作為選擇性彈性蛋白酶抑制劑的β-發(fā)夾肽模擬物的制作方法
【專利摘要】通式環(huán)(?Xaa1?Xaa2?Thr3?Xaa4?Ser5?Xaa6?Xaa7?Xaa8?Xaa9?Xaa10?Xaa11?Xaa12?Xaa13?)的β?發(fā)夾肽模擬物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Xaa1,Xaa2,Xaa4,Xaa6,Xaa7,Xaa8,Xaa9,Xaa10,Xaa11,Xaa12和Xaa13是在本說明書和權(quán)利要求書中定義的氨基酸殘基，其具有彈性蛋白酶抑制性質(zhì)，特別是針對(duì)人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的抑制性質(zhì)，并且可用于預(yù)防健康個(gè)體中的感染或與這樣的感染相關(guān)的疾病，或用于減緩受感染的患者中的感染。當(dāng)癌癥或免疫性疾病或肺部疾病或心血管疾病或神經(jīng)變性疾病或炎癥或炎癥相關(guān)疾病由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起時(shí)，可以進(jìn)一步使用本發(fā)明的化合物。這些肽模擬物可以通過基于混合固相和溶液相合成策略的方法制造。
【專利說明】作為選擇性彈性蛋白酶抑制劑的e-發(fā)夾化模擬物
[0001] 本發(fā)明提供了可用作蛋白酶的抑制劑的e-發(fā)夾膚模擬物，其包括在W02006/ 087001A1的一般公開內(nèi)容中但并沒有被W02006/087001A1具體公開。
[0002] 本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物是通式環(huán)（-Xaai-Xaa2-Ilir3-Xaa4-SerS-Xaa 6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaaiD-Xaaii-Xaai 2-Xaai3-)的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，其中Xaai, Xaa2, Xaa4, Xaa6，Xaa7，Xaa8，Xaa 9，Xaa"，Xaaii，Xaai哺Xaa"是在本說明書和權(quán)利要求書中定義的某些 類型的氨基酸殘基。
[0003] 運(yùn)些0-發(fā)夾膚模擬物可用作蛋白酶的抑制劑并且尤其有價(jià)值的是用作某些絲氨 酸蛋白酶例如彈性蛋白酶的抑制劑。
[0004] 此外，本發(fā)明提供一種高效方法，其中如果需要，可W通過所述方法W文庫(kù)形式產(chǎn) 生運(yùn)些化合物。
[0005] 本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物顯示針對(duì)人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的高抑制活性，而 具有針對(duì)蛋白酶3的低抑制活性和針對(duì)豬膜彈性蛋白酶(PPE)的出人意料的低抑制活性。運(yùn) 些有利的活性/選擇性特征譜取決于某些類型的Q-氨基酸殘基的適當(dāng)選擇和它們?cè)趩苇h(huán)膚 模擬物中的位置。
[0006] 蛋白酶的抑制劑正在顯現(xiàn)出在治療疾病中的有前景的治療用途，所述疾病為例如 癌癥（R.P.Beckett,A.Davidson,A.H.Drummond,M.Whitaker,Drug Disc.Today 1996,1, 16-26;L丄.Johnson,R.Dyer,D.J.Hupe, Qirr.Opin.Qiem.Biol.1998,2,466-71;D.Leung, G.Abbenante,and D.P.Fairlie,J.Med.Chem.2000,43,305-341,T.Rockway ,Expert Op in. Ther. Patent S 2003,13,773-786)，寄生物、真菌和病毒感染（例如血吸蟲病 (M.M.Becker,S.A.Harrop,J.P.DaIton,B.H.KaIinna,D.P.McManus,D.P.Brindley, J. Biol .Chem. 1995,270,24496-501);白色念珠菌（C.albicans)(C. Abad-Zapetero , R. Goldman ,S.W.Muchmore,C. Hutchins ,K. Stewart,J.Navaza,C.D. Payne ,T.L. Ray , Protein Sci.1996,5,640-52),HIV(A.Wlodawer,J.W.Erickson,Annu.Rev.Biochem.1993, 62,543-85 ; P丄.Darke，J.R. Huff，Adv.曲 armacol. 1994,5,399-454)，肝炎（J.L.Kim, K. A.Morgenstern,,C.Lin,T.Fox,M.D. Dwyer,J. A.Landro,S.P. Chambers ,W.Markland, C.A.Lepre,E.T.0'Malley,S.L.Harbeson,C.M.Rice,M.A.Murcko,P.R. Caron , J.A.Thomson,Cell,1996,87,343-55;R.A.Love'H.E.Parge,J.A.Wickersham, Z. Hostomsky,N.化b址a,E. W.Moomaw, T. Adachi ,Z. Hostomska,Cel 1,1996,87,331-:342)，瘤 疹(W.G 化son，M.R.化11，0^旨.063.013。〇￥.1997，15,39-47))，^及炎性、免疫性、呼吸性 (P.R.Bernstein,P.D.Edwards ,J.C.Wi IIiams, Prog.Med.Chem.1994,31,59-120； T. E. Hugli，Trends Biotechnol. 1996,14,409-12，）、屯、血管（M.T. St 加 bs，W. A. Bode, Thromb.Res.1993,69,1-58;H.Fukami et al,Current Pharmaceutical Design 1998,4, 439-453)和神經(jīng)變性缺陷，包括阿爾茨海默?。≧. Vassar，B. D. Bennett，S. Babu-Kahn， S . Kahn , E . A .Mendiaz ,Science,1999,286,735-41)、血管發(fā)生（M. Kaatinen et al, Atherosklerosis 1996,123 1-2,123-131 )和多發(fā)性硬化（M.Z.Ibrahim et al, J.化uroimmunol 1996,70,131-138)。
[0007] 在蛋白酶中，絲氨酸蛋白酶構(gòu)成重要的治療祀。絲氨酸蛋白酶通過其底物特異性， 特別是通過在Pl上發(fā)現(xiàn)的殘基類型，分類為膜蛋白酶樣（在Pl上優(yōu)選為帶正電荷的殘基 Lys/Arg)、彈性蛋白酶樣(在Pl上優(yōu)選為小的疏水性殘基Ala/Val)或糜蛋白酶樣(在Pl上優(yōu) 選為大的疏水性殘基Phe/Tyr/Leu)。其蛋白酶抑制劑X-射線晶體數(shù)據(jù)可獲得于PDB數(shù)據(jù)庫(kù) (PDB:WWW. rcsb. org/pdb)的絲氨酸蛋白酶包括膜蛋白酶，a-糜蛋白酶，丫-糜蛋白酶，人嗜 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，豬膜彈性蛋白酶，凝血酶，枯草桿菌蛋白酶，人巨細(xì)胞病毒蛋白酶， 無色桿菌蛋白酶1，人組織蛋白酶G，谷氨酸特異性酸蛋白酶，carhop邱tidase D，血液凝固 因子Vila,豬因子lXA，mesente;ricop邱tidase，HCV蛋白酶，和嗜熱蛋白酶。具有治療利益的 其它絲氨酸蛋白酶包括類膜蛋白酶，補(bǔ)體轉(zhuǎn)化酶，丙型肝炎-NS3蛋白酶。凝血酶（例如， J.L.Metha,L.Y.Chen,W.W.Nichols ,C.Mattsson,D.Gustaffson,T.G.P.Saldeen, J.Cardiovasc. Pharmacol.1998,31,345-51；C. Li la,P.Gloanec,L. Cadet,Y.Herve, J.Fournier,F丄eborgne,T.J.Verbeuren,G.DeNanteui I,Synth.Comm.1998,28,4419-29) 和因子Xa(例如，1口.￥日。。日，411皿.1?6口.]\16(1.