山核桃葉總黃酮在tbbpa誘導(dǎo)心臟發(fā)育毒性的保護(hù)作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了環(huán)境污染物TBBPA所誘導(dǎo)毒害的研究和評價(jià)方法及一種中藥有效成分用于防護(hù)環(huán)境污染物TBBPA所致病害方面的新應(yīng)用，尤其涉及山核桃葉總黃酮在TBBPA所誘導(dǎo)毒害方面的保護(hù)作用。本發(fā)明深入解釋TBBPA暴露斑馬魚胚胎后所致毒害的毒性機(jī)制。顯示山核桃葉總黃酮對TBBPA誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的形態(tài)學(xué)保護(hù)，可對TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎體內(nèi)ROS水平升高，促凋亡基因的表達(dá)上調(diào)及凋亡抑制基因的表達(dá)下調(diào)分別具有一定的抗氧化和抑制凋亡作用。山核桃葉總黃酮對TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的保護(hù)作用，既有助于探討中藥有效成分的藥用價(jià)值和作用機(jī)理，也對日益引起重視的環(huán)境污染物危害防治提供了新路徑。
【專利說明】山核桃葉總黃酮在TBBPA誘導(dǎo)心臟發(fā)育毒性的保護(hù)作用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及中藥有效成分在環(huán)境污染物致病方面的新應(yīng)用，尤其是山核桃葉總黃酮在TBBPA誘導(dǎo)毒害方面的保護(hù)作用。
[0002]背景研究:
[0003]近年來，隨著合成材料工業(yè)的迅速發(fā)展，高分子材料廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、國防等領(lǐng)域，與人們的生活密切相關(guān)。高分子材料在給生活帶來便利的同時(shí)也帶來許多安全隱患，比如易燃性，這就迫使人們對各種合成材料提出了阻燃的要求。研究發(fā)現(xiàn)，通過添加阻燃劑或者通過化學(xué)反應(yīng)在高分子材料中引入阻燃基團(tuán)，能有效提高材料的抗燃性。溴代阻燃劑(BFRs)是合成高分子材料的重要助劑之一，其功能是使合成材料具有難燃性、自熄性和消煙性，其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用始于60年代的美國，此后阻燃劑的用量隨著社會的現(xiàn)代化發(fā)展而持續(xù)增長。
[0004]四溴雙酚A (Tetrabromo-bisphenol A, TBBPA)是目前全球生產(chǎn)量和使用量最大的溴代阻燃劑(BRFs)之一，被廣泛應(yīng)用于印刷線路板、丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物(ABS)、耐沖擊性聚苯乙烯(HIPS)等多種材料的合成中，以提高阻燃性。全球TBBPA年產(chǎn)量已超過170000噸，其中76%在亞洲，我國年產(chǎn)量約為18000噸，約為全球的1/10左右，近些年，它在各種環(huán)境介質(zhì)如沉積物、土壤、水體、大氣及生物體中被檢測到，德國河流水體TBBPA濃度范圍為0.2-20.4ng/L。湖泊是陸源TBBPA等有機(jī)污染物重要的富集庫，我國巢湖、青島和珠江三角洲近岸海域的水體、沉積物和魚體中也均已檢出TBBPA的存在。TBBPA在魚類體內(nèi)檢出含量可高達(dá)245ng/g，巢湖沉積物和水體中濃度為分別為21.96-481.80 μ g/kg和0-4.77 μ g/L,為全球已有報(bào)道的最高值；最新數(shù)據(jù)顯示，Hongfeng等檢測到珠江三角洲表層沉積物中TBBPA含量為干重0.03-31.6ng/g,且結(jié)合在沉積物中的TBBPA含量有上升趨勢 。
[0005]就生態(tài)毒理效應(yīng)而言，TBBPA對哺乳動(dòng)物的免疫毒性、細(xì)胞和神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等研究方面已取得一定進(jìn)展，但對水生生物毒理學(xué)的研究開展較少。TBBPA對魚類具有強(qiáng)毒性，同時(shí)具有高親脂性、良好熱穩(wěn)定性及一定溶解性，使其容易通過水環(huán)境介質(zhì)沿食物鏈累積并向上傳遞，最終對魚類及人體具有潛在毒害威脅，考慮到我國水體TBBPA環(huán)境暴露水平較高的特點(diǎn)，魚類毒理學(xué)的研究日益成為關(guān)注的重點(diǎn)。然而，TBBPA對魚類的毒性仍然數(shù)據(jù)不足，這也正是歐盟未能同時(shí)提供TBBPA生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估報(bào)告的重要原因。因此當(dāng)前迫切需要加強(qiáng)TBBPA對魚類等水生動(dòng)物的毒理學(xué)研究，以對其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)做出準(zhǔn)確和全面的評估。
[0006]斑馬魚(Danio rerio)是常見的暖水性(21_32°C )觀賞魚，鯉科，由于其常年產(chǎn)卵，魚卵易收集，而且小規(guī)模飼養(yǎng)技術(shù)簡單，20世紀(jì)90年代初開始，被用于有機(jī)污染物急、慢性毒性的檢測。斑馬魚胚胎發(fā)育技術(shù)具有材料方便易得、操作簡單、可重復(fù)性及可靠性較高等優(yōu)點(diǎn)，而且與傳統(tǒng)的魚類急性毒性實(shí)驗(yàn)相比，成本低、影響因素少、靈敏度更高、毒性終點(diǎn)觀察項(xiàng)多，并且各個(gè)發(fā)育階段可直接在顯微鏡下觀察。近幾年，TBBPA對斑馬魚的毒性作用研究逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，相關(guān)毒性機(jī)理方面的研究也同時(shí)開展，國內(nèi)有關(guān)TBBPA對斑馬魚甲狀腺分泌干擾作用，及國外有關(guān)TBBPA對斑馬魚胚胎發(fā)育性別失調(diào)，神經(jīng)毒性分泌等方向弓丨起極大關(guān)注。然而至今，分子和基因水平的毒性機(jī)理研究較少。
