專利名稱：microRNA 302在早期胚胎發(fā)育中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜牧學(xué)(動物繁殖)，尤其涉及一種microRNA 302在早期胚胎發(fā)育中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在哺乳動物胚胎發(fā)育過程約有30% 70%的胚胎夭折，絕大部分在胚胎發(fā)育的早期。特別是在體外培養(yǎng)時，早期胚胎凋亡指數(shù)更高。近年來，由于早期胚胎作為細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和分化模型的重要性有所增加，以及發(fā)育生物學(xué)技術(shù)的日新月異，早期胚胎階段日益受到重視，研究早期胚胎基因表達(dá)及調(diào)控，具有重要的理論和實踐意義。microRNA是一類內(nèi)生的、長度約20- 個核苷酸的小RNA，miRNA基因通常是在核內(nèi)由RNA聚合酶II (polll)轉(zhuǎn)錄的，最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre_miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個核苷酸組成的pre-miRNA。RAN-GTP和exportin 5將pre-miRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，另一個核酸酶Dicer將其剪切產(chǎn)生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA* 雙鏈。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進(jìn)入沉默復(fù)合體(RISC)復(fù)合體中，其中一條成熟的單鏈miRNA 保留在這一復(fù)合體中。成熟的miRNA結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點通過堿基配對調(diào)控基因表達(dá)。而miRNA是近年來才發(fā)現(xiàn)的一類小分子RNA，它們構(gòu)成了多細(xì)胞生物中一類更為豐富的基因調(diào)控分子，影響許多編碼蛋白的基因的表達(dá)，與細(xì)胞的生長和分化，胚胎的發(fā)育，腫瘤的形成和抑制都有密切的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供物質(zhì)在制備具有抑制胚胎發(fā)育功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了如下1)-3)中任一所述物質(zhì)在制備具有抑制胚胎發(fā)育功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA 302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA 302的編碼基因的重組病毒。所述microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。所述抑制胚胎發(fā)育為滯后早期胚胎發(fā)育，所述早期胚胎發(fā)育為從受精卵發(fā)育開始至囊胚形成。所述胚胎為小鼠胚胎；所述產(chǎn)品為藥物。所述含有microRNA 302的編碼基因的重組載體為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體得到表達(dá)microRNA 302的重組載體，具體為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體的BglII和HindIII酶切位點間得到的含有microRNA 302的編碼基因的重組載體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組載體。本發(fā)明提供的重組載體，為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體的 BglII和HindIII酶切位點間得到的載體。所述的重組載體在制備用于篩選促進(jìn)胚胎發(fā)育功能藥物的模型中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制胚胎發(fā)育功能的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為如下1)-3)中任一一種DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA 302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA 302的編碼基因的重組病毒。所述microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。所述抑制胚胎發(fā)育為滯后早期胚胎發(fā)育；所述早期胚胎發(fā)育為從受精卵發(fā)育開始至囊胚形成。所述產(chǎn)品為藥物。所述胚胎為小鼠胚胎。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明初步闡明早期胚胎發(fā)育的生理機(jī)制，在原核期胚胎中顯微注射microRNA 302超表達(dá)載體片段，可以觀察到microRNA 302使早期胚胎發(fā)育滯后。 本發(fā)明的優(yōu)點為新穎、準(zhǔn)確。


圖1為microRNA 302對胚胎發(fā)育的影響
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、microRNA 302抑制早期胚胎發(fā)育1、microRNA 302超表達(dá)載體的構(gòu)建DmicroRNA 302的獲得提取野生型小鼠(FVB/N小鼠，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)鼠尾基因組DNA作為模板，以miRNA302F和miRNA302R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物如下miRNA302F AGCCATAGGGATCCGGTCACTTTACTTTCCTGTGGGmiRNA302R GGCTTCGCAAGCTTGCGAGGAGGTTATACCATTGAG得到719bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序，結(jié)果為序列表中的序列2，其中自5’末端第 251-273位microRNA 302的編碼基因，microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1。