〇16111.1998,33,81-90)的抑制劑在臨床評(píng)價(jià)中 作為抗血栓形成劑，彈性蛋白酶的抑制劑（J.R. Wi I Iiams，R.C. Fal cone, C. Knee, R.L.Stein,A.M.Strimpler,B.Reaves,R.E.Giles,R.D.Krell,Am.Rev.Respir.Dis.1991, 144,875-83)在臨床試驗(yàn)中用于肺氣腫和其它肺部疾病，而類膜蛋白酶抑制劑目前處于用 于哮喘的II期臨床試驗(yàn)(C. Seife，Science 1997，277，1602-3)，尿激酶抑制劑用于乳腺癌， W及糜蛋白酶抑制劑用于屯、臟相關(guān)疾病。最后，組織蛋白酶G、彈性蛋白酶和蛋白酶3密切參 與細(xì)胞因子及其受體的活性的調(diào)節(jié)。特別地，在炎癥位點(diǎn)上，高濃度的運(yùn)=種嗜中性粒細(xì)胞 絲氨酸蛋白酶(NSP) W與炎性細(xì)胞因子的水平升高緊密時(shí)間相關(guān)地從浸潤(rùn)多形核細(xì)胞中釋 放，強(qiáng)烈表明運(yùn)些蛋白酶參與細(xì)胞因子生物活性和可用性的控制（U. Bank，S. Ansorge， J丄e址OC.Biol. 2001,69,177-90)。因此彈性蛋白酶的高選擇性抑制劑構(gòu)成用于針對(duì)感染 性炎性疾病和非感染性過程中的新藥候選物的有價(jià)值的祀，所述感染性炎性疾病包括肺疾 病，如慢性阻塞性肺疾病，急性呼吸窘迫綜合征，囊性纖維化和缺血-再灌注損傷，W及所述 非感染性過程為例如腎小球腎炎，關(guān)節(jié)炎和大瘤性類天瘤瘡（H. Ohbayashi ,Eped Opin.Investig.Drugs 2002,11,965-980;B.Korkmaz,T.Moreau,F.Gauthier,Biochimie 2008,90,227)〇
[0008] 在許多已出現(xiàn)的蛋白質(zhì)性絲氨酸蛋白酶抑制劑中，一種是來自向日葵子的14個(gè)氨 基酸的環(huán)膚，被稱為向日葵膜蛋白酶抑制劑（SFTI-I) (S丄UCkett，R. Santiago Garcia, J.J.Barker,A.V.Konarev,P.R.Shewry,A.R.Clarke,R丄.Brady,J.MoI.Biol.1999,290, 525-533;Y.-Q. Long ,S.-L.Lee,C.-Y.Lin, I.J.Enyedy,S.Wang,P. Li ,R.B. Dickson , P.P.Roller，Biorg.&Med.化 em 丄 ett. 2001,11，2515-2519)，其與絲氨酸蛋白酶抑制劑的 Bowman-Birk家族的膜蛋白酶反應(yīng)性環(huán)具有序列和構(gòu)象相似性。該抑制劑在結(jié)合至牛0-膜 蛋白酶的活性位點(diǎn)時(shí)采用e-發(fā)夾構(gòu)象。SFTI-I抑制0-膜蛋白酶化i<0.1 nM)、組織蛋白酶G 化i心，15nM)、彈性蛋白酶化i~105山〇、糜蛋白酶化i~7.仙〇和凝血酶化i~136mM)。
[0009] 化合物環(huán)（-Xaai-XaaS-llirS-XaaLserS-XaaS-XaaLXaaS-XaaS-XaaW-Xaaii-XaaU-XaaU-)的(6-發(fā)夾構(gòu)象基于來自與位置12上的D-氨基酸殘基組合并且由分別地位置3和5上 的保守氨基酸殘基化r和Ser養(yǎng)育(foster)的天然存在的膚的0-發(fā)夾環(huán)。
[0010] 模板結(jié)合的發(fā)夾模擬膚已描述于文獻(xiàn)中（D. Obrecht, M. Altorfer, J.A. Robinson, Adv .Med. Chem. 1999，4，1-68; J. A. Robinson，Syn 丄ett. 2000，4，429-441)，并且絲氨酸蛋白 酶抑制性的模板固定的膚模擬物及其合成方法已描述于國(guó)際專利申請(qǐng)W02003/054000A1、 W02006/08700IAl和A.Descours,K.Moehle,A.Renard,J.A.Robinson,QiemBioQiem 2002, 3,318-323中，但先前公開的分子不顯示運(yùn)樣的有利活性/選擇性特征譜。
[001。 使用組合和平行合成法產(chǎn)生e-發(fā)夾膚模擬物的能力已被建立化.Jiang, K.Moehle,B.Dhanapal,D.Obrecht,J.A.Robinson,Helv. Qiim.Acta.2000,83,3097-3112)。 本文描述的方法允許合成和篩選大的發(fā)夾模擬文庫(kù)，其進(jìn)而顯著地促進(jìn)結(jié)構(gòu)-活性研究，并 因此促進(jìn)發(fā)現(xiàn)具有適合用于新藥的化合物性質(zhì)的新分子，其具有高度強(qiáng)力和選擇性的絲氨 酸蛋白酶抑制活性，特別是具有如本文中描述的運(yùn)樣的有利的活性/選擇性特征譜。
[0012] 本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物是通式(I)的化合物：
[0013] 環(huán)
[0014] (-Xaai-XaaS-T 虹 3-Xaa4-Ser5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaaiD-Xaaii-Xaai2-Xaai3-)
[0015] (I)，
[0016] 及其藥學(xué)上可接受的鹽，
[0017] 其中
[001 引 Xaai是OctGly;Arg;hArg;Qia;Glu(苯乙基）；或Dab(下酷基）；
[0019] Xaa2是Glu;化1; Leu; Nle;陸e; h陸e; DiHPhe; Tyr; hTyr;或化 P;
[0020] Xaa* 是 Ala; Al Iy IGly; Abu;或化 1;
[0021] XaaS 是 lie;或 OctGly;
[0022] Xaa^Pro;
[002；3] Xaa 墻化)；
[0024] Xaa? 是 Gln;或 Tyr;
[0025] XaaiD是Lys;或Asn;
[0026] Xaa"是IiLeu; Ser;hSer;hSer (Me); T虹；alIoT虹；Asn;Gln;hGln;Dap; Tyr;或HiS;
[0027] Xaa"是 Dpro^
[00 巧]Xaa"是 P;ro;Tic;Glu;Asp;Ala;化1;或Lys;
[00例條件是
[0030]如果 Xaai 是 OctGly,貝 Ij
[0031] Xaa 堪 Glu;或 Nle;
[0032] 乂日日4是41日；或41311;
[0033] XaaS 是 lie;或 OctGly;
[00；34] Xaa"是 Lys;
[00；35] Xaa"是 Ser; 1"虹；Asn;或 Gln;
[0036] Xaa"是 P;ro;Tic;Ala;化1;或Lys;
[0037] 和 / 或如果 XaaS 是 OctGly,貝 Ij
[0038] Xaai 是 OctGly; Arg;或 Qia;
[0039] Xaa2 是 Glu;或 Nle;
[0040] Xaa*是 Al a;或 Abu;
[0041] Xaa"是 Lys;
[0042] Xaa"是 Ser :1"虹；Asn; Gin;
[0043] Xaa"是P;ro;Tic;Ala;化I;或Lys;
[0044] 并且進(jìn)一步的條件是
[0045] 如果 Xaaii 是 Tyr;或 His,則
[0046] Xaai是Arg;hArg;或Glu(苯乙基）。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明，運(yùn)些0-發(fā)夾膚模擬物可W通過W下方法制備，所述方法包括
[0048] (a)將適當(dāng)官能化的固體支持物與在所需的終產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)于Xaan的適當(dāng)N-保護(hù)的 氨基酸衍生物偶聯(lián)，其中n是13、8、7、6、5或4，可W在所述N-保護(hù)的氨基酸衍生物中存在的 任何官能團(tuán)同樣適當(dāng)?shù)厥艿奖Ｗo(hù)；
[0049] (b)從如此獲得的產(chǎn)物移除N-保護(hù)基；
[0050] (C)將如此獲得的產(chǎn)物用處在所需終產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)于XaaD-I的適當(dāng)N保護(hù)的所述氨基 酸衍生物偶聯(lián)，可W在所述N-保護(hù)的氨基酸衍生物中存在的任何官能團(tuán)同樣適當(dāng)?shù)厥艿奖?護(hù)；
[0051] (d)從步驟(C)中獲得的產(chǎn)物移除N-保護(hù)基；
