富氘透明質(zhì)酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明總體上涉及富氘透明質(zhì)酸d?HA、含有該富氘透明質(zhì)酸的組合物、使用該富氘透明質(zhì)酸的方法、以及用于制備該富氘透明質(zhì)酸的方法。
【專利說(shuō)明】
富m透明質(zhì)酸
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明總體上設(shè)及富気透明質(zhì)酸、含有該富気透明質(zhì)酸的組合物、使用該富気透 明質(zhì)酸的方法、W及用于制備該富気透明質(zhì)酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸(也稱為玻璃酸或玻尿酸或者縮寫為HA)是一種天然發(fā)生的陰離子型非 硫酸化糖胺聚糖，其重復(fù)二糖由e-(l，3)-D-葡糖醒酸下左側(cè)部分）（葡糖醒酸KGlcUA) 和e-(l，4)-N-乙酷基-D-葡糖胺下右側(cè)部分KN-乙酷基葡糖胺KGlcNAc)組成。
[0003]
[0004] HA可見于人類和動(dòng)物中的許多部位，運(yùn)些部位包括眼睛的玻璃體液、皮膚、幾乎所 有組織的細(xì)胞外基質(zhì)、W及關(guān)節(jié)(例如，膝關(guān)節(jié))的滑液。HA的存在在胚胎發(fā)育過程中對(duì)于合 適的器官發(fā)生和胎兒的無(wú)瘤痕愈合是至關(guān)重要的。天然發(fā)生的HA的分子量(MW)根據(jù)其位置 而顯著變化并且可W是從約0.200至IOMDa(百萬(wàn)道爾頓）。齡的半衰期也根據(jù)其位置而顯著 變化并且可W持續(xù)從滑液中的幾個(gè)小時(shí)至細(xì)胞外基質(zhì)中的幾周。
[000引 HA及其許多化學(xué)衍生物具有典型地依賴于HA的MW的多種商業(yè)用途。高麗HA(例 如，〉0.5MDa)用于白內(nèi)障手術(shù)后的傷口愈合(例如，經(jīng)由眼科注射），并且作為一種粘性補(bǔ)充 劑W提供緩沖和潤(rùn)滑，并且W減小膝關(guān)節(jié)或其他關(guān)節(jié)中的骨關(guān)節(jié)炎疼痛(例如，經(jīng)由關(guān)節(jié)內(nèi) 注射）dHA及其化學(xué)衍生物的其他用途包括一般傷口愈合、手術(shù)后的粘連預(yù)防、細(xì)胞工程、W 及在化妝品（例如，皮膚保濕劑）中。
[0006]雖然高M(jìn)W HA的粘滯彈性為關(guān)節(jié)提供潤(rùn)滑并且在手術(shù)過程中和手術(shù)之后保護(hù)敏感 組織，但當(dāng)HA在體內(nèi)降解(例如，酶或自由基降解)后運(yùn)些特性喪失。較低MW HA實(shí)際上可能 是炎性的或血管生成的，而不是抗炎性或抗血管生成的。高M(jìn)W和較低MW HA的降解由天然發(fā) 生的透明質(zhì)酸酶引起。此外，大量的降解還由氧化引起，最有可能通過可能作為炎性疾病的 一部分病理產(chǎn)生的徑基和多種活性氧(ROS)引起。運(yùn)已在例如G.高根(G.Kogan)、L.索提斯 (L. Soltes)、R.施特恩(R. Stern) W及R.Mendichi，"透明質(zhì)酸:一種具有通用型物理化學(xué)和 生物學(xué)特性的生物聚合物（Hyaluronic acid:a biopolymer with versatile physico-chemical and biological properties)"，在：聚合物研究手冊(cè)中：?jiǎn)误w、低聚物... (Handbook of Polymer Research : Monomers , Ol igomers . . . ) (R . A .佩瑟里克 (R.A.Pethrick)等人編著），第393-439 頁(yè)（2007)諾瓦科學(xué)出版社（Nova Science 化b Iishers))中綜述。
[0007]已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多解決方案來(lái)減緩HA的體內(nèi)降解并且修飾其化學(xué)、物理和生物學(xué)特 性。運(yùn)些解決方案典型地設(shè)及HA的化學(xué)修飾，包括例如通過化學(xué)或光化學(xué)手段進(jìn)行交聯(lián)。交 聯(lián)劑的實(shí)例包括硫醇（具有硫醇和親電試劑諸如丙締酸醋）、甲基丙締酸醋、酪胺、甲醒 (Hylan-A)、二乙締諷(Hylan-B)、雙碳化二亞胺(Monovisc)、W及肉桂酸二聚體(Gel-One)。 其他解決方案包括用大基團(tuán)（諸如多膚)修飾HA W誘導(dǎo)細(xì)胞粘附或自組裝成一種水凝膠。遺 憾的是，化學(xué)修飾經(jīng)常導(dǎo)致在未修飾HA中未觀察到的副作用和異物反應(yīng)，該未修飾HA具有 天然低免疫原性和低毒性。HA的化學(xué)和生物學(xué)、HA的醫(yī)療用途、W及在研究和醫(yī)療產(chǎn)品中所 采用的化學(xué)修飾范圍是最近評(píng)論的主題，包括：J. W.郭（J. W. Kuo)和G. D .普雷斯特維奇 (G.D.Prestwich),在生物學(xué)來(lái)源的材料-材料分析和植入物用途中的"第73章，透明質(zhì)酸" (('Chapter 73. Hyaluronic AcicTin Materials of Biological Origin-Materials Analysis and Implant Uses),綜合生物材料（Comprehensive Biomaterials)，第2卷（編 著P.達(dá)契尼(P. Ducheyne)、K.希利化.Healy)、D.哈特曼徹(D. Hutmacher)、J.柯克帕特里克 (J. Kirkpatrick))，愛思維爾化 Isevier)第 239-259 頁(yè)（2011)和J.博迪克（J. Burdick)、 G. D.普雷斯特維奇，"用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的透明質(zhì)酸水凝膠(HyaluroniC Acid Hy化Oge 1S for Biomedical Applications)"，先進(jìn)材料（Advanced Mate;rials)23，H41-冊(cè)6(2011)。 [000引鑒于其許多用途W(wǎng)及其對(duì)于降解的已知敏感性，需要一種改進(jìn)的HA和含HA組合 物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供新型富気HA(d-HA)和含有該富気HA的組合物。
[0010] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種制備d-HA的新型方法。
[0011] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供使用d-HA例如治療骨關(guān)節(jié)炎的新型方法。
[0012] 在W下詳細(xì)說(shuō)明中將變得明顯的運(yùn)些方面和其他方面已通過
【發(fā)明人】的W下發(fā)現(xiàn) 來(lái)實(shí)現(xiàn):HA可W用気富集并且穩(wěn)定。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖1:G、G巧日G6起始材料的HA4的質(zhì)譜。示出衍生自未富集葡萄糖(G)和富集葡萄糖 (G巧日G6)的HA4(4HA單糖單元）的分子量。
[0014]圖2:天然和[2H]葡萄糖HA的氧化攻擊。將根據(jù)本發(fā)明的富気HA的穩(wěn)定性與未富集 HA進(jìn)行比較。
[001引圖3:天然和[2H]葡萄糖HA的氧化攻擊。將根據(jù)本發(fā)明的富気HA的穩(wěn)定性與未富集 HA進(jìn)行比較。
