kāi)始取卵，每10min取10-20個(gè)受精卵，取樣到四細(xì)胞期,用多聚甲醛固定液固定24h；將固定后的受精卵換入到PBS中浸泡，并在36h后更換一次PBS，于4℃冷藏；取冷藏卵放入事先加入PBS的培養(yǎng)皿中，去除卵膜和植物極，并將動(dòng)物極放入裝有PBS的離心管中，避光；吸出離心管中的PBS，向離心管中加入Tween20和5μg/ml的DAPI染色液，且Tween20和DAPI染色液的體積比為1：100，將離心管放入搖床中進(jìn)行染色10-30min。
【專(zhuān)利說(shuō)明】魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種胚胎染色方法，特別是一種魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中，很多不同性別的重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)往往會(huì)表現(xiàn)出不同的生產(chǎn)性能，如體型和體色的差異，生長(zhǎng)速度的快慢，性成熟時(shí)間的不同等。所以，通過(guò)雌、雄核發(fā)育控制魚(yú)類(lèi)的性別，選擇具有最佳生長(zhǎng)性能的雌、雄性進(jìn)行單性養(yǎng)殖，具有極為重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]在水產(chǎn)動(dòng)物中人工誘導(dǎo)雌、雄核發(fā)育已有不少成功的報(bào)道，尤其是近幾年國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者在貝類(lèi)雌、雄發(fā)育發(fā)生機(jī)理、細(xì)胞學(xué)機(jī)制等方面取得了一系列的進(jìn)展。但關(guān)于魚(yú)類(lèi)雌、雄核發(fā)育的細(xì)胞學(xué)機(jī)制的報(bào)道都是通過(guò)受精細(xì)胞學(xué)切片和胚胎發(fā)育觀察，該方法操作繁瑣、染色體行為不夠清晰。因此現(xiàn)在需要一種能夠幫助研究人員觀察胚胎發(fā)育過(guò)程以達(dá)到人工誘導(dǎo)雌、雄核發(fā)育目的的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種操作簡(jiǎn)單、快捷，能夠幫助研究人員在熒光顯微鏡下清晰觀察的魚(yú)類(lèi)早期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法，其特征在于:所述的方法按如下步驟進(jìn)行:
a.受精I(xiàn)Omin后開(kāi)始取卵，每10min取10-20個(gè)受精卵，取樣到四細(xì)胞期，用多聚甲醒固定液固定24 h;
b.將固定后的受精卵換入到PBS中浸泡，并在36h后更換一次PBS，于4°C冷藏；
c.取冷藏卵放入事先加入PBS的培養(yǎng)皿中，去除卵膜和植物極，并將動(dòng)物極放入裝有PBS的離心管中，避光，
d.吸出離心管中的PBS，向離心管中加入Tween20和5μ g/ml的DAPI染色液，且Tween20和DAPI染色液的體積比為1: 100，將離心管放入搖床中進(jìn)行染色10_30min。
[0006]所述的PBS 為:100ml 蒸餾水中含有 NaCl 8g，Na2HPO412H20 3g，KCl 0.2g,KH2P04 0.2g。
[0007]所述的多聚甲醛固定液是將利用PBS稀釋至2%的戊二醛和多聚甲醛按照1:1的體積比混合后獲得的。
[0008]所述的DAPI染色劑為DAPI母液和緩沖液按照體積比為1:5的比例混合獲得，所述DAPI母液是將IOmgDAPI溶在IOOOml的蒸餾水中得到的，所述緩沖液為:100ml蒸餾水中含有 0.12414gTris-HCl、0.37225g EDTA_2Na 及 0.5844g NaCl，且緩沖液的 ρΗ=7.4。
[0009]本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明公開(kāi)了一種魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法，該染色方法操作簡(jiǎn)單、快捷，能夠幫助研究人員在熒光顯微鏡下能清晰的觀察到正常卵子與雄核發(fā)育卵子在減數(shù)分裂、受精過(guò)程和卵裂早期中的核相變化。該方法相比與傳統(tǒng)的受精細(xì)胞學(xué)切片和胚胎發(fā)育觀察等方法，更加簡(jiǎn)便、快捷，且成本低廉，是研究魚(yú)類(lèi)雌雄核發(fā)育細(xì)胞學(xué)機(jī)制的一種快速而行之有效的方法，因此可以說(shuō)它具備了多種優(yōu)點(diǎn)，特別適合于在本領(lǐng)域中推廣應(yīng)用，其市場(chǎng)前景和科研前景均十分廣闊。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1是本發(fā)明實(shí)施例DAPI染色的(2η早X 4n (6)泥鰍雄核發(fā)育早期胚胎發(fā)育(第二極體釋放、雄性原核及卵裂)觀察的圖片。