[0052] (e)使用在所需終產(chǎn)物中處于位置n-2至1位置內(nèi)的適當(dāng)N-保護(hù)的氨基酸衍生物實(shí) 施基本上與步驟(C)和(d)相對(duì)應(yīng)的步驟，可W在所述N-保護(hù)的氨基酸衍生物中存在的任何 官能團(tuán)同樣適當(dāng)?shù)厥艿奖Ｗo(hù)；
[0053] (f)如果n不是13,則使用在所需終產(chǎn)物中處于位置13至n+1位置內(nèi)的適當(dāng)N-保護(hù) 的氨基酸衍生物進(jìn)一步實(shí)施基本上與步驟山)和((1)相對(duì)應(yīng)的步驟，可W在所述N-保護(hù)的氨 基酸衍生物中存在的任何官能團(tuán)同樣適當(dāng)?shù)厥艿奖Ｗo(hù)；
[0054] (g)如果需要，在從步驟(e)或(f)中獲得的產(chǎn)物移除N-保護(hù)基之前，選擇性去保護(hù) 分子中存在的一個(gè)或幾個(gè)受到保護(hù)的官能團(tuán)，并將如此釋放的反應(yīng)基通過附接來源于酸、 氨基酸或胺的一個(gè)或多個(gè)部分和從如此獲得的產(chǎn)物移除N-保護(hù)基來適當(dāng)取代；
[0055] 化)從固體支持物脫離如此獲得的產(chǎn)物；
[0056] (i)環(huán)化從固體支持物切下的產(chǎn)物；
[0057] (j)移除在氨基酸殘基鏈的任何組件的官能團(tuán)上存在的任何保護(hù)基;并且
[0058] (k)如果需要，將如此獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成藥學(xué)上可接受的鹽或?qū)⑷绱双@得的藥學(xué) 上可接受的或藥學(xué)上不可接受的鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的游離化合物或轉(zhuǎn)化成不同的藥學(xué)上可接 受的鹽。
[0059] 此后提供了氨基酸的列表，所述氨基酸或其殘基適合用于本發(fā)明的目的，其中縮 寫對(duì)應(yīng)于通常采用的慣例：
[0060] =字母代碼 單字母代碼
[0061 ] Ala k丙氨酸 A
[0062] 化1 k鄉(xiāng)氨酸 V
[0063] Leu k亮氨酸 L
[0064] Phe 心苯丙氨酸 F
[00化]His k組氨酸 H
[0066] Tyr k酪氨酸 Y
[0067] T;rp k色氨酸 W
[006引 Lys k賴氨酸 K
[00例 Arg k精氨酸 R
[0070] Ser k絲氨酸 S
[0071] T虹 k蘇氨酸 T
[0072] Asp 心天冬氨酸 D
[0073] Asn 心天冬酷胺 N
[0074] Glu k谷氨酸 E
[0075] Gln 心谷氨酷胺 Q
[0076] Pro L-脯氨酸 P
[0077] AllylGly k締丙基甘氨酸
[007引 Abu L-日-氨基下酸
[00巧]OctGly k辛基甘氨酸
[0080] 化a k環(huán)己基丙氨酸
[0081 ] Nle 心正亮氨酸
[0082] hLeu 心高-亮氨酸
[0083] Whe k高-苯丙氨酸
[0084] DiHPhe k二高-苯丙氨酸，
[00化] (2S)-2-氨基-5-苯基戊酸
[0086] hTyr 心高-酪氨酸
[0087] Dap 心2,3-二氨基丙酸
[008引 Mrg 心高-精氨酸
[0089] hSer 心高-絲氨酸
[0090] hSer(Me) 心高-〇-甲基絲氨酸
[0091] allollir (2S，3S)-2-氨基-3-徑基-下酸
[0092] hGln k高-谷氨酷胺
[0093] Glu(苯乙基）（2S)-2-氨基-5-苯乙基氨基-5-氧代戊酸
[0094] 化b (下酷基）（2S) -2-氨基-4-下基氨基-下酸
[0095] Tic (3S)-1，2,3,4-四氨異哇嘟-3-簇酸
[0096] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，0-發(fā)夾膚模擬物是通式I的化合物及其藥學(xué)上可接 受的鹽，其中
[0097] Xaai是OctGly;Arg;hArg;或Glu(苯乙基）；
[009引 Xaa2 是 6111;饑6;叫>?；蚧?;
[0099] Xaa* 是 Ala;或 Al IylGly;
[0100] Xaa 墻 lie;
[0101] Xaa?是Pro;
[010。 Xa 媚化)；
[0103] Xaa? 是 Gln;或 Tyr;
[0104] Xaa"是 Lys;
[01 化]Xaa"是 IiLeu; Ser; T虹；Asn; Tyr; hGln;或 His;
[0106] Xaa"是 Dpro;和
[0107] Xaa。是 Pro;
[010引條件是
[0109] 如果 Xaai 是 OctGly,貝 Ij
[0110] Xaa2 是 Glu;或 Nle;
[0111] Xaa* 是 Ala;
[0112] XaaS 是 lie;
[011引 Xaa"是 Lys;
[0114] Xaa"是 Ser; 1"虹；或 Asn
[01 巧]Xaa。是 Pro;
[0116]并且進(jìn)一步的條件是 [0117]如果 Xaaii 是 Tyr;或 His,則
[0118] Xaai是Arg;hArg或Glu(苯乙基）。
[0119] 在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，e-發(fā)夾膚模擬物是通式I的化合物及其藥學(xué) 上可接受的鹽，其中
[0120] Xaai是OctGly;Arg;或Glu(苯乙基）；
[01別]乂日日2是6111;饑6;11171';或化1;
[0122] Xaa^^Ala；
[0123] XaaS 是 lie;
[0124] Xaa?是Pro;
[0125] Xaa?是Pro;
[0126] Xaa? 是 Gin;或 Tyr;
[0127] Xaai 日是 Lys;
[01 巧]Xaa"是 Ser; 1"虹；Asn; Tyr;或 Hi S;
[0129] Xaa"是 Dpro^
[0130] Xaa"是 Pro;
[0131] 條件是
[0132] 如果 Xaai 是 OctGly,貝 Ij
[0133] Xaa2 是 Glu;或 Nle;
[0134] 并且進(jìn)一步的條件是
[0135] 如果 Xaaii 是 Tyr;或 His,則
[0136] Xaai 是 Argo
[0137] 在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，0-發(fā)夾膚模擬物是通式I的化合物及其藥學(xué) 上可接受的鹽，其中
[013 引 Xaai 是 Arg;或 hArg;
[0139] Xaa2 是Glu;化1;或hTyr;
[0140] Xaa* 是 Ala;或 Al IylGly;
[0141] XaaS 是 lie;
[0142] Xaa^Pro ；
[01創(chuàng) Xaa 墻 Pro;
[0144] Xaa 目是 Gln;或 Tyr;
[014日]XaaiQ 是 Lys;
[0146] Xaa"是 IiLeu; Ser; Thr;或 hGln;
[0147] Xaai2 是。Pro;和
[014 引 Xaais 是化 O。
[0149] 在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，(6-發(fā)夾版模擬物是通式I的化合物及其藥學(xué) 上可接受的鹽，所述化合物選自
[0150] 環(huán)
[0151 ] (-0ctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Asn-DF*r〇-F*r〇-);
[0152] 環(huán)
[0153] (-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-l'hr-Dft'o-ft'o-);
[0154] 環(huán)
[0155] (-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Ser-Dp*r〇-F*r〇-);
[0156] 環(huán)
[0157] (-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-l'hr-Dft'o-ft'o-);
[0158] 環(huán)（-六巧-扣71'-化1'-六13-561'-116-?1'〇-?1'〇-61]1-173-171'-?；?化〇-);
[0159] 環(huán)（-Arg-Nle-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Tyr-Dp*r〇-F*r〇-);