[0016] 圖4:天然和[2H]葡萄糖HA的氧化攻擊。將根據(jù)本發(fā)明的富気HA的穩(wěn)定性與未富集 HA進(jìn)行比較。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 気(D或2H)是一種穩(wěn)定的非放射性氨同位素并且具有2.0144的原子量。氨作為一 種同位素iH(氨或気）、D( 2H或気）、W及!'(化或氣）的混合物而天然發(fā)生。気的天然豐度是 0.015%。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在具有H原子的所有化合物中，該H原子實(shí)際上代 表一種H和D的混合物，其中約0.015%是D。具有富集至大于其天然豐度0.015 %的一定水平 的気的化合物應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是非自然的，并且因此，比它們的非富集對(duì)應(yīng)物更加新穎。因此， 本發(fā)明設(shè)及一種富気化合物或其中其気水平大于天然發(fā)生的未富集化合物的化合物。
[0018] 對(duì)于存在的気的量給出的所有百分比均是摩爾百分比。
[0019] 當(dāng)一個(gè)變量未附帶一個(gè)定義時(shí)，則對(duì)照該變量之前的定義。
[0020] 通過活性氧衍生物進(jìn)行的解聚作用是發(fā)炎組織中的HA令人希望的粘滯彈性喪失 的主要原因。解聚作用還可W作為通過徑基和/或ROS衍生物進(jìn)行的鏈斷裂的結(jié)果而發(fā)生。 在不受任何具體機(jī)制束縛的情況下，解聚作用還可W包括歸因于二糖單元糖分子之一內(nèi)的 鍵裂的鏈斷裂，運(yùn)通常通過奪取碳附接的氨原子(例如，端基異構(gòu)氨和附接至多糖主鏈中的 碳的其他氨)來(lái)啟動(dòng)。
[0021] 與天然發(fā)生的HA或未富集HA相比，在此提供的富気HA(d-HA)具有增加的穩(wěn)定性 (例如，減小的解聚作用程度或減慢的解聚作用速率）。在不受具體理論限制的情況下，當(dāng)HA 的至少一些(并且可能全部)碳附接氨(例如，端基異構(gòu)氨和附接至多糖主鏈中的碳的其他 氨)被気替換時(shí)，最可能出現(xiàn)運(yùn)種增加的穩(wěn)定性。端基異構(gòu)位置是在縮酬或半縮酬連接鍵的 每個(gè)糖的還原端的那些位置，并且在不受任何具體機(jī)制束縛的情況下，當(dāng)在運(yùn)些位點(diǎn)處形 成自由基時(shí)最可能發(fā)生斷鏈。用気替換HA的碳附接氨(包括端基異構(gòu)氨和沿著多糖主鏈的 其他易于奪取的氨)提供在気化位點(diǎn)處更耐自由基形成的更強(qiáng)鍵，由此減少降解;因此d-HA 比未富集HA更耐降解(例如，通過自由基誘導(dǎo)的解聚作用）。
[0022] 本發(fā)明的更穩(wěn)定的HA不僅使得組合物具有更長(zhǎng)保存期限（例如，眼用配制品、骨關(guān) 節(jié)炎配制品、W及嬰兒乳配制品），還提供一種將使其體內(nèi)特性保持更久的HA。運(yùn)些更穩(wěn)定 的HA分子是有利的，因?yàn)樵摲€(wěn)定性不是通過化學(xué)交聯(lián)獲得的。因此，本發(fā)明的富気HA分子不 僅具有所希望的天然HA生物學(xué)特性，而且它們不存在由因交聯(lián)劑而產(chǎn)生的對(duì)非天然化學(xué)品 的過敏或異物反應(yīng)引起的脫祀炎性特性。
[0023] (A)在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種具有W下化學(xué)式的新型富気透明質(zhì)酸d-HA:
[0024]
[0025] 或其藥學(xué)上可接受的鹽；
[0026] 其中；
[0027] d-HA具有選自約15kDa (千道爾頓)至約1 OMDa (百萬(wàn)道爾頓)的分子量；
[0028] 每個(gè)非rD/ei胡蟲立地是氨或気;并且，
[0029] 每個(gè)RD和RM獨(dú)立地是氨或気，其條件是所存在的RE和RM基團(tuán)的總數(shù)的至少1 %是 D。
[0030] (Al)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種具有W下化學(xué)式的新型富気透明質(zhì)酸d-HAb:
[0031]
[0032] 或其藥學(xué)上可接受的鹽；
[0033] 其中；
[0034] d-HA具有選自約15kDa (千道爾頓)至約IOMDa (百萬(wàn)道爾頓)的分子量；
[00；3日]每個(gè)非rD/di胡蟲立地是氨或気;并且，
[0036] 每個(gè)RD和RM獨(dú)立地是氨或気，其條件是所存在的炒1基團(tuán)的總數(shù)的至少1%是D。
[0037] (A2)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種具有化學(xué)式d-HABi的新型富気透明質(zhì)酸d-HA:
[00；3 引
[0039] 或其藥學(xué)上可接受的鹽；
[0040] 其中：
[0041 ]每個(gè)非RDi胡蟲立地是氨或気;并且，
[0042] 每個(gè)RDi獨(dú)立地是氨或気，其條件是所存在的炒1基團(tuán)的總數(shù)的至少1%是D。
[0043] (B)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種具有化學(xué)式d-HAi的新型富気透明質(zhì)酸d-HA:
[0044]
[0045] 或其藥學(xué)上可接受的鹽；
[0046] 其中；
[0047] 每個(gè)非RDi胡蟲立地是氨或気;并且，
[004引每個(gè)RDi獨(dú)立地是氨或気，其條件是所存在的炒1基團(tuán)的總數(shù)的至少1%是D。
[0049] (C)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種具有化學(xué)式d-HA2的新型富気透明質(zhì)酸d- HA:
[(K)加]
[0051] 或其藥學(xué)上可接受的鹽；
[0052] 其中；
[0化3]每個(gè)非RD胡蟲立地是氨或気;并且，
[0054] 每個(gè)RD獨(dú)立地是氨或気，其條件是所存在的護(hù)基團(tuán)的總數(shù)的至少1%是D。
[0055] (D)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供條款(A)-(C)的d-HA，其中d-HA的分子量MW是選 自（a)約0.1 MDa至約5MDa、（b)約0.5MDa至約3MDa、（C)約IMDa至約2.5MDa、（d)約ISkDa至約 lOOkDa、^及（6)約 ISkDa 至約35kDa。
[0056] 化)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供條款(A)-(C)(無(wú)論何時(shí)提到"(A)-"，它都包括Al 至 A2)的 d-HA，其中 d-HA 的分子量是選自：約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、至約10041)曰， U 及約 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、 2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、 4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、日.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、 6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、 8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9牽 約IOMDa。
[0057] (F)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供條款(A)-巧)的d-HA，其中作為D存在于d-HA中的 RD和/或RDi基團(tuán)總數(shù)的％是選自（a)l%-50%、（b)5%-90%、（c)10%-90%、（d)20%-90%、 (6)30%-90%、（門40%-90%、（邑）50%-90%、化）10%-50%、^及（1)25%-50%。