[0007]山核桃(Cathay hickory cathaensis sarg)又名“小核桃”,是一種落葉喬木，是我國特有的名優(yōu)干果和木本油料作物，約有20個(gè)種，是國家3級保護(hù)的瀕危植物。研究表明，多食干果可以預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。目前國內(nèi)對山核桃的植物形態(tài)分類、栽培、山核桃仁營養(yǎng)價(jià)值等的研究較多，但對山核桃的副產(chǎn)品如果殼、葉、外皮等研究報(bào)道較少，而到山核桃果仁、外果皮及山核桃葉均具有不同的藥用價(jià)值。山核桃果仁中富含不飽和脂肪酸和高級醇，具有潤膚、降低膽固醇和疏通血管等作用。作為一種健腦益腎的優(yōu)質(zhì)保健食品，山核桃果仁還具有滋潤、補(bǔ)氣、養(yǎng)血、化痰止咳的功效，其果皮具有抑菌、抗癌等功效。在山核桃葉的藥用功效研究中發(fā)現(xiàn)，核桃葉中含有大量的黃酮類化合物、萜類化合物及胡蘿卜素等，其中山核桃葉總黃酮是將山核桃葉進(jìn)行初步提取分離得到的多種黃酮類物質(zhì)，山核桃葉總黃酮類化合物的抗氧化作用的研究較多。其中分離所得2’，6’ - 二羥基-4’ -甲氧基查耳酮可抑制平滑肌細(xì)胞增殖及遷移引起的血管管腔狹窄，減輕血管炎癥反應(yīng)，對動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等心血管疾病的發(fā)生具有防治作用。目前關(guān)于山核桃葉的活性成分以及其藥理作用報(bào)道仍很少，有待于進(jìn)一步研究。
[0008]目前極少有關(guān)于中藥有效成分對環(huán)境污染物毒性效應(yīng)的保護(hù)作用研究。本發(fā)明人深入研究了山核桃葉總黃酮對TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎體內(nèi)ROS水平升高，促凋亡基因的表達(dá)上調(diào)及凋亡抑制基因的表達(dá)下調(diào)的保護(hù)作用，一方面有助于探討中藥有效成分的藥用價(jià)值和作用機(jī)理，另一方面也對日益引起重視的環(huán)境污染物危害防治提供新的路徑。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009]本發(fā)明的目的在于提供山核桃葉總黃酮的一種新用途，具體即山核桃葉總黃酮在環(huán)境污染物TBBPA誘導(dǎo)毒害方面的保護(hù)作用。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，山核桃葉總黃酮表現(xiàn)出對TBBPA誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的形態(tài)學(xué)保護(hù)，其中山核桃葉總黃酮對TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎體內(nèi)ROS水平升高，促凋亡基因的表達(dá)上調(diào)及凋亡抑制基因的表達(dá)下調(diào)分別具有一定的抗氧化和抑制凋亡作用。`
[0010]在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種山核桃葉總黃酮在制備防治環(huán)境污染物所致水生生物病害方面的藥物應(yīng)用。
[0011]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中,其中所述水生生物為斑馬魚。
[0012]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述山核桃葉總黃酮的使用濃度為1.0mg/L。
[0013]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述山核桃葉總黃酮具有降低TBBPA所致胚胎發(fā)育形態(tài)異常的作用。
[0014]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述山核桃葉總黃酮具有抑制TBBPA所致胚胎ROS活性升高的作用。
[0015]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述山核桃葉總黃酮對TBBPA誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育過程中P53基因表達(dá)上調(diào)和Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)具有明顯的抑制作用。
[0016]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種山核桃葉總黃酮在制備降低TBBPA所致水生生物胚胎發(fā)育形態(tài)異常的藥物應(yīng)用。
[0017]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中,其中所述水生生物為斑馬魚。[0018]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述山核桃葉總黃酮的使用濃度為1.0mg/L。
[0019]在本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種山核桃葉總黃酮抑制TBBPA所致胚胎ROS活性升高的藥物應(yīng)用。
[0020]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述水生生物為斑馬魚。
[0021]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述山核桃葉總黃酮的使用濃度為1.0mg/L。