[0160] 環(huán)（-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Tyr-Lys-His-Dp*r〇-F*r〇-);
[0161 ]環(huán)（-Glu(苯乙基）-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Tyr-DF*r〇-F*r〇-);
[0162] 環(huán)（-Arg-Val-Thr-Ala-Ser-I le-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Tyr-Dp*r〇-F*r〇-) O
[0163] 在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，(6-發(fā)夾版模擬物是通式I的化合物及其藥學(xué) 上可接受的鹽，所述化合物選自
[0164] 環(huán)
[0165] (-Arg-Glu-Thr-AlIyIGl廠Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-l'hr-Dft'o-ft'o-);
[0166] 環(huán)（-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Tyr-Lys-Ser-Dp*r〇-F*r〇-);
[0167] 環(huán)（-]1六巧-6111-扣1'-六13-561'-116-?1'〇-?1'〇-6111-173-化1'-?；?化〇-);
[0168] 環(huán)（-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-hLeu-Dp*r〇-F*r〇-);
[0169] 環(huán)（-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-l'hr-Dft'o-ft'o-);
[0170] 環(huán)（-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Tyr-Lys-hGln-Dp*r〇-F*r〇-);
[0171 ]環(huán)（-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-l'hr-Dft'o-ft'o-);
[0172] 環(huán)（-Arg-Val-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-l'hr-Dft'o-ft'o-);
[0173] 環(huán)（-Arg-hTyr-l'hr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-l'hr-Dft'o-ft'o-) O
[0174] 本發(fā)明的方法可有利地^平行陣列合成進(jìn)行W產(chǎn)生上述通式I的(6-發(fā)夾版模擬物 的文庫(kù)。這樣的平行合成允許^高產(chǎn)率和確定的純度獲得許多（通常24-192,典型地96)通 式I的化合物的陣列，從而使二聚和多聚副產(chǎn)物的形成最小化。官能化固體支持物（即固體 支持物加接頭分子）、模板和環(huán)化位點(diǎn)的恰當(dāng)選擇發(fā)揮關(guān)鍵作用。
[0175] 官能化固體支持物便利地衍生自優(yōu)選地與1-5%二乙締基苯交聯(lián)的聚苯乙締；用 聚乙締間隔團(tuán)包覆的聚苯乙締 CTent貧ge臟);和聚丙締醜胺樹脂（D .ObrechtJ.- M.Villalgordo,"Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-MoIecuIsr-Weight Compound Libr曰ries",Tetrahedron Orgsnic Chemistry Series,第 17卷,Pergamon,Elsevier Science,1998)。
[0176] 固體支持物通過接頭來官能化，即，雙官能間隔分子，所述雙官能間隔分子在一個(gè) 末端上含有用于接合至固體支持物的錯(cuò)定基團(tuán)并且在另一個(gè)末端上含有用于后續(xù)化學(xué)轉(zhuǎn) 化和切割過程的可選擇性切割官能團(tuán)。出于本發(fā)明目的，使用兩種類型的接頭：
[0177] 1型接頭設(shè)計(jì)成在酸性條件下釋放酷胺基化.Rink,Te化ahe化on Lett. 1987,28, 3783-3790)。運(yùn)種類型的接頭形成氨基酸簇基的酷胺；由運(yùn)類接頭結(jié)構(gòu)官能化的樹脂的例 子包括4-[(( (2,4-二甲氧苯基）Fmoc-氨基甲基）苯氧乙酷氨基）氨基甲基]PS樹脂、4-[(((2,4-二甲氧苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酷氨基)氨基甲基]-4-甲基-二苯甲基胺PS樹 脂(Rink酷胺MBHAPS樹脂)和4-[(((2,4-二甲氧基-苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酷氨基)氨 基甲基]二苯甲基胺PS-樹脂(Rink酷胺BHA PS樹脂）。優(yōu)選地，支持物衍生自最優(yōu)選地與1-5%二乙締基苯交聯(lián)并借助4-(((2,4-二甲氧苯基)Fmoc-氨基甲基)苯氧乙酷氨基)接頭官 能化的聚苯乙締。
[0178] 2型接頭設(shè)計(jì)成最終在酸性條件下釋放簇基。運(yùn)種類型的接頭與氨基酸的簇基形 成酸不穩(wěn)定醋，通常是酸不穩(wěn)定節(jié)醋、二苯甲基醋和=苯甲基醋;運(yùn)類接頭結(jié)構(gòu)的例子包括 2-甲氧基-4-徑甲基苯氧基(Sasrin霞接頭）、4-(2,4-二甲氧基-徑甲基））-苯氧基(Rink接 頭）、4-(4-巧圣甲基)-3-甲氧苯氧基)下酸(HMPB接頭）、S苯甲基和2-氯S苯甲基。優(yōu)選地， 支持物衍生自最優(yōu)選地用1-5 %二乙締基苯交聯(lián)并借助2-氯S苯甲基接頭官能化的聚苯乙 締。
[0179] 當(dāng)作為平行陣列合成實(shí)施時(shí)，本發(fā)明的方法可W有利地如下文所述那樣實(shí)施，但 是本領(lǐng)域技術(shù)人員將立即明了，在需要合成本發(fā)明的一種單一化合物的情況下，將必需如 何調(diào)整運(yùn)些方法。
[0180] 將數(shù)目與通過平行方法待合成的化合物的總數(shù)相等的反應(yīng)容器充W25至lOOOmg， 優(yōu)選地60mg適宜的官能化固體支持物，優(yōu)選地1至5 %交聯(lián)聚苯乙締或Tentagel樹脂。
[0181] 待使用的溶劑必須能夠溶脹該樹脂并且包括但不限于二氯甲燒(DCM)、二甲基甲 酷胺(DMF)、N-甲基化咯燒酬(醒P)、二嗯燒、甲苯、四氨巧喃（THF)、乙醇化t0H)、S氣乙醇 (TFE )、異丙醇等。含有極性溶劑作為至少一種組分的溶劑混合物(例如20 % TFE/DCM、35 % THF/NMP)有益于確保結(jié)合樹脂的膚鏈的高度反應(yīng)性和溶劑化(G.B.Fields，C.G.Fields, J.Am.Chem.Soc.1991,113,4202-4207)。
[0182] 隨著開發(fā)出在溫和酸性條件下釋放C端簇酸基，不影響保護(hù)側(cè)鏈中官能團(tuán)的酸不 穩(wěn)定基團(tuán)的多種接頭，在合成受保護(hù)的膚片段方面已經(jīng)取得巨大進(jìn)展。2-甲氧基-4-徑基節(jié) 醇衍生的接頭（S:as.rin?接頭，Mergler等人，Tetrahe化on Lett. 1988,29 4005-4008)用 稀釋的S氣乙酸(DCM中的0.5-l%TFA)可切割并且對(duì)膚合成期間的Fmoc去保護(hù)條件穩(wěn)定， 基于Boc/tBu的額外保護(hù)基與運(yùn)種保護(hù)方案相容。適用于本發(fā)明方法的其他接頭包括過酸 不穩(wěn)定性4-( 2,4-二甲氧基-?甲基）-苯氧基接頭（Rink接頭，H. Rink , Tetrahedron Lett. 1987，28，3787-3790)，其中膚的移除需要DCM中的10 %乙酸或DCM中的0.2 氣乙 酸;4-(4-?甲基-3-甲氧苯氧基)下酸衍生的接頭(HMPB-接頭，F(xiàn)16rsheimer和Riniker, 化Ptides 1991,1990 131)，該接頭也用1%TFA/DCM切割W產(chǎn)生含有全部酸不穩(wěn)定側(cè)鏈保 護(hù)基的膚片段；另外，2-氯S苯甲基氯接頭（Bar I OS等人，Tetrahedron Lett. 1989,30 , 3943-3946)，該接頭允許使用冰醋酸/S氣乙醇/DCM( 1:2:7)混合物30分鐘使膚脫離。