[0058] (G)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供條款(A)-巧)的d-HA，其中作為D存在于d-HA中的 RD和/或RDi基團(tuán)總數(shù)的 ％是選自 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、 12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、 27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、 42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、 57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、 72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、 87%'88%'89%'90%'91%'92%'93%'94%'95%'96%'97%'98%'99%至 100%。
[0059] 化)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種新型藥用組合物，該藥物組合物包含:根據(jù) 本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G))和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0060] (I)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種用于治療患者的骨關(guān)節(jié)炎的新型組合物，該 新型組合物包含:治療有效量的本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G))和一種藥學(xué)上可接受的 賦形劑，其中該組合物適用于注射到患者的關(guān)節(jié)中。該關(guān)節(jié)是一種諸如膝、臀、肩、肘、腕、 踩、手指、或椎間關(guān)節(jié)等的關(guān)節(jié)。
[0061] (J)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種d-HA(例如，條款(A)-(G))的新型骨關(guān)節(jié)炎 組合物。該骨關(guān)節(jié)炎組合物被裝在一個(gè)預(yù)填充型無(wú)菌包裝注射器中，該注射器含有〇.5mL至 12mL在無(wú)菌憐酸鹽緩沖液(可替代地可W使用一種本領(lǐng)域中已知適用于關(guān)節(jié)內(nèi)注射的類似 無(wú)菌水溶液）中的d-HA。d-HA的濃度是從0.2 %W/V至5 %w/w。d-HA的大小是從約SOkDa至約 SMDa O
[0062] 化)在另一個(gè)方面中，d-HA的濃度是從l%w/w至3%w/wDd-HA的大小是從約250kDa 至約 2.5MDa。
[0063] (I)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種新型眼用組合物，該眼用組合物包含:本發(fā) 明的d-HA(例如，條款(A)-(G))和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中該組合物適用于應(yīng)用或 注射到患者的眼睛中。眼用組合物的一個(gè)方面是改善眼睛的環(huán)境或改善眼睛的感覺。眼用 組合物的另一個(gè)方面是延遲HA在眼睛中的解聚作用W保持眼睛的物理結(jié)構(gòu)和眼睛內(nèi)的生 理環(huán)境。眼用組合物的另一個(gè)方面是使d-HA充當(dāng)眼睛內(nèi)玻璃體液的補(bǔ)充或更換。眼用組合 物的又一個(gè)方面是在眼科手術(shù)過程中使用d-HA代替HA。又一個(gè)方面是通過玻璃體注射遞送 藥物。預(yù)期運(yùn)種注射類型將使患有年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的人受益。
[0064] (M)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種新型的人工淚液組合物，該組合物包含:根 據(jù)本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G))和一種適用于滴眼劑的賦形劑。此類賦形劑可W包括 水、鹽和緩沖液W及另外的潤(rùn)滑劑(例如，聚乙二醇400)、防腐劑(例如，亞氯酸鋼和過棚酸 鋼）、W及另外的酸和鹽(例如，棚酸、棚酸鋼、氯化巧、氯化儀、W及氯化鐘）。運(yùn)種類型的組 合物可W用于治療患者的干眼或其他來(lái)源的眼部刺激或角膜損傷的癥狀。
[0065] (N)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種新型d-HA眼用組合物。本發(fā)明（例如，條款 (A)-(G))的d-HA被配制成在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的無(wú)菌眼用溶液中的濃度從0.05%至1% w/w的滴眼劑。所存在的d-HA的量的附加實(shí)例包括從0.1 % w/w-0.5 % w/w W及從0.15 % w/w-0.25%w/w。
[0066] (0)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種新型乳組合物(例如，嬰兒配制品），該乳組 合物包含本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G)),其中d-HA的重量是從約ISkDa至約lOOkDa。
[0067] (P)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明被配制成一種新型局部抗皺和抗衰老保濕霜、軟膏、 凝膠、精華液、水凝膠貼劑、或脂質(zhì)體制品，它包含：根據(jù)本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G))、水W及化妝品可接受的賦形劑和活性物。如果使用一種d-HA鹽，那么該d-HA鹽可W是 一種化妝品可W接受的鹽。
[0068] (Q)用于本發(fā)明的組合物(例如，條款化)-(P))的賦形劑的實(shí)例是典型地用于未富 集(天然發(fā)生的)HA的那些賦形劑，并且包括水(例如，當(dāng)使用d-HA的鋼鹽或甲鹽時(shí)）、生理鹽 水、氯化鋼、巧樣酸、W及緩沖液(例如，憐酸鹽緩沖液，包括酸式憐酸鹽、二堿式憐酸鹽、二 堿式憐酸鹽十二水合物）。
[0069] (R)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的組合物(例如，條款化)-(Q))的pH是從6.0-8.0。該 pH的附加實(shí)例包括從6.8-7.8。另外的實(shí)例包括6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、 6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9至8。
[0070] (S)存在于本發(fā)明的組合物(例如，條款化)-(R))中的d-HA的重量將取決于其用途 (例如，骨關(guān)節(jié)炎或眼用的）。實(shí)例包括0.1至lOOmg。附加實(shí)例包括（a)0.1-10mg、（b)10-50111邑、^及(。）10-25111邑。另外的實(shí)例包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95至IOOmg。
[0071] (T)存在的d-HA的重量還可W存在的重量百分比表示。存在于本發(fā)明的組合物(例 如，條款化)-(R))中的d-HA的重量％的實(shí)例包括從0.1%-99%。附加實(shí)例包括(曰)0.1重 量％-5重量％、（b)0.1重量％-1重量％、W及(C)I重量％-50重量％。另外的實(shí)例包括0.1、 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90至95重量％。