[0022]在本發(fā)明的再又一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種山核桃葉總黃酮抑制TBBPA誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育過程中P53表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)的藥物應(yīng)用。
[0023]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述水生生物為斑馬魚。
[0024]在如上所述的本發(fā)明的應(yīng)用中，其中所述山核桃葉總黃酮的使用濃度為1.0mg/L。
[0025]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0026]第一，本發(fā)明通過對不同濃度的TBBPA暴露斑馬魚胚胎后的形態(tài)學(xué)指標(biāo)測試，毒性靶器官探尋，凋亡及凋亡機(jī)制的初步探討，嘗試從個(gè)體、器官、酶學(xué)及分子水平層層深入解釋其毒性機(jī)制，特別是對相關(guān)基因異常表達(dá)的檢測，將有利于系統(tǒng)闡釋毒性機(jī)制，甚至預(yù)測污染物潛在的毒性效應(yīng)。更為重要的是，分子水平的生化指標(biāo)能夠標(biāo)識低水平接觸環(huán)境毒物后的生物效應(yīng)，敏銳反映正常和應(yīng)激狀態(tài)下的變化，還將有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，建立起更加靈敏高效的安全性評價(jià)方法。
[0027]第二，本發(fā)明有關(guān)山核桃葉總黃酮對TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎體內(nèi)ROS水平升高，促凋亡基因的表達(dá)上調(diào)及凋亡抑制基因的表達(dá)下調(diào)的保護(hù)作用的研究，一方面有助于探討中藥有效成分的藥用價(jià)值和作用機(jī)理，另一方面也對日益引起重視的環(huán)境污染物危害防治提供新的路徑。
[0028]第三，本發(fā)明顯示，山核桃葉總黃酮對TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎體內(nèi)ROS水平升高、促凋亡基因的表達(dá)上調(diào)及凋亡抑制基因的表達(dá)下調(diào)分別具有一定的抗氧化和抑制凋亡作用。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0029]圖1斑馬魚胚胎暴露于不同濃度TBBPA后各形態(tài)學(xué)指標(biāo)觀測結(jié)果；各指標(biāo)與空白對照組比較，one-way ANOVA 分析，*ρ〈0.05;**ρ<0.01;***ρ<0.001 ；
[0030]圖2斑馬魚幼體暴露于TBBPA 96h后卵凝結(jié)、心包水腫、畸形及AO染色觀測結(jié)果；其中，A示24h發(fā)育正常受精卵；B示卵凝結(jié)導(dǎo)致死亡；C示48h正常卵；D示48h心包水腫；E示畸形；F-J示分別為空白對照及從低到高不同濃度TBBPA暴露96h后的AO染色結(jié)果；
[0031]圖3斑馬魚胚胎暴露于不同濃度TBBPA后瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA ladder凋亡結(jié)果;
[0032]圖4 ROS活性標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程；
[0033]圖5斑馬魚胚胎暴露于各濃度TBBPA 96h后所測ROS水平結(jié)果；各指標(biāo)與空白對照組比較，one-way ANOVA 分析，*ρ〈0.05;**ρ〈0.01 ；
[0034]圖6 PCR熔解曲線觀測；
[0035]圖7 TBBPA暴露96h后斑馬魚胚胎凋亡相關(guān)基因P53，Bax, Caspase9和Bcl-2的表達(dá)水平檢測結(jié)果；各指標(biāo)與空白對照組比較，one-way ANOVA分析，*ρ〈0.05;**ρ〈0.01;***ρ〈0.001 ；[0036]圖8 Caspase 9酶活性測定標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程；
[0037]圖9斑馬魚胚胎暴露于TBBPA 96h后Caspase酶活性水平測定結(jié)果；各指標(biāo)與空白對照組比較，one-way ANOVA分析，*p<0.05 ；
[0038]圖10山核桃葉總黃酮提取物的HPLC檢測結(jié)果；
[0039]圖11山核桃葉總黃酮保護(hù)作用下各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚胚胎的死亡率、畸形率和孵化率觀測結(jié)果；0ne-Way ANOVA分析，各指標(biāo)與空白對照組比較顯著性差異用星號表示，T+S組與T組結(jié)果比較顯著性差異用井號表示，*ρ〈0.05 ；**p<0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001 ；
[0040]圖12 ROS活性標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程；
[0041]圖13山核桃葉總黃酮保護(hù)作用下各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚胚胎ROS水平；one-way ANOVA分析，各組與空白對照組比較顯著性差異用星號表示，T+S組與T組結(jié)果比較顯著性差異用井號表示，*Ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001 ；
[0042]圖14山核桃葉總黃酮保護(hù)作用下各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚胚胎Ρ53表達(dá)水平結(jié)果；one-way ANOVA分析，各組與空白對照組比較顯著性差異用星號表示，T+S組與T組結(jié)果比較顯著性差異用井號表示，*Ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001 ；