[0183] 氨基酸的適合保護(hù)基及其殘基的適合保護(hù)基例如分別是
[0184] -對(duì)于氨基(如存在，例如也存在于賴氨酸的側(cè)鏈中）
[01化]Cbz 苯甲氧基幾基
[01化]Boc 叔下氧幾基
[0187] Fmoc 9-巧基甲氧幾基
[0188] Alloc締丙氧幾基
[0189] 化OC S甲基甲娃烷基乙氧幾基
[0190] Tcc S氯乙氧幾基
[0191] 化S 鄰硝基苯基橫酷；
[0192] ht S苯甲基或S苯甲基(trityl)
[0193] -對(duì)于用醇組分轉(zhuǎn)化成醋的簇基（如存在，例如也存在于精氨酸和谷氨酸的側(cè)鏈 中）
[0194] tBu 叔下基
[019引 Bn 芐基
[0196] Me 甲基
[0197] Ph 苯基
[019引 Pac 苯甲酯甲基
[0199] 締丙基
[0200] Tse S甲基甲娃烷基乙基
[0201] Tce S 氯乙基；
[0202] -對(duì)于脈基(如存在，例如存在于精氨酸的側(cè)鏈中）
[0203] Rnc 2,2,5,7,8-五甲基苯并二氨化喃-6-橫酷基
[0204] Ts 甲苯橫酷基(即，對(duì)甲苯橫酷基）
[02化]Cbz 苯甲氧基幾基
[0206] Pbf 五甲基二氨苯并巧喃-5-橫酷基
[0207] -對(duì)于徑基(如存在，例如存在于蘇氨酸和絲氨酸的側(cè)鏈中）
[020引巧U 叔下基
[0209] Bn 芐基
[0210] ht S 苯甲基。
[0211]優(yōu)選地使用9-巧基甲氧幾基巧moc)保護(hù)的氨基酸衍生物作為構(gòu)建本發(fā)明0-發(fā)夾 環(huán)模擬物的結(jié)構(gòu)單元。對(duì)于去保護(hù)，即，切去化OC基團(tuán)，可W使用DMF中的20 %贓晚或DMF中 的2 % D腳/2 %贓晚W及C出Cl 2中的六氣異丙醇。
[0212]基于最初稱入反應(yīng)管中的官能化固體支持物的毫當(dāng)量/克(meq/g)載量，反應(yīng)物 (即氨基酸衍生物）的量通常1至20當(dāng)量(通常，對(duì)于聚苯乙締樹脂是0.1至2.85meq/g)。如果 需要，可W使用額外當(dāng)量的反應(yīng)物，W驅(qū)動(dòng)反應(yīng)W合理時(shí)間完成。優(yōu)選的工作站(然而，不限 于 1?)是Labsource'S Combi-chem工作站、Protein Technolo邑ies'Symphony和MultiSyn Tech's-Syro合成儀，后者在從固體支持物脫下充分保護(hù)的線性膚的過程期間額外地配備 轉(zhuǎn)移裝置和儲(chǔ)盒。全部合成儀均能夠提供受控環(huán)境，例如，反應(yīng)可W在與室溫不同的溫度W 及如果需要在惰性氣氛下完成。
[0213] 酷胺鍵形成需要活化a-簇基用于酷化步驟。當(dāng)運(yùn)種活化借助常使用的碳二亞胺如 二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，Sheehan 和 Hess J. Am. Chem. Soc. 1955,77，1067-1068)或二異丙基 碳二亞胺（DIC，Sarantaki S 等人 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976,73,336-:342)實(shí)施時(shí)， 所產(chǎn)生的二環(huán)己基脈和二異丙基脈是不可溶的，并且分別可溶解于通常使用的溶劑中。在 碳二亞胺方法的變例中，包含1-徑基苯并S挫化OBt, K扣nig和Geiger,化em.Ber. 1970， 103,788-798)作為偶聯(lián)混合物的添加劑。HO化阻止脫水、抑制活化氨基酸的外消旋化并充 當(dāng)改善緩慢偶聯(lián)反應(yīng)的催化劑。已經(jīng)使用某些憐鐵試劑作為直接偶聯(lián)試劑，如苯并=挫-1-基-氧-S(二甲基氨基）憐鐵六氣憐酸鹽（B0P，Casho等人，Tetrahedron Lett. 1975,14, 1219-1222; Synthesis 1976，751-752)，或苯并S挫-I-基-氧-S-化咯烷基-憐鐵六氣憐酸 鹽（P 廠 B0P，Coste 等人，Tetrahe 化 on 16?.1990,31，205-208)，或2-(1護(hù)苯并^挫-1-基） 1,1,3,3-四甲基脈鐵四氣棚酸鹽（TBTU)或六氣憐酸鹽化BTU,Knorr等人，Tetrahedron Lett. 1989，30，1927-1930);運(yùn)些憐鐵試劑也適用于與保護(hù)的氨基酸衍生物原位形成冊(cè)化 醋。最近，還已經(jīng)使用疊氮化憐酸二苯醋化PPA)或0-(7-氮雜-苯并S挫-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脈鐵六氣棚酸鹽(TATU)或0-(7-氮雜-苯并S挫-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脈鐵六氣 憐酸鹽(HATU)/7-氮雜-1-?基苯并S挫化OAt，Ca巧ino等人,Tetrahe化on Lett. 1994,35, 2279-2281)或0-(6-氯-lH-苯并S挫-1-基)-N，N，N'，N'-l，l，3,3-四甲基脈鐵六氣棚酸鹽 (1'(：1'1])或六氣憐酸鹽化(：1'1]，]\1曰'(16'，5111￥0和4化6'1。1〇:肥1'1]311(11'(：1'1]:化￥(：0叫1111邑 民eagents:Development and Industrial Applications,Poster Presentation,Gordon Conference February 2002)作為偶聯(lián)試劑，W及尤其用于偶聯(lián)N-甲基化氨基酸的1, 1,3, 3-雙（四亞甲基）氯脈鐵六氣憐酸鹽（PyCIU)(J.Coste,E.F;r6;rot,P.Jouin,B.Cast;ro, Teh址e化on Lett. 1991,32,1967)或五氣苯基聯(lián)苯-次麟酸鹽（S.Qien,J.Xu,Tetrahehon Lett.1991,32,6711)。
[0214] 歸因于必需近乎定量性偶聯(lián)反應(yīng)的事實(shí)，需要具有反應(yīng)完成的實(shí)驗(yàn)證據(jù)?？蒞在 每個(gè)偶聯(lián)步驟后容易地和迅速進(jìn)行巧S酬試驗(yàn)化aiser等人,Anal .BiochemiSt巧1970, 34,595)，其中針對(duì)樹脂結(jié)合膚的等分試樣的陽(yáng)性比色反應(yīng)定性表示伯胺存在。當(dāng)用堿釋放 Fmoc發(fā)色團(tuán)時(shí)，F(xiàn)moc化學(xué)允許Fmoc發(fā)色團(tuán)的分光光度檢測(cè)（Meienhofer等人， Int.J.P巧tide Protein Res.1979,13,35-42)。
[0215] 通過采用W下兩種方法之一反復(fù)暴露于純?nèi)軇?，將每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)部樹脂結(jié)合的中 間體洗涂至不含過量的遺留試劑、溶劑和副產(chǎn)物：
[0216] 1)將反應(yīng)容器填充W溶劑(優(yōu)選地5mU，攬拌5至300分鐘，優(yōu)選地15分鐘，并排干 W驅(qū)出溶劑；
[0217] 2)將反應(yīng)容器填充W溶劑(優(yōu)選地5mL)并排入接收器皿如試管或小瓶中。
[0218] 上述兩種洗涂過程均重復(fù)至多到約50次(優(yōu)選地約10次），通過多種方法如化C、GC 或視檢洗出液，監(jiān)測(cè)移除試劑、溶劑和副產(chǎn)物的效率。
[0219] 隨移除過量試劑、副產(chǎn)物和溶劑后，重復(fù)樹脂結(jié)合的化合物與試劑在反應(yīng)孔內(nèi)部 反應(yīng)的上述過程，伴W連續(xù)轉(zhuǎn)化，直至已經(jīng)獲得樹脂結(jié)合的充分保護(hù)的最終線性膚。