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2)將步驟1)得到的PCR產(chǎn)物連接到TOPO載體上(pcDNA 3. l/V5_His TOPO TAExpression Vector, hvitrogen，貨號45-0005)，得到重組載體T0P0-micro302，經(jīng)過測序，該重組載體為將序列表中的序列2插入載體上TOPO載體中得到的載體。3)將步驟2)得到的重組載體T0P0-micro302經(jīng)BamHI和HindIII酶切，回收酶切片段，與經(jīng)過同樣酶切得到的pmR-mCherry載體(Clontech，貨號632M2)連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子，菌落PCR鑒定陽性克隆，PCR引物為forward :5’ CAC CAT CGT GGA ACA GTA CG 3，；Reverse :5，GGG AGG TGT GGG AGGTTT T 3，，得到 867bp 的產(chǎn)物為陽性克隆，提取該陽性克隆的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列2 插入載體上pmR-mCherry的BglII (與BamHI為同尾酶)和HindIII酶切位點間得到的載體，命名為 pmR-mCherry-micro302o2、顯微注射導(dǎo)入攜帶microRNA 302的載體片段將pmR-mCherry-micro302被TfiI酶切(在載體上有多個酶切位點)，純化回收 3954bp的片段(帶有mCherry紅色熒光和microRNA 302片段序列2、，經(jīng)過測序，為序列 3。通過顯微注射將3%4bp的片段目的片段注射入離體的昆明白小鼠(購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心昆明白小鼠)的原核期胚胎中，在50ul的KSOM培養(yǎng)小滴中(Millipore，貨號MR_121_D)中，37°C，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每兩天換一次液，得到mir-302注射組胚胎。以pmR-mCherry空載體(其核苷酸序列為序列4)為對照，用Tf i I酶切，回收 3270bp的線性片段(序列4的自5，末端第1-3238和4698-47 位核苷酸，質(zhì)粒為環(huán)，因此是47 位和1位是連接的。)，采用通過顯微注射將3270bp的線性片段注射入昆明白小鼠的原核期胚胎中，同上培養(yǎng)條件，得到空載體注射組胚胎。3、胚胎發(fā)育情況監(jiān)測將上述mir-302注射組胚胎和空載體注射組胚胎從注射后開始培養(yǎng)算起，每M 小時觀察一次胚胎發(fā)育情況(有熒光表達(dá)為microRNA 302表達(dá)胚胎)，包括卵裂率，胚胎的形態(tài)(如2細(xì)胞，4細(xì)胞等)以及熒光表達(dá)情況。結(jié)果如圖1所示(第72小時的圖)，空載體注射組有熒光表達(dá)的胚胎已發(fā)育到4細(xì)胞階段(分裂出4個卵裂球)，但 mir-302注射組有熒光表達(dá)的胚胎只發(fā)育到2細(xì)胞階段(分裂出2個卵裂球)。將熒光場的不同時間的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)卵裂率(卵裂球數(shù)/總培養(yǎng)胚胎數(shù)(總培養(yǎng)胚胎數(shù)為注射后挑出要培養(yǎng)的存活胚胎數(shù)))統(tǒng)計，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值，如表1所示，表1為不同階段陽性胚胎發(fā)育狀況統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.如下1)-3)中任一所述物質(zhì)在制備具有抑制胚胎發(fā)育功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用 DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA302的編碼基因的重組病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于 所述抑制胚胎發(fā)育為滯后早期胚胎發(fā)育，所述早期胚胎發(fā)育為從受精卵發(fā)育開始至囊胚形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于 所述胚胎為小鼠胚胎；所述產(chǎn)品為藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述含有microRNA302的編碼基因的重組載體為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體得到表達(dá)microRNA 302的重組載體。
6.一種重組載體，為將microRNA 302的編碼基因插入pmR-mCherry載體的多克隆位點得到的載體。
7.權(quán)利要求6所述的重組載體在制備用于篩選促進(jìn)胚胎發(fā)育功能藥物的模型中的應(yīng)用。
8.一種抑制胚胎發(fā)育功能的產(chǎn)品，其活性成分為如下1)-3)中任一一種 DmicroRNA 302 ；2)含有microRNA302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA302的編碼基因的重組病毒。所述microRNA 302的核苷酸序列為序列表中的序列1 ；所述microRNA 302的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2自5’末端第 251-273 位。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于 所述抑制胚胎發(fā)育為滯后早期胚胎發(fā)育；所述早期胚胎發(fā)育為從受精卵發(fā)育開始至囊胚形成。 所述產(chǎn)品為藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的產(chǎn)品，其特征在于 所述胚胎為小鼠胚胎。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種microRNA 302在早期胚胎發(fā)育中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了如下1)-3)中任一所述物質(zhì)在制備具有抑制胚胎發(fā)育功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用1)microRNA 302；2)含有microRNA 302的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA 302的編碼基因的重組病毒。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明初步闡明早期胚胎發(fā)育的生理機(jī)制，在原核期胚胎中顯微注射microRNA 302超表達(dá)載體片段，可以觀察到microRNA 302使早期胚胎發(fā)育滯后。本發(fā)明的優(yōu)點為新穎、準(zhǔn)確。
文檔編號A01K67/027GK102266571SQ20111019414
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者劉笑然, 孫婧, 李冬冬, 李向東, 高建明 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)