[0072] (U)用于本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(T))的藥學(xué)上或化妝品可接受的鹽的實(shí)例 包括例如鋼鹽、鐘鹽、錠鹽、烷基錠鹽、巧鹽、裡鹽、儘鹽、儀鹽、鋒鹽、W及鉆鹽。
[0073] (V)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種新型預(yù)填充容器，該預(yù)填充容器包括本發(fā)明 的d-HA(例如，條款(A)-(G))或本發(fā)明的d-HA組合物(例如，條款化)-化)）。預(yù)填充容器的實(shí) 例包括注射器(例如，用于骨關(guān)節(jié)炎或眼科適應(yīng)癥）、滴眼劑瓶(例如，用于人工淚液）、W及 一種霜?jiǎng)┤萜鳌⒛z、水凝膠貼劑、或其他化妝品可用的容器或裝置(例如，用于一種化妝品 組合物）。注射器容積的實(shí)例包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、 25、30、35、40、45至501111^。注射器容積的實(shí)例還包括0.1、0.2、0.3、0.4.、0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9 至 ImL。滴眼劑瓶容積的實(shí)例包括 0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450 至500mL。滴眼劑瓶容積的實(shí)例還包括0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9至11111^。
[0074] (W)在另一個(gè)方面中，本發(fā)明可W包括一種用于將本發(fā)明的d-HA離子(例如，條款 (A)-(G))電滲遞送到皮膚內(nèi)的水凝膠貼劑、或一種具有用于將d-HA遞送到皮膚內(nèi)的皮膚穿 透膚的脂質(zhì)體配制品、或一種具有其他化妝品可接受的膚的組合物、或一種具有本領(lǐng)域已 知將HA遞送至真皮和表皮內(nèi)W減少老化或曬傷皮膚皺紋的深度和嚴(yán)重性的經(jīng)皮遞送促進(jìn) 劑。
[0075] (X)本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G))可W在用于治療患者的應(yīng)用中代替HA或交 聯(lián)HA，運(yùn)些應(yīng)用包括：（a)治療骨關(guān)節(jié)炎；（b)防止術(shù)后組織手術(shù)粘連；（C)人類和動(dòng)物(例如， 馬、犬和貓)兩者中的粘性補(bǔ)充劑；（d)有助于眼科手術(shù)，諸如白內(nèi)障摘除術(shù)、人工晶體植入 術(shù)、青光眼濾過術(shù)、角膜移植術(shù)、玻璃體切除術(shù)、W及視網(wǎng)膜脫離復(fù)位術(shù)；（e)用于體外組織 工程化或指導(dǎo)體內(nèi)組織再生或增加的支架；（f)用作醫(yī)療器械(例如，導(dǎo)管、導(dǎo)絲和支架）的 涂層；（g)促進(jìn)體外受精胚胎附接至子宮壁；化)誘導(dǎo)術(shù)后組織愈合；（i)誘導(dǎo)或加速傷口愈 合；（j)用作一種皮膚填充劑；化)用作一種控制釋放介質(zhì)（例如，用作一種基體或腸胃外膽 庫(kù)）；（1)用于眼用配制品的賦形劑；（m)眼用保濕劑或玻璃體液更換；（n)保護(hù)軟骨細(xì)胞使其 免受氧化損傷，其中運(yùn)些損傷由活性氧導(dǎo)致；（O)減緩、衰減、減輕和/或改善脊椎動(dòng)物患者 的骨礦質(zhì)密度損失；（O)減緩、衰減、減輕和/或改善脊椎動(dòng)物患者的骨寶形成；（g) -種局部 抗皺和抗衰老保濕霜、水凝膠貼劑、脂質(zhì)體或其他化妝品制品的一種組分；（q)在疾病治療、 特別是化療中作為一種藥物預(yù)敏化劑和化學(xué)敏化劑給藥；（r)調(diào)節(jié)具有設(shè)及血管通透性增 加的疾病或病癥的癥狀或診斷患有該疾病或病癥(例如，急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫 綜合征(ARDS)、動(dòng)脈粥樣硬化、黃斑變性、毛細(xì)血管滲漏綜合征、W及敗血癥）的患者的血管 通透性；（S)通過靜脈注射或瘤內(nèi)給藥來(lái)傳輸和遞送化療藥物，由此在減小不希望的副作用 的同時(shí)，增加細(xì)胞毒性藥物至腫瘤或轉(zhuǎn)移位點(diǎn)的遞送；（t)促進(jìn)傷口修復(fù)或防止鼓膜修復(fù)、 耳科手術(shù)、或鼻內(nèi)窺鏡手術(shù)中的粘連；（U)通過注入聲帶中來(lái)預(yù)防或修復(fù)聲帶損傷；（V)通過 注入尿道括約肌來(lái)提供一種用于尿失禁的膨脹劑；（W)用于藥物遞送至眼睛內(nèi)的媒介物； (X)用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD); W及(y)作為一種玻璃體補(bǔ)充和/或更換進(jìn)行玻璃 體內(nèi)注射。
[0076] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種治療骨關(guān)節(jié)炎的新型方法，該新型方法包括： 向有需要的患者給予治療有效量的本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G))或其藥學(xué)上可接受 的鹽。
[0077] 在另一個(gè)方面中，經(jīng)由關(guān)節(jié)內(nèi)注射給予該d-HA。
[007引在另一個(gè)方面中，將該d-HA給藥至患者的至少一個(gè)膝、臀、肩、肘、腕、踩、手指、或 椎間關(guān)節(jié)。
[0079] d-HA(單獨(dú))或在一種組合物中給藥的頻率將取決于其用途。在骨關(guān)節(jié)炎情況中， 限制治療次數(shù)是有益的。因此，在此情況中的給藥可W每周、每?jī)芍?、每月、每?jī)稍隆⒚考径取?每半年、或甚至每年給予一次。
[0080] 給藥途徑的實(shí)例包括:靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病灶內(nèi)、煩內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前 列腺內(nèi)、胸腔內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、銷內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部(topically)、瘤內(nèi)、肌 內(nèi)、眼內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、膀脫內(nèi)、粘膜、屯、包內(nèi)、廝內(nèi)、眼內(nèi)、口服、局部（topically)、局部 (locally)、通過吸入、通過注射、通過輸注、通過連續(xù)輸注、通過局部灌注、經(jīng)由導(dǎo)管、經(jīng)由 噴霧器、W及經(jīng)由灌洗。
[0081] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種減緩、衰減、減輕和/或改善脊椎動(dòng)物患者的骨 礦質(zhì)密度損失的新型方法，該新型方法包括：口服給予治療有效量的本發(fā)明的d-HA(例如， 條款(A)-(G))。
[0082] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種減緩、衰減、減輕和/或改善脊椎動(dòng)物患者的骨 寶形成的新型方法，該新型方法包括：給予治療有效量的本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(U))〇
[0083] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種治療癌癥的新型方法，該新型方法包括:在給予 至少一種癌癥化療劑之前，向有需要的患者靜脈內(nèi)給予治療有效量的本發(fā)明的d-HA(例如， 條款(A)-(G))。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G))作為一種夾帶和祀向 遞送媒介物W運(yùn)輸所述化療劑供患者瘤內(nèi)或靜脈內(nèi)注射之用。