[0220] 從固體支持物脫離運(yùn)種充分保護(hù)的線性膚之前，如果需要，可能的是選擇性去保 護(hù)分子中存在的一個(gè)或幾個(gè)受到保護(hù)的官能團(tuán)和適當(dāng)取代如此釋放的反應(yīng)基。為了此效 應(yīng)，所考慮的官能團(tuán)必須最初通過保護(hù)基保護(hù)，所述保護(hù)基可W被選擇性移除而不影響存 在的其余保護(hù)基。Alloc(締丙基氧幾基)是氨基保護(hù)基的實(shí)例，而Allyl(締丙基)是簇基保 護(hù)基的實(shí)例。兩種基團(tuán)均可例如通過C出Cb中的苯基硅烷和PcT選擇性移除而不影響分子中 存在的其余保護(hù)基，例如Fmoc。如此釋放的反應(yīng)基隨后可使用適合用于引入所需取代基的 試劑處理。因此，例如，氨基可W通過對(duì)應(yīng)于待引入的酷基取代基的酷化劑來酷化，而簇基 可W通過引入氨基取代基來衍生化。優(yōu)選地，Alloc或Allyl將通過應(yīng)用干燥C此C12中的0.2 當(dāng)量四苯基-麟)鈕(O)(IOmM)和10當(dāng)量苯基硅烷在室溫下進(jìn)行15分鐘來移除。在過濾和 洗涂樹脂后，通過使用新鮮試劑溶液重復(fù)該程序來完成去保護(hù)。在釋放的簇基的情況下，例 如胺的隨后偶聯(lián)可W例如通過應(yīng)用如上所述的用于酷胺鍵形成的試劑/反應(yīng)條件來實(shí)現(xiàn)。
[0221] 通過使加載的樹脂暴露用于切割的試劑溶液(優(yōu)選地3至5mL)實(shí)現(xiàn)從固體支持物 脫離充分保護(hù)的線性膚。如上文所述實(shí)施溫度控制、攬拌和反應(yīng)監(jiān)測(cè)。借助轉(zhuǎn)移裝置，反應(yīng) 容器與含有儲(chǔ)管W高效收集已切割產(chǎn)物溶液的儲(chǔ)盒連接。將留在反應(yīng)容器中的樹脂隨后如 上所述用3至5mL適宜溶劑洗涂2至5次W提取(洗脫)盡可能多的脫離產(chǎn)物。將如此獲得的產(chǎn) 物溶液合并，小屯、避免交叉混合。隨后根據(jù)需要操作各份溶液/提取物W分離最終化合物。 常見的操作包括但不限于蒸發(fā)、濃縮、液體/液體提取、酸化、堿化、中和或溶液中的其它反 應(yīng)。
[0222] 將含有充分保護(hù)的線性膚衍生物的溶液蒸發(fā)，其中所述線性膚衍生物已經(jīng)從固體 支持物切下并用堿中和。隨后使用溶劑如DCM、DMF、二嗯燒、THF等，在溶液中實(shí)現(xiàn)環(huán)化。前文 提到的多種偶聯(lián)試劑可W用于環(huán)化。環(huán)化的持續(xù)時(shí)間是約6-48小時(shí)，優(yōu)選地約16小時(shí)。跟蹤 反應(yīng)進(jìn)程，例如通過RP-HPLC(反相高效液相色譜）。隨后通過蒸發(fā)法移除溶劑，將充分保護(hù) 的環(huán)狀膚衍生物溶解于不可溶混于水的溶劑（如DCM)中，并且該溶液用水或水可溶混性溶 劑的混合物提取，W除去任何過量的偶聯(lián)試劑。
[0223] 最后，將充分保護(hù)的膚衍生物用95%TFA、2.5%此0、2.5%TIS或用于實(shí)現(xiàn)切除保 護(hù)基的另一種清除劑組合處理。切割反應(yīng)時(shí)間通常是30分鐘至12小時(shí)，優(yōu)選地約2.5小時(shí)。
[0224] 可選地，可W在玻璃容器中手工地實(shí)現(xiàn)充分保護(hù)的膚從固體支持物的脫離和完全 去保護(hù)。
[0225] 在完全去保護(hù)后，例如，W下方法可W用于其他工序：
[0226] 1)將揮發(fā)性物質(zhì)蒸發(fā)至干燥，并且將粗制膚溶解于水中的20%Ac0H內(nèi)并用異丙酸 或適用的其他溶劑提取。將水層收集并蒸發(fā)至干燥，并且作為終產(chǎn)物，獲得充分去保護(hù)的 膚，環(huán)（-Xaai-XaaS-T 虹 3-Xaa4-Ser 日-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaai 日-Xaaii-XaaU-Xaa"-);
[0227] 2)在真空下濃縮去保護(hù)混合物。在二乙酸中、優(yōu)選地在(TC沉淀充分去保護(hù)的膚 后，將固體洗涂至多約10次，優(yōu)選地3次，干燥，并且作為終產(chǎn)物，獲得充分去保護(hù)的膚，環(huán)(- Xaai-XaaS-T 虹 3-Xaa4-Ser5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaaW-Xaaii-Xaai2-Xaai3-)。
[0228] 取決于其純度，如上獲得的終產(chǎn)物可W直接用于生物測(cè)定，或需要被進(jìn)一步純化， 例如通過制備型HPLC來純化。
[0229] 如之前提到，如果需要，此后可W將如此獲得的充分去保護(hù)的環(huán)狀產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成藥 學(xué)上可接受的鹽或?qū)⑷绱双@得的可藥用或不藥學(xué)上可接受的鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的游離化合物 或轉(zhuǎn)化成不同的藥學(xué)上可接受的鹽。運(yùn)些操作的任一者可W通過本領(lǐng)域熟知的方法實(shí)施。
[0230] 本發(fā)明的(6-發(fā)夾膚模擬物可W在廣泛類型的應(yīng)用(其中炎性疾病或肺部疾病或感 染或免疫性疾病或屯、血管疾病或神經(jīng)變性疾病由絲氨酸蛋白酶活性介導(dǎo)或引起，或其中癌 癥由絲氨酸蛋白酶活性介導(dǎo)或引起）中使用。為了控制或預(yù)防適于用蛋白酶抑制劑治療的 給定疾病或病癥，可施用本發(fā)明的e-發(fā)夾膚模擬物本身或可W將本發(fā)明的e-發(fā)夾膚模擬物 施加為與本領(lǐng)域中已知的載體、稀釋劑或賦形劑一起的適當(dāng)制劑。
[0231] 當(dāng)用于治療、預(yù)防、調(diào)節(jié)或重塑疾病例如al抗膜蛋白酶缺乏癥(AATD)、肺氣腫、類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、銀屑病、囊性纖維化（CF)、慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、支氣管擴(kuò)張癥、支氣管擴(kuò)張、慢性支氣管炎、多發(fā)性硬化、急 性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、肺性高血壓(PH)、肺動(dòng)脈高壓(PAH)、膜腺炎、 哮喘、過敏性鼻炎、炎性皮膚病、血管成形術(shù)后再狹窄、全身炎性呼吸系統(tǒng)綜合征(SIRS)、缺 血再灌注損傷、屯、臟肥大、屯、肌炎、急性屯、肌梗塞（AMI)、屯、臟衰竭、屯、臟移植、炎性腸病 (IBD)、結(jié)腸炎、克羅恩病、適應(yīng)性結(jié)腸炎或癌癥，例如但不限于肺癌、乳腺癌或與血管發(fā)生 相關(guān)的癌癥或轉(zhuǎn)移癌時(shí)，本發(fā)明的e-發(fā)夾膚模擬物可W單獨(dú)施用，作為幾種e-發(fā)夾膚模擬 物的混合物與其他抗炎性劑或抗微生物劑或抗癌藥和/或與其他藥物活性物質(zhì)組合時(shí)施 用。本發(fā)明的e-發(fā)夾膚模擬物可W原樣或作為藥物組合物施用。
[0232] 包含本發(fā)明0-發(fā)夾膚模擬物的藥物組合物可W通過常規(guī)混合、分散、造粒、衣片劑 制造、粉碎、乳化、封膠、包埋或凍干方法制造。藥物組合物可W使用一種或多種促進(jìn)本發(fā)明 的活性e-發(fā)夾膚模擬物加工成制品的生理可接受載體、稀釋劑、賦形劑或賦形劑W常規(guī)方 式配制，其中可W藥學(xué)地使用所述制品。正確的制劑取決于所選的施用方法。
[0233] 對(duì)于局部施用，本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物可W配制為溶液，凝膠劑、油膏劑、乳膏 劑、混懸劑等，如本領(lǐng)域熟知。
[0234] 全身性制劑包括設(shè)計(jì)成通過注射例如皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、銷內(nèi)或腹膜內(nèi)注射施用 的那些，W及設(shè)計(jì)成透皮、透粘膜、口服或肺施用的那些。
[0235] 對(duì)于注射劑，本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物可W在水溶液中、優(yōu)選地在生理相容性緩 沖液如化nk溶液、Ringer溶液或生理鹽水中配制。所述溶液可W含有配制劑如助懸劑、增溶 劑、穩(wěn)定劑和/或分粉劑?？蛇x地，本發(fā)明的e-發(fā)夾膚模擬物可W處于粉末形式，W在使用前 與合適的溶媒(例如無菌無熱原的水)組合。
[0236] 對(duì)于透黏膜施用，在制劑中使用適合待滲透的屏障的滲透劑，如本領(lǐng)域已知。