[0043]圖15山核桃葉總黃酮保護(hù)作用下各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚胚胎Bcl-2表達(dá)水平結(jié)果；one-way ANOVA分析，各組與空白對照組比較顯著性差異用星號表示，T+S組與T組結(jié)果比較顯著性差異用井號表示，*Ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001 ；#ρ<0.05 ；##ρ<0.01 ；###ρ<0.001。
【具體實(shí)施方式】
[0044]為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面以非限制性的具體實(shí)施例的方式進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。但并非以此意圖限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。即本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
[0045]實(shí)施例1 TBBPA誘導(dǎo)斑馬魚胚胎心臟發(fā)育毒性及機(jī)理
[0046]—實(shí)驗(yàn)材料與方法
[0047](一)實(shí)驗(yàn)用品
[0048]斑馬魚(AB種)，中國環(huán)境科學(xué)研究院水生生物實(shí)驗(yàn)室；
[0049]四溴雙酚A (ΤΒΒΡΑ)，分析純，購自美國Alfa Aesar化學(xué)試劑公司(Β1138Α)；
[0050]吖啶橙(Α0)，購自上海綠葉生物科技有限公司(100910)；
[0051]PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit,購自美國 Omega Bio-tek 公司(D6210S)；
[0052]E.Z.N.A.?Total RNA Kitl，購自美國 Omega Bio-tek 公司(R6836-02)；
[0053]SYBR Green Supermix，購自美國 Bio-Rad 公司(170-8862)；
[0054]Tricaine (MMS),購自美國 Sigma-Aldrich 公司(D33601);
[0055]乙醇分析純，購自北京化工廠(20110810)；
[0056]魚活性氧簇(ROS) ELISA試劑盒，購自上?；鄯f生物科技有限公司(R2012223)；
[0057]凋亡DNA Ladder快速提取試劑盒，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司(ZP324)；[0058]DNA Ladder Marker,購自Takara寶生物工程有限公司；
[0059]PBS 緩沖液，購自北京 Neuronbc 公司(1115203)；
[0060]引物序列見下表:
[0061]表I引物序列
【權(quán)利要求】
1.山核桃葉總黃酮在制備防治環(huán)境污染物所致水生生物病害方面的藥物應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，其中所述環(huán)境污染物所致病害為四溴雙酚A(TBBPA)誘導(dǎo)的胚胎心臟發(fā)育毒害。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中所述水生生物為斑馬魚。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其中所述山核桃葉總黃酮的使用濃度為1.0mg/Lo
5.如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其中，所述山核桃葉總黃酮具有降低TBBPA所致胚胎發(fā)育形態(tài)異常的作用。
6.如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其中，所述山核桃葉總黃酮具有抑制TBBPA所致胚胎ROS活性升高的作用。
7.如權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其中，所述山核桃葉總黃酮對TBBPA誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育過程中P53表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)具有明顯的抑制作用。
8.山核桃葉總黃酮在制備一種降低TBBPA所致水生生物胚胎發(fā)育形態(tài)異常的藥物應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述水生生物為斑馬魚。
10.如權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其中所述山核桃葉總黃酮的使用濃度為1.0mg/L。
11.山核桃葉總黃酮在制備一種抑制TBBPA所致胚胎ROS活性升高的藥物應(yīng)用。
12.如權(quán)利要求11所述 的應(yīng)用,其中所述水生生物為斑馬魚。
13.如權(quán)利要求11或12所述的應(yīng)用，其中所述山核桃葉總黃酮的使用濃度為1.0mg/L0
14.山核桃葉總黃酮在制備一種抑制TBBPA誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎發(fā)育過程中P53表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)的藥物應(yīng)用。
15.如權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，其中所述水生生物為斑馬魚。
16.如權(quán)利要求14或15所述的應(yīng)用，其中所述山核桃葉總黃酮的使用濃度為1.0mg/
【文檔編號】A61K127/00GK103432194SQ201310410581
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】楊蘇文, 鄭丙輝, 丁志山 申請人:中國環(huán)境科學(xué)研究院, 浙江中醫(yī)藥大學(xué)