[0011]圖2是對(duì)照組(2n早X 4n (6)泥鰍早期胚胎發(fā)育(第二極體釋放、雌、雄性原核結(jié)合及卵裂)觀察的圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面將結(jié)合【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】本發(fā)明實(shí)施例的【具體實(shí)施方式】，如圖1、圖2所示:一種魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法，按如下步驟進(jìn)行:
在受精I(xiàn)Omin后開(kāi)始取卵，每10 min取10-20個(gè)受精卵，取樣到四細(xì)胞期為止，用多聚甲醛固定液將受精卵固定24 h，這里所使用的多聚甲醛固定液是將經(jīng)過(guò)PBS稀釋至2%的戊二醛和多聚甲醛，按照1:1的體積比混合后獲得的；
將固定后的受精卵從多聚甲醛固定液中取出，放入到PBS中浸泡，并在36h后更換一次PBS，于4°C冷藏，這里所使用的PBS為:100ml蒸餾水中含有NaCl 8g，Na2HPO412H20 3g，KCl 0.2g, KH2P04 0.2g。
[0013]將冷藏卵放入事先加入PBS的培養(yǎng)皿中，去除卵膜和植物極，并將動(dòng)物極放入裝有PBS的離心管中，并對(duì)離心管做避光處理；
將離心管中的PBS吸出，向離心管中加入Tween20和5 μ g/ml的DAPI染色液，且Tween20和DAPI染色液的體積比為1:100，將離心管放入搖床中進(jìn)行染色10_30min，即完成動(dòng)物極的染色，這里所使用的DAPI為DAPI母液和緩沖液按照體積比為1:5的比例混合而成，所述DAPI母液是將IOmgDAPI溶在1000ml的蒸餾水中所獲得的，所述緩沖液的組成為:100ml 蒸餾水中含有 0.12414gTris-HCl、0.37225g EDTA_2Na 及 0.5844g NaCl，配置完成后將緩沖液的酸堿度調(diào)節(jié)至pH=7.4。
【權(quán)利要求】
1.一種魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法，其特征在于:所述的方法按如下步驟進(jìn)行: a.受精I(xiàn)Omin后開(kāi)始取卵，每10min取10-20個(gè)受精卵，取樣到四細(xì)胞期，用多聚甲醛固定液固定24 h ； b.將固定后的受精卵換入到PBS中浸泡，并在36h后更換一次PBS，于4°C冷藏； c.取冷藏卵放入事先加入PBS的培養(yǎng)皿中，去除卵膜和植物極，并將動(dòng)物極放入裝有PBS的離心管中，避光； d.吸出離心管中的PBS，向離心管中加入Tween20和5μ g/ml的DAPI染色液，且Tween20和DAPI染色液的體積比為1: 100，將離心管放入搖床中進(jìn)行染色10_30min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法，其特征在于:所述的PBS 為:100ml 蒸餾水中含有 NaCl 8g，Na2HPO412H20 3g, KCl 0.2g, KH2P04 0.2g。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法，其特征在于:所述的多聚甲醛固定液是將利用PBS稀釋至2%的戊二醛和多聚甲醛按照1:1的體積比混合后獲得的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的魚(yú)類(lèi)初期胚胎發(fā)育的DAPI染色方法，其特征在于:所述的DAPI染色劑為DAPI母液和緩沖液按照體積比為1:5的比例混合獲得，所述DAPI母液是將IOmgDAPI溶在IOOOml的蒸餾水中得到的，所述緩沖液為:100ml蒸餾水中含有0.12414gTris-HCl、0.37225g EDTA_2Na 及 0.5844g NaCl，且緩沖液的 ρΗ=7.4。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK103674662SQ201310592620
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】李雅娟, 周賀, 王玉生, 劉博 , 高養(yǎng)春 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué), 李雅娟