[0237] 對(duì)于口服施用，該化合物可W通過將本發(fā)明的活性0-發(fā)夾膚模擬物與本領(lǐng)域熟知 的可藥用載體組合來容易地配制。運(yùn)類載體使得本發(fā)明的e-發(fā)夾膚模擬物可配制為片劑、 丸劑、錠劑、膠囊劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑、粉劑等，W由待治療的患者口服 攝入。對(duì)于口服制劑，例如粉劑、膠囊劑和片劑，合適的賦形劑包括填料如糖，如乳糖、薦糖、 甘露糖和山梨糖;纖維素制品如玉米淀粉、小麥淀粉、稻淀粉、馬鈴馨淀粉、明膠、黃著膠，甲 基纖維素、徑丙基甲基纖維素、簇甲基纖維素鋼和/或聚乙締化咯燒酬(PVP);造粒劑和粘合 劑。如果需要，可W添加崩解劑，如交聯(lián)聚乙締化咯燒酬、瓊脂或海藻酸或其鹽如海藻酸鋼。 如果需要，可W使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將固體劑型進(jìn)行糖包衣或腸溶包衣。
[0238] 對(duì)于口服液體制品例如混懸劑、馳劑和溶液劑，合適的載體、賦形劑或稀釋劑包括 水、乙二醇、油、醇等。另外，可W添加矯味劑、防腐劑、著色劑等。
[0239] 對(duì)于口腔施用，組合物可W采取如本領(lǐng)域已知地配制的片劑、錠劑等形式。
[0240] 對(duì)于通過吸入施用，本發(fā)明的(6-發(fā)夾膚模擬物W氣霧噴霧劑形式從加壓的包裝或 噴霧器，借助于適合的拋射劑，例如二氯二氣甲燒、=氯氣甲燒、二氧化碳或另一種適合的 氣體方便地遞送。在加壓氣霧劑的情況中，劑量單位可W通過提供閥而遞送計(jì)量的量來確 定。用于在吸入器或吹入器中使用的例如明膠的膠囊和藥筒可配制為含有本發(fā)明的e-發(fā)夾 膚模擬物和適合的粉末基質(zhì)例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
[0241] 化合物也可W與適宜的栓劑基料如可可脂或其他甘油醋一起配制于直腸或陰道 組合物如栓劑中。
[0242] 除前文描述的制劑之外，本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物也可W配制為膽庫(kù)制劑。運(yùn)種 長(zhǎng)效制劑可W通過(例如皮下或肌內(nèi)）埋植或通過肌內(nèi)注射施用。為制造運(yùn)類儲(chǔ)庫(kù)制劑，本 發(fā)明的e-發(fā)夾膚模擬物可W用合適的聚合材料或疏水材料(例如，作為可接受油中的乳液） 或離子交換樹脂配制，或配制為微溶性鹽。
[0243] 此外，可W使用其他藥物遞送系統(tǒng)，如本領(lǐng)域熟知的脂質(zhì)體和乳液。也可W使用某 些有機(jī)溶劑如二甲基亞諷。額外地，本發(fā)明的e-發(fā)夾膚模擬物可W使用持續(xù)釋放系統(tǒng)(如含 有治療劑的固體聚合物的半透性基質(zhì))遞送。各種持續(xù)釋放材料已經(jīng)是確立的并且是本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知的。取決于它們的化學(xué)性質(zhì)，持續(xù)釋放膠囊劑可W釋放所述化合物持續(xù)幾 周直至超過100日。根據(jù)治療劑的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)穩(wěn)定性，可W使用額外的蛋白質(zhì)穩(wěn)定化 策略。
[0244] 由于本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物含有帶電荷殘基，因此它們可W原樣或作為藥學(xué)上 可接受的鹽包括于前述任一種制劑中。藥學(xué)上可接受的鹽傾向于比相應(yīng)的游離形式更多可 溶于含水溶劑和其他質(zhì)子溶劑中。特別合適的藥學(xué)上可接受的鹽包括與W下酸的鹽:簇酸、 麟酸、橫基酸和氨基橫酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二燒酸、乙醇酸、乳酸、延胡索酸、 班巧酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、蘋果酸、酒石酸、巧樣酸、氨基酸、如谷氨酸或天冬 氨酸、馬來酸、徑基馬來酸、甲基馬來酸、環(huán)己燒簇酸、金剛燒簇酸、苯甲酸、水楊酸、4-氨基 水楊酸、獻(xiàn)酸、苯乙酸、扁桃酸、肉桂酸、甲橫酸或乙橫酸、2-徑基乙橫酸、乙燒-1,2-二橫酸、 苯橫酸、2-苯橫酸、1，5-糞二橫酸、2-、3-或4-甲基苯橫酸、甲基硫酸、乙基硫酸、十二烷基硫 酸、N-環(huán)己基氨基橫酸、N-甲基-、N-乙基或N-丙基氨基橫酸和其他有機(jī)質(zhì)子酸，如抗壞血 酸。合適的無機(jī)酸是例如氨面酸(如氨氯酸）、硫酸和憐酸。
[0245] 本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物或其組合物通常將W有效實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的量使用。應(yīng)當(dāng)理 解所用的量將取決于具體的應(yīng)用。
[0246] 對(duì)于局部施用W治療或預(yù)防適于用0-發(fā)夾模擬物治療的疾病，治療性有效劑量可 W使用例如實(shí)施例中提供的體外測(cè)定法確定。治療可W在疾病明顯時(shí)施加，或甚至當(dāng)它不 明顯時(shí)也可W施加。普通技術(shù)人員將能夠在無需過多實(shí)驗(yàn)的情況下確定治療局部疾病的治 療有效量。
[0247] 對(duì)于全身性施用，可W從體外測(cè)定法初步估計(jì)治療有效劑量。例如，可W在動(dòng)物模 型中配制某個(gè)劑量W實(shí)現(xiàn)包括ICso的循環(huán)型0-發(fā)夾膚模擬物濃度范圍，如細(xì)胞培養(yǎng)物中所 測(cè)定。運(yùn)類信息可W用來更精確地確定用于人類中的劑量。
[0248] 也可W使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，從體內(nèi)數(shù)據(jù)(如動(dòng)物模型）估計(jì)初始劑量。本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員可W基于動(dòng)物數(shù)據(jù)容易地優(yōu)化向人類的施用。
[0249] 可W調(diào)節(jié)單獨(dú)作為絲氨酸蛋白酶抑制劑應(yīng)用的劑量數(shù)量W提供足W維持治療效 果的本發(fā)明e-發(fā)夾膚模擬物的血漿水平。治療有效的血清水平可W通過每日施用多個(gè)劑量 實(shí)現(xiàn)。
[0250] 在局部施用或選擇性攝入的情況下，本發(fā)明0-發(fā)夾膚模擬物的有效局部濃度可W 與血漿濃度不相關(guān)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠在無需過多實(shí)驗(yàn)的情況下優(yōu)化治療有效的 局部劑量。
[0251] 當(dāng)然，施用的本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物的量將取決于正在治療的受試者、該受試 者的體重、疾患的嚴(yán)重性、施用方式和處方醫(yī)師的判斷。
[0252] 正常情況下，本文所述的本發(fā)明的0-發(fā)夾膚模擬物的治療有效劑量將在不造成明 顯毒性的情況下提供治療益處。
[0253] 可W通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法確定本發(fā)明0-發(fā)夾膚模擬物的 毒性，例如，通過確定LD50(對(duì)50%群體致死的劑量)或LDioo(對(duì)100%群體致死的劑量）。毒性 作用和治療作用之間的劑量比是治療指數(shù)。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的化合物。從運(yùn)些細(xì)胞培 養(yǎng)測(cè)定法和動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可W用于形成在人類中使用時(shí)無毒的劑量范圍。本發(fā)明 的e-發(fā)夾膚模擬物的劑量?jī)?yōu)選地處于在毒性低或無毒情況下包括有效劑量的一系列循環(huán) 濃度內(nèi)。該劑量可W根據(jù)所用的劑型和所用的施用途徑在運(yùn)個(gè)范圍內(nèi)變動(dòng)。確切的制劑、施 用途徑和劑量可W由各位醫(yī)師根據(jù)患者的狀況選擇（見，例如Fingl等人，1975,引自：The Pharmacological Basis of Therapeutics,第I章，第頂）。