[0084] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種用于調(diào)節(jié)具有設(shè)及血管通透性增加的疾病或病 癥的癥狀或診斷患有該疾病或病癥的患者的血管通透性的新型方法，該新型方法包括:給 予治療有效量的本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G))。
[0085] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種防止患者術(shù)后組織手術(shù)粘連的新型方法，該新 型方法包括：向設(shè)及手術(shù)的組織表面提供一種可水解涂層，該可水解涂層包含:本發(fā)明的d-HA(例如，條款(A)-(G))。該涂層可W是呈選自下組的形式，該組由W下各項(xiàng)組成:凝膠、膜、 泡沫、W及纖維。該涂層可W進(jìn)一步包含:一種藥理學(xué)活性劑。
[0086] 本發(fā)明還設(shè)及分離或純化的d-HA。該分離或純化的d-HA是気水平高于天然發(fā)生水 平的一組分子（即，一種分離的化合物）。該分離或純化的d-HA可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的技術(shù)獲得。
[0087] 分離意味著非天然發(fā)生的d-HA被純化(例如，從其中制備它的發(fā)酵反應(yīng)混合物中 純化）。相對(duì)于存在的非d-HA組分，該分離的d-HA(可W多于一種類型的化合物)的純度實(shí)例 包括至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% W 及 99.9%。
[0088] 本發(fā)明還設(shè)及d-HA組合物的混合物，運(yùn)意味著存在多于一種類型的d-HA。
[0089] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一定量的d-HA。該一定量的d-HA可W與其他組分和/ 或非富気HA分離，或可W存在此類其他組分。量的實(shí)例包括(a)至少0.01、0.02、0.03、0.04、 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5至1摩爾、化)至少0.1摩爾、^及((：)至少1摩爾的化合物。量的 實(shí)例還包括(a)至少一克d-HA; (b)至少一千克；W及（C)至少一公噸。本發(fā)明的量還涵蓋實(shí) 驗(yàn)室規(guī)模(例如，克規(guī)模）、千克實(shí)驗(yàn)室規(guī)模(例如，千克規(guī)模）、W及工業(yè)或商業(yè)規(guī)模(例如， 數(shù)千克或W上規(guī)模)數(shù)量，因?yàn)檫\(yùn)些量將更適用于實(shí)際生產(chǎn)用于患者的d-HA組合物。工業(yè)/ 商業(yè)規(guī)模是指將在為了現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試、配制、向公眾銷售/分銷等所設(shè)計(jì)的批次中生產(chǎn)的產(chǎn)品的 量。
[0090] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的組合物通常將包含至少6Xl〇i9個(gè)分子，并且可W例如 包含至少6 X 102<^個(gè)分子、6 X IO2I個(gè)分子、6 X IO22個(gè)分子、或6 X IO23個(gè)分子。
[0091] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的組合物包含至少0.1摩爾的至少一種d-HADd-HA的量的 其他實(shí)例包括至少0.2、0.5、1、2、3、4、5、10至20摩爾。
[0092] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明的組合物包含至少一毫克的至少一種d-HA。存在的d-HA 量的其他實(shí)例包括至少1、5、10、20、30、40、50、100、500至1,000克。
[0093] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在先前的每個(gè)方面中"包含"被"由……組成"代替。
[0094] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在先前的每個(gè)方面中"包含"被"基本上由……組成"代 替。
[0095] 本發(fā)明可W在不脫離其精神或?qū)嵸|(zhì)屬性的情況下W其他具體形式來(lái)實(shí)施。本發(fā)明 涵蓋在此指出的本發(fā)明的方面的所有組合。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的任何W及所有方面連同任 何其他一個(gè)方面或多個(gè)方面可W被拿來(lái)描述另外的方面。還應(yīng)當(dāng)理解，運(yùn)些方面的每個(gè)單 獨(dú)的要素旨在作為其本身獨(dú)立的方面而被單獨(dú)地拿出來(lái)。此外，一個(gè)方面的任何要素意味 著與來(lái)自于任何方面的任何W及所有其他要素相結(jié)合來(lái)描述另外的方面。
[0096] 定義
[0097] 運(yùn)里提供的所有實(shí)例不旨在為限制性的。
[009引使用的是指氨原子的屬，任何同位素組成的屬（即也皆或^任何比例的其任意 組合）。使用的"護(hù)或2H"特定地是指気同位素。除非另外說(shuō)明，否則在此描述的比例百分比 都是按重量計(jì)的％。天然豐度是約0.0156%;需要人工實(shí)現(xiàn)顯著較高的比例（例如，大于 1%)0
[0099] 除非另外指明，否則當(dāng)D被具體列舉在一個(gè)位置或示出在公式中時(shí)，此D表示一種 氨和気的混合物，其中気的量是約100% (例如，気的豐度是從90%至100%)。在某些方面 中，気的豐度是從97%至100%。在某些方面中，気的豐度是從35%至100%。通用術(shù)語(yǔ)"d-HA"描述一種具有高于天然豐度的水平的気的HA聚合物。
[0100] 化合物是指分子足W稱重、測(cè)試其結(jié)構(gòu)特性并且足W具有可驗(yàn)證用途的量(例如， 可W在一個(gè)測(cè)定中顯示具有活性的量，或可W應(yīng)用于人的化妝品情況中或動(dòng)物和人類患者 的治療情況中的量）。
[0101] 除非另外指明，否則d-HA的分子量是指重量平均分子量（即，MwKHA的分子量可W 通過使用多角度靜態(tài)光散射（MALS)檢測(cè)器（例如，Wyatt Technology ' S DAWN取HELEOS嚴(yán)II)結(jié)合尺寸排阻色譜柱來(lái)獲得?？商娲?，凝膠電泳(具有瓊脂糖 或聚丙締酷胺基質(zhì)），尤其使用校準(zhǔn)MALS標(biāo)準(zhǔn)的凝膠電泳，可W用于評(píng)估HA的Mw。
[0102] 患者是指人類或動(dòng)物(例如，犬、貓、馬、牛、羊、鳥、山羊、駱駝、關(guān)、W及外來(lái)種）。 [0103]"治療"（"treating"或"treatment)涵蓋治療患者的疾病狀態(tài)并且包括：（a)預(yù)防 患者發(fā)生疾病狀態(tài)，具體地是當(dāng)此患者易患該疾病狀態(tài)但是尚未診斷患有該疾病時(shí)；（b)抑 制該疾病狀態(tài)，例如阻礙它發(fā)展;和/或(C)緩解該疾病狀態(tài)，例如，引起疾病狀態(tài)的消退直 到達(dá)到所希望的終結(jié)點(diǎn)。治療還包括疾病癥狀的改善(例如，減輕疼痛或不適），其中此類改 善可W或可W不直接影響該疾病(例如，起因、傳染、表達(dá)等）。
[0104] 實(shí)例
[0105] W下合成富気d-HA的實(shí)例旨在說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。
[0106] 實(shí)例 1
[0107] 富気HA(例如，d-HA、d-HAe、d-HAei、d-HAi、W及d-HA2)可W由預(yù)先存在的気標(biāo)記的 葡糖醒酸和N-乙酷基葡糖胺結(jié)構(gòu)單元合成，或由在細(xì)菌或真菌發(fā)酵過程中被轉(zhuǎn)換為運(yùn)些結(jié) 構(gòu)單元的常見糖源合成。例如，HA合成酶根據(jù)W下方程由UDP-糖(尿巧二憐酸)體外合成HA:
[0108] nUDP-G 1 cUA+nUDP-G 1 cNAc 一化 UDP+ [ G1 cUA-G 1 cNAc ] n。
[0109] 對(duì)于在端基異構(gòu)或其他非端基異構(gòu)位置中標(biāo)記的d-HA，UDP-糖前體已經(jīng)具有由気 標(biāo)記的運(yùn)些位置。運(yùn)些標(biāo)記的UDP-糖結(jié)構(gòu)單元通過在發(fā)酵過程中將気-標(biāo)記的葡萄糖(或其 他碳源）生物合成轉(zhuǎn)化成UDP-N-乙酷基葡糖胺化DP-GIcNAc )和UDP-葡糖醒酸（UDP-Gl cUA) 來(lái)產(chǎn)生。
[0110] 對(duì)于用于生產(chǎn)HA( W及在気化原料諸如富気碳源諸如葡萄糖或薦糖時(shí)用于富気 HA，諸如d-HA、d-HAB、d-HABi、d-HA 1W及d-HA2)的不同發(fā)酵方法的綜述，參見Bo er i U，C. G.等 人，碳水化合物化學(xué)國(guó)際期刊（International Journal of Carbohy化ate化emishy) 2013，文章編號(hào)627967化ttp: dx. doi . O巧/10.1155/2013/624967)，該文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用 W其全文結(jié)合于此。
[0111] 實(shí)例2
[0112] 富気HA(例如，d-HA、d-HAB、d-HABi、d-HAi、W及d-HA2)可W經(jīng)由使用已知微生物菌 種的發(fā)酵過程形成，運(yùn)些微生物菌株包括源自天然分離株的那些菌株，包括C組鏈球菌(例 如，獸疫鏈球菌、馬鏈球菌、似馬鏈球菌、乳房鏈球菌等)或A組鏈球菌(化脈鏈球菌）、或多殺 性己氏桿菌(或相關(guān)禽桿菌屬類)或病毒感染小球藻W及其人工改造的衍生菌后代、或具有 外源宿主（諸如枯草芽抱桿菌、大腸桿菌、腸球菌、乳桿菌某種、或±壤桿菌某種 (Agwbacteri皿sp)、酵母、真菌或藻類）中的HA合成酶基因的重組變型。HA的來(lái)源不是本發(fā) 明的重要方面，重要的是HA鏈中的同位素気標(biāo)記。通過在気化原料(例如，気化葡萄糖或其 他碳源)存在下發(fā)酵，可W產(chǎn)生富気HA。能夠W商業(yè)上有用的量生產(chǎn)HA的其他真菌和細(xì)菌菌 株也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0113] 適合于HA發(fā)酵的枯草芽抱桿菌菌株可購(gòu)自美國(guó)諾維信生物醫(yī)藥公司(Novozymes Bio地arma US)(或DK A/S)。此類菌株的實(shí)例包括美國(guó)專利號(hào)7,811，806中描述的那些菌 株，該專利的內(nèi)容通過引用W其全文結(jié)合于此。例如，參見菌株THURB16URB 163、RB187、 RB197、W及RB200,所有運(yùn)些菌株均是使用薦糖發(fā)酵的。產(chǎn)生HA的馬鏈球菌菌株的選擇通過 金，J.-H.化等人，酶與微生物技術(shù)化nzyme and Microbial Technology)1996, 19,440-5進(jìn)行描述，該文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用W其全文結(jié)合于此。產(chǎn)生HA的重組大腸桿菌菌 株的使用通過余，H.(化，H.)等人，代謝工程學(xué)(Metabolic Engineering)2008,10,24-32進(jìn) 行描述，該文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用W其全文結(jié)合于此。產(chǎn)生齡的±壤桿菌(ATCC 31749)某種 的修飾通過毛,Z. (Mao,Z.)等人，生物技術(shù)進(jìn)展(Biotechnology P;rogress)2007,23,1038-42進(jìn)行描述，該文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用W其全文結(jié)合于此。
[0114] 使用気化碳源(諸如気化薦糖)將提供富気HA。気化薦糖的實(shí)例包括(e-D-[6,6'-2此峨喃果糖a-D-化喃葡萄糖巧）（[6,6'- 2此?S]薦糖)和(護(hù)D-[Uレ2出峨喃果糖a-D-[Uレ 2H7]化喃葡萄糖巧）（[Uレ 2Hl4]薦糖），運(yùn)兩者均可購(gòu)自?shī)W米龍生化有限公司（0micron Biochemicals Inc)。還可W使用気化葡萄糖作為碳源。實(shí)例包括可購(gòu)自西格馬阿德里奇公 司（Sigma-Al化ich)的D-葡萄糖-6,6-cb?？蒞使用其他気化葡萄糖，包括也可購(gòu)自西格馬 阿德里奇或Isotec公司的D-葡萄糖-1-diD-葡萄糖-1，2，3，4，5，6，6-d7或D-葡萄糖-di2。気 化果糖也可W用作碳源。
[0115] 最后，認(rèn)為將來(lái)自6-気化葡萄糖的気并入HA是經(jīng)由S碳片段(例如，気化甘油醒3-憐酸鹽和/或二徑丙酬憐酸)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該S碳片段在發(fā)酵過程中由D-葡萄糖產(chǎn)生。葡糖異 生也可W使用下酬二酸鹽(一種四碳片段)作為一種用于轉(zhuǎn)化成憐酸締醇丙酬酸的中間體。 因此，技術(shù)人員可W將気標(biāo)記的=碳片段或四碳片段或適合葡糖異生的其他気標(biāo)記的原料 引入發(fā)酵W產(chǎn)生制備d-HA所需要的気標(biāo)記的UDP-糖結(jié)構(gòu)單元。可W通過気交換，例如使甘 油醒3-憐酸鹽和/或二徑丙酬憐酸和/或下酬二酸鹽與化O中的化OD(可替代地化3N、或其他 合適的堿)接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)運(yùn)=種起始材料的気化。
[0116] 實(shí)例3:
[0117] 富気HA產(chǎn)生和穩(wěn)定性測(cè)試 [011引菌株和培養(yǎng)基
[0119] 菌株:多殺性己氏桿菌亞種，多殺性己氏桿菌（ATCC⑩#15742)
[0120] 板培養(yǎng)基：5%綿羊血瓊脂(Teknova B0142)
[0121] 液體培養(yǎng)基:杜伯克改進(jìn)的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(康寧#90-113-PB)，具有：
[0122] NaHCOs: 2.2g/L
[0123] 心谷氨酷胺:200mg/L
[0124] 在生長(zhǎng)時(shí)，添加W下各項(xiàng)：
[012 引 FeS04:5mg/L
[0126] 葡萄糖:2g/L
[0127] 使用W下葡萄糖：
[01%] D-葡萄糖(G)(Amresco#0188)(天然豐度對(duì)照;無(wú)額外的気）
[0129] D-葡萄糖-1-di(Gl)(奧德里奇#310816,98原子％D)(預(yù)期富気HA具有各自気化的 GlcUA和GlcNAc,每個(gè)重復(fù)單元有2個(gè)気）
[0130] D-葡萄糖-6,6-d2(G6)(奧德里奇#282650,98原子％0)(預(yù)期富気^具有二気化 GlcNAc，每個(gè)重復(fù)單元有2個(gè)気；由于6，6氨在葡萄糖生物合成轉(zhuǎn)化為葡萄糖醒酸過程中失 去，因此預(yù)期在GlcUA上沒有気）
[0131] D-葡萄糖-1，2,3,4,5,6,6-山(67)(奧德里奇#552003,97個(gè)原子％0)(預(yù)期齡二糖 具有屯気化G1 cNAc和四気化G1CUA-每個(gè)重復(fù)單元有10個(gè)気）
[0。。產(chǎn)HA細(xì)菌的生長(zhǎng)
[0133]將多殺性己氏桿菌P1059劃線到血瓊脂板上并且在37°C下解育過夜。用來(lái)自血瓊 脂板的若干菌落接種具有所有附加物和D-葡萄糖(G)的DMM小型起子培養(yǎng)物，并且在37°C 下振蕩解育約7小時(shí)。將運(yùn)些起子培養(yǎng)物用于Wl :500的接種比例接種含有DMEM液體培養(yǎng)基 的錐形瓶，每個(gè)錐形瓶具有無(wú)標(biāo)記或不同標(biāo)記的葡萄糖(G、G1、G6或G7)。培養(yǎng)物可W在37°C 下震蕩解育約16小時(shí)。
[0。4] HA 純化
[0135]通過離屯、去除微生物細(xì)胞（10,000Xg，30分鐘）。將乙醇(3x體積)添加到澄清上清 液中，從而導(dǎo)致HA聚合物沉淀。通過離屯、收獲HA聚合物。用70%乙醇洗涂所得的沉淀并且使 其干燥過夜。通過輕輕滿旋使沉淀在水中再懸浮。進(jìn)行水溶液的下醇萃?。?:1)，隨后進(jìn)行 氯仿萃?。?:1)。將具有HA聚合物的水部分在-20°C下儲(chǔ)存。可W采用任何其他HA多糖純化 方法，包括使用離子交換或切向流過濾步驟的那些方法，W及使用任何W上方法的重復(fù)或 序貫療法。
[0側(cè)通過瓊脂糖凝膠分析進(jìn)行HA大小分析
[0137] 使用長(zhǎng)度為IOcm的1 %瓊脂糖IX TAE緩沖凝膠和Select-HA曲HiLadder和 LoLadder大小標(biāo)準(zhǔn)化yalose公司）進(jìn)行所有瓊脂糖凝膠分析。將凝膠在40V下跑樣直到澄黃 G(西格瑪）染料前沿距離該凝膠端部大約1cm。為可視化HA，在黑暗中將凝膠浸泡在含有 50%乙醇中的0.005%全染色劑(Stains-AllK西格瑪）中（2-16小時(shí)），并且在黑暗中用水 脫色。HA聚合物菌株遇此染料變藍(lán)。
[0138] ^
[0。9]用于聚合物特性的鏈霉菌屬HA裂解酶消化試驗(yàn)
[0140] 使用睪丸透明質(zhì)酸酶進(jìn)行聚合物的消化(西格瑪緩沖液50mM乙酸錠，pH 5.5,37°C 過夜，將聚合物消化成4、6、8等個(gè)單糖單元=分別是HA4、HA6、HA8等）。通過3W)a MWCO超濾 器(Ami con)過濾反應(yīng)物，并且通過液相色譜法結(jié)合電噴射傅里葉變換質(zhì)譜法化C-FTMS)來(lái) 分析穿透流（見參考文獻(xiàn):L.李化丄i)等人，分析化學(xué)(Analytical Chemishy) ,84,8822-8829.2012)。
[0141] HA寡糖產(chǎn)生^及用于気結(jié)合水平的LC-FTMS
[0142] 使用睪丸透明質(zhì)酸酶進(jìn)行聚合物的消化（西格瑪緩沖液50mM乙酸錠，pH 5.5,37°C 過夜，將聚合物消化成4、6、8等個(gè)糖單元）。通過3W)a MWCO超濾器(Amicon)過濾反應(yīng)物，并 且通過LC-FTMS來(lái)分析穿透流（見參考文獻(xiàn)：L.李化.Li)等人，分析化學(xué)（Analytical Chemistry )，84，8822-8829.2012)。與天然豐度"護(hù)對(duì)照相比，對(duì)于、"G護(hù)、和補(bǔ)料 培養(yǎng)物觀察到歸因于気添加的預(yù)期附加質(zhì)量。
[0143] 基本上，使酶消化產(chǎn)物中的HA寡糖經(jīng)受LC分離，然后電噴射到FT質(zhì)譜儀中。作為一 個(gè)實(shí)例，在圖1中示出HA4峰的數(shù)據(jù)。不同的同位素分布取決于在微生物生長(zhǎng)步驟中采用的 碳源（即，天然、1-di、或6,6-cb葡萄糖）。觀察到-2離子(z = 2)(因此需要乘W2W得到該四糖 的實(shí)際質(zhì)量）。對(duì)于該四聚物(HA4)，如所預(yù)測(cè)的，觀察到Gl和G6兩者均增加4道爾頓。確切地 說(shuō)，天然HA"護(hù)具有776.236的質(zhì)量，而d-HA變型％r和"G護(hù)分別具有780.26巧日780.262的 較高質(zhì)量，運(yùn)證實(shí)合成了本發(fā)明的d-HA。類似地，由于其富集有気，因此觀察到的所有其他 較長(zhǎng)d-HA寡糖(HA6、HA8、HAl 0)均具有比天然HA寡糖對(duì)應(yīng)物更高的質(zhì)量。
[0144] 在下表中列出低聚物的保留時(shí)間(分鐘）。 rni 心。
[0146]基于在質(zhì)譜圖中觀察到的最豐富離子峰，將HA4和其他較長(zhǎng)低聚物的麗列出在下 表中。與天然豐度"護(hù)對(duì)照相比，對(duì)于"G1"、"G6"、和"G7"補(bǔ)料培養(yǎng)物觀察到歸因于気添加的 預(yù)期附加質(zhì)量。 「01471
[014引 HA聚合物的氧化攻擊
[0149]基本攻擊條件(最初取決于魏斯貝格爾(Weissberger)氧化系統(tǒng);神經(jīng)內(nèi)分泌通訊 (Neuro Endocrinol Lett)2012.33增刊3:151-4"通過魏斯貝格爾氧化系統(tǒng)誘導(dǎo)的高摩爾 質(zhì)量透明質(zhì)酸進(jìn)行自由基降解:布西拉明的潛在抗氧化作用（Free-radical degradation of high-molar-mass hyaluronan induced by Weissberger's oxidative system: potential antioxidative effect of bucillamine)"。己納索瓦M(jìn)(Banasova M)、薩辛科 娃八5曰3；[]14〇￥3 V)、Mendichi R、Perecko T、瓦拉霍娃K(Valachova K)、尤拉內(nèi)克I (Juranek I)、索提斯L，藥物與生物醫(yī)學(xué)分析雜志（J Pharm Biomed Anal. )2007.44(5): 1056-63"通過包含抗壞血酸鹽、化(II)和過氧化氨的氧化系統(tǒng)進(jìn)行高摩爾質(zhì)量透明質(zhì)酸的 降解：抗炎藥--糞普生和乙酷水楊酸的抑制作用（Degradation of high-molar-mass hyaluronan by an oxidative system comprising ascorbate,Cu(II),and hydrogen peroxide:inhibitory action of anti inflammatory drugs-naproxen and acetylsalic}dic acid)";索提斯L、Stankovsk自M、科根G化Ogan G)、Mendichi R、沃爾皮N (Volpi N)、薩辛科娃V、格邁納爾P(Gemeiner P))如下：
[0150] a.O.liiM CuCl2
[0151] b. IOOiiM抗壞血酸
[0152] c.25mM 出化
[0153] 所有儲(chǔ)備液均W0.15M NaCl制備。
[0154] 圖2示出使用該基本攻擊條件的過夜測(cè)試的結(jié)果。在此實(shí)例中，瓊脂糖凝膠電泳可 W根據(jù)大小分離HA;與進(jìn)一步遷移到凝膠中的較小聚合物（即，具有低分子量的鏈)相比，長(zhǎng) 聚合物（即，具有高分子量的鏈)在凝膠頂部跑樣。在微生物HA中觀察到條紋或條帶，因?yàn)榇?范圍的聚合物長(zhǎng)度存在于運(yùn)些樣品中并且該凝膠圖像示出所存在的全部聚合物物種的總 和。觀察到"護(hù)和"G6"HA的明確降解(對(duì)應(yīng)于凝膠上的著色聚合物的條紋僅示出在氧化攻擊 后剩余的低分子量HA)，但"G1"和"G7"經(jīng)得住該攻擊（條紋示出高分子量HA，類似于起始 "G1"和"G7"HA)。此發(fā)現(xiàn)最可能是因?yàn)檫\(yùn)些d-HA變型提高了運(yùn)些糖之間將聚合物連在一起 的鍵(稱為糖巧鍵)的穩(wěn)定性。經(jīng)由気富集改變?cè)谔?處的行為（如在"G1"和"G7")防止由攻 擊引起的破碎。在另一方面，d-HA的"G護(hù)變型在糖巧鍵處沒有気，因此不受保護(hù)。
[0155] 在圖2(和圖3-圖4)中使用W下縮寫：
[0156] L HA 梯標(biāo)準(zhǔn)；
[0157] G:葡萄糖(天然）；
[015引 Gx:在氧化攻擊后；
[0159] Gl:葡萄糖-1-di;
[0160] Glx:在氧化攻擊后的葡萄糖-1-di;
[0161] G6:葡萄糖-6,6-d2;
[0162] G6x:在氧化攻擊后的葡萄糖-6，6-cb;
[0163] G7:葡萄糖-1，2,3,4,5,6,6-山；W及
[0164] G7x:在氧化攻擊后的葡萄糖-1，2，3，4，5，6，6-山。
[0165] 圖3示出使用W下攻擊條件的過夜測(cè)試的結(jié)果：
[0166] a:0.1iiM CuCl2、100yM抗壞血酸、75mM 出〇2;
[0167] b:0.1 iiM CuCl2、IOOiiM抗壞血酸、250mM 出〇2;
[016引 C:化M CuCl2、化M抗壞血酸、250mM出02; W及
[0169] cUO.liiM CuCl2、100yM抗壞血酸、1.3mM 出〇2。
[0170] 當(dāng)"G"HA降解(低MW條紋)時(shí)，"Gl"和"G7"HA經(jīng)受住運(yùn)些攻擊條件(高M(jìn)W條紋）。
[0171] 圖4示出在0.5測(cè)化Cl2、500iiM抗壞血酸、125mM此化中的過夜攻擊測(cè)試的結(jié)果。當(dāng) "G" HA降解(低MW條紋)時(shí)，"Gr和"G7" HA再一次經(jīng)受住運(yùn)些攻擊條件(高M(jìn)W條紋）。
[0172] 實(shí)例4
[0173] 骨關(guān)節(jié)炎組合物：
[0174] 組合物A:含有0.5-12mL在無(wú)菌憐酸鹽緩沖液中的d-HA的預(yù)填充型無(wú)菌包裝注射 器。d-HA的濃度是從0.2%￥/^-5%￥八。(1-齡的大小是從約501^)3至約510曰。
[0175] 組合物B:含有0.5-12mL在無(wú)菌憐酸鹽緩沖液中的d-HA的預(yù)填充型無(wú)菌包裝注射 器。d-HA的濃度是從1%￥/^-3%￥/^。(1-齡的大小是從約2501^)3至約2.510曰。
[0176] 組合物C: W上A或B的組合物，其中該d-HA是一種化學(xué)交聯(lián)d-HA。
[0177] 組合物D: W上A或B或C的組合物，其中該d-HA與其他生物材料（例如，甲殼素、膠 原、聚乳酸、塑料、陶瓷、聚合物、和/或細(xì)胞)混合或組合。
[017引 實(shí)例5
[0179] 眼用組合物。
[0180] 組合物A:-種d-HA組合物被配制成在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的無(wú)菌眼用溶液中濃 度為0.05 %至1 % w/w的滴眼劑。
[0181] 組合物B:-種d-HA組合物被配制成在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的無(wú)菌眼用溶液中濃 度為0.1 %至0.5 % w/w的滴眼劑。
[0182] 組合物C: 一種d-HA組合物被配制成在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的無(wú)菌眼用溶液中濃 度為0.15 %至0.25 % w/w的滴眼劑。
[0183] 組合物D:-種d-HA組合物被配制用于在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的注射用無(wú)菌眼用 溶液中濃度為0.1 %至4 % w/w的玻璃體內(nèi)注射。
[0184] 實(shí)例6
[0185] 實(shí)例A-E是本發(fā)明的d-HA，其中運(yùn)些氨(示出或未示出）是未富集的氨（即，気的天 然豐度)并且示出的気D是約100%D。
[0186]
[0187]
[018引 實(shí)例7
[0189]實(shí)例F是本發(fā)明的d-HA，其中運(yùn)些氨(示出或未示出）是未富集的氨（即，気的天然 豐度)并且不出的沉D是約100 %Dd
[0190]
[0191] 根據(jù)W上傳授內(nèi)容，本發(fā)明的很多修改和變化都是可能的。因此，應(yīng)該理解在所附 權(quán)利要求范圍內(nèi)，本發(fā)明可W不同于在此特定說(shuō)明的方式來(lái)實(shí)踐。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有以下化學(xué)式的富氘透明質(zhì)酸d-HA: 或其一種藥學(xué)上可接受的鹽，其中：該d-HA具有選自約15kDa至約lOMDa的分子量； 每個(gè)非RD/D1H獨(dú)立地是氫或氘;并且， 每個(gè)R%PRD1獨(dú)立地是氫或氘，其條件是所存在的R%PRD1基團(tuán)的總數(shù)的至少1%是D。2. 如權(quán)利要求1所述的d-HA，其中該d-HA具有化學(xué)式d-HAi: 或其藥學(xué)上可接受其中： 每個(gè)非RD1H獨(dú)立地是氫或氘;并且， 每個(gè)RD1獨(dú)立地是氫或氘，其條件是所存在的該!^1的至少1%是D。3. 如權(quán)利要求1所述的d-HA，其中該d-HA具有化學(xué)式d-HAB1: 或其藥學(xué)上1 血_;其中： 每個(gè)非RD1H獨(dú)立地是氫或氘;并且， 每個(gè)RD1獨(dú)立地是氫或氘，其條件是所存在的該#1基團(tuán)的至少1 %是D。4. 如權(quán)利要求1所述的d-HA，其中該d-HA具有化學(xué)式F:或其藥學(xué)上可接受的鹽。5. 如權(quán)利要求1所述的d-HA，其中該d-HA具有化學(xué)式d-HA2: 或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中： 每個(gè)非RD Η獨(dú)立地是氫或氘;并且， 每個(gè)1^獨(dú)立地是氫或氘，其條件是所存在的該0基團(tuán)的至少1%是D。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的d-HA，其中該分子量是選自（a)約0. l-5MDa; (b)約 0.5-3MDa; (c)約l-2.5MDa; (d)約 15-100kDa;以及（e)約 15-35kDa。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的d-HA，其中所存在的R%P/SRD1基團(tuán)的總數(shù)的至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%是0。8. -種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的組合物，包含：治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng) 所述的d-HA和一種藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中該組合物適用于注射到患者的關(guān)節(jié)中。9. 如權(quán)利要求8所述的組合物，其中該關(guān)節(jié)是選自膝、臀、肩、腕、踝、肘、手指、以及椎間 夫。10. 如權(quán)利要求9所述的組合物，其中該關(guān)節(jié)是膝關(guān)節(jié)。11. 一種眼用組合物，包含:根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的d-HA和一種藥學(xué)上可接 受的賦形劑，其中該組合物適用于注射到患者的眼睛中。12. 如權(quán)利要求11所述的組合物，其中該組合物適用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性。13. 如權(quán)利要求11所述的組合物，其中該組合物適用于作為一種玻璃體補(bǔ)充和/或更換 進(jìn)行注射。14. 一種治療骨關(guān)節(jié)炎的方法，包括：向有需要的患者給予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求 1至7中任一項(xiàng)所述的d-HA。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中該d-HA是經(jīng)由關(guān)節(jié)內(nèi)注射給予至患者的膝關(guān)節(jié)。
【文檔編號(hào)】C08B37/08GK105873955SQ201480072146
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年11月25日
【發(fā)明人】格倫·普雷斯特維奇
【申請(qǐng)人】杜特里亞生物材料有限責(zé)任公司