[0254] 本發(fā)明也可W包括化合物，其與通式環(huán)(-Xaai-Xaa2-Thr3-Xaa4-Ser5-Xaa6-Xaa7-Xaa 8-Xaa9-XaaiD-Xaaii-Xaai2-Xaai3-)的化合物相同，差異在于一個(gè)或多個(gè)原子由具有與自 然界中通常存在的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同的原子質(zhì)量數(shù)或質(zhì)量的原子替換，例如富含 2H (0)、化、11(：、14(：、1291等的化合物。將運(yùn)些同位素類似物和它們的藥用鹽和制劑視為在治療 和/或診斷中可用的藥劑，例如，但不限于，其中精細(xì)調(diào)節(jié)體內(nèi)半壽時(shí)間可能導(dǎo)致優(yōu)化劑量 方案的情況。
[0255] W下實(shí)施例說明本發(fā)明，但是無論如何將不得解釋為限制其范圍。 實(shí)施例
[0256] 1.膚合成
[0257] 保護(hù)的第一氨基酸殘基與樹脂的偶聯(lián)
[0巧引將1邑（1.4111101)2-氯立苯甲基氯樹脂（1.4mMol/g;100-200目，共聚（苯乙締-1% DVB)聚合物母體;BarIos等人，Tetr址e化on Lett. 1989,30,3943-3946)填充至干燥的燒瓶 中。將樹脂懸浮于C此Cl2(5mL)中并且使其在室溫恒定振搖下溶脹30分鐘。添加與960山（4當(dāng) 量)二異丙基乙胺(DIEA)混合的適當(dāng)保護(hù)的第一氨基酸殘基在C此Cb(SmL)中的0.98mMol (0.7當(dāng)量）溶液(見下文）。將反應(yīng)混合物在25°C振搖4小時(shí)后，將樹脂濾出并且用C此CbQ X )、DMF(1 X )和C出Cl2(l X )連續(xù)洗涂。將C此Cl2/Me0H/DIEA(17/2/l，10血）的溶液添加至 樹脂并且將懸液振搖30分鐘。在過濾后，將樹脂按W下順序用如下洗涂:C出Cb(1 X )、DMF( 1 X )、CH2Cl2( 1 X )、MeOH( 1 X )、CH2Cl2( 1 X )、MeOH( 1 X )、CH2Cl2(2 X )、化20(2 X )并在真空下 干燥6小時(shí)。
[0巧9] 載量通常地是0.6-0.7mMol/g。
[0260]制備W下預(yù)加載的樹脂：
[o%1]尸111〇。-56八1811)-0-2-氯^苯甲基樹脂和尸111〇。斗'〇-0-2-氯^苯甲基樹脂。
[0262]使用Syro-膚合成儀(MultiSynTech)使用24-96個(gè)反應(yīng)容器實(shí)施合成。在每個(gè)容器 中，放置0.04mMol上述樹脂并且使樹脂在C出Cl2和DMF中分別溶脹15分鐘。將W下反應(yīng)循環(huán) 編程并實(shí)施：
[0%3]
[0265] 除非另外指出，否則最終偶聯(lián)氨基酸后，通過采用上述反應(yīng)循環(huán)的步驟1-3進(jìn)行 Fmoc去保護(hù)。
[0266] 適當(dāng)保護(hù)的氨基酸結(jié)構(gòu)單元是商購(gòu)可得的或可W按本領(lǐng)域已知的進(jìn)行合成。
[0267] 苯乙胺與具有簇基的側(cè)鏈的附接 [0%引程序A
[0269] 苯乙胺與樹脂上的選擇性去保護(hù)的線性膚的附接
[0270] 為了從樹脂結(jié)合膚的簇基官能團(tuán)移除締丙基保護(hù)基，將樹脂結(jié)合膚(0.(MmMol)在 新鮮蒸饋的C也Cb中溶脹至少15分鐘，隨后加入干燥C也Cb中的0.2當(dāng)量的四苯基-麟） 鈕(0)(1 OmM)和10當(dāng)量苯基硅烷。在室溫下?lián)u動(dòng)反應(yīng)混合物15分鐘后，將樹脂濾出，并加入 試劑的新鮮溶液W重復(fù)該程序。在隨后用C出Cb、DMF和Et2〇洗涂樹脂后，將樹脂再次在 C也Cb中溶脹并且通過隨后加入3.6當(dāng)量苯乙胺與3.6當(dāng)量溶于DMF的HOAt和3.6當(dāng)量溶于 DMF的DIC的混合物從而使反應(yīng)混合物靜置1小時(shí)，僅通過偶爾攬拌打斷，來實(shí)現(xiàn)苯乙胺的附 接。在過濾和用DMF洗涂樹脂S次后，通過用3.6當(dāng)量的同一胺和3.6當(dāng)量溶于DMF的HOAt的 混合物W及DMF中的3.6當(dāng)量HATU和7.2當(dāng)量DIPEA的混合物的新鮮溶液重復(fù)該程序來完成 偶聯(lián)。
[0271 ] 和3.6當(dāng)量HOAT混合物的新鮮溶液與3.6當(dāng)量的HATU和7.2的混合物重復(fù)該過程完 成在DMF EQ DIPEA
[0272] 主鏈環(huán)化膚的環(huán)化和制備
[0273] 切割充分保護(hù)的膚片段
[0的4] 在完成合成后，將樹脂（0. (MmMol)懸浮于ImUO. 13mMol，3.4當(dāng)量）在C也Ch中的 l%TFA(v/v)中3分鐘，過濾，并且將濾液用1血(〇.58mMol，14.6當(dāng)量)在C也Ch中的10%DIEA (v/v)中和。將運(yùn)個(gè)過程重復(fù)3次W確保切割的完成。將濾液蒸發(fā)至干燥，并且通過使用含有 95%S氣乙酸(TFA)、2.5%水和2.5%S異丙基硅烷(TIS)的切割混合物，將產(chǎn)物的樣品充 分去保護(hù)，通過反相-HPLC(Ci泡)和ESI-MS分析W檢測(cè)線性膚合成的效率。
[0275] 線形膚的環(huán)化
[0276] 將充分保護(hù)的線性膚（0.04mMo 1)溶解于DMF(4iiMo 1 /mL)中。隨后添加30.4mg (0.08111]\1〇1，2當(dāng)量）的齡1'1]、10.9111邑（0.08111]\1〇1，2當(dāng)量）的冊(cè)41和2祉1(0.16111]\1〇1，4當(dāng)量）的 DIEA，并將混合物在25°C滿旋混合16小時(shí)并且隨后在高真空下濃縮。將殘余物在C出Cb和 出0/CH3CN(90/10:v/v)之間分配。將C出Cl細(xì)蒸發(fā)W產(chǎn)生充分保護(hù)的環(huán)狀膚。
[0277] 環(huán)狀膚的完全去保護(hù)
[0278] 將獲得的環(huán)狀膚溶解于3mL含有82.5 % S氣乙酸(TFA)、5 %水、5 %茵香硫酸、5 % 苯酪和2.5%乙二硫醇化DT)的切割混合物中。使混合物在25°C靜置2.5小時(shí)并且隨后在真 空下濃縮。在(TC于二乙酸化t2〇)中沉淀充分去保護(hù)的環(huán)狀膚后，將固體用化2〇洗涂?jī)纱尾?干燥。
[0279] 通過制備型HPLC膚純化粗產(chǎn)物后，將膚凍干（白色粉末），并通過下述分析方法進(jìn) 行分析：
[0280] 用于實(shí)施例5-10、16-18的分析方法A:
[0巧1 ]分析性HPLC保留時(shí)間（RT，W分鐘計(jì)）使用具有W下溶劑A(出0+0.1 % TFA)和B (畑 3CN+0.01%TFA)和梯度的 Ascentis Express C18 柱，50x 3.Omm, (cod.53811-U-S啡elco)進(jìn)行測(cè)定：0-0.05min:97%A，3%B;4.95min:3%A97%B;5.35min:3%A，97%B; 5.40min:97%A，3%B。流速 = 1.3mL/min;UV_Vis = 220nm。
[0282] 用于實(shí)施例1-4的分析方法B:
[0283] 分析性HPLC保留時(shí)間（RT，W分鐘計(jì)）使用具有W下溶劑A(出0+0.1 % TFA)和B (畑 3CN+0.01%TFA)和梯度的 Ascentis Express C18 柱，50x 3.Omm, (cod.53811-U-Supelco)進(jìn)行測(cè)定：0-0.05min:97%A，3%B;3.40min:33%A，67%B;3.45min:3%A，97%B; 3.65min:3%A，97%B;3.70min:97%A，3%B。流速 = 1.3mL/min;UV_Vis = 220nm。
[0284] 用于實(shí)施例11-15的分析方法C:
[0285] 分析性HPLC保留時(shí)間（RT，W分鐘計(jì)）使用具有W下溶劑A(出0+0.1 % TFA)和B (畑3CN+0.01%TFA)和梯度的Xselect C細(xì) C18XP柱，IOOx 3.0mm, (cod.186006107， Waters)進(jìn)行測(cè)定：0-0.05min:95%A, 5%B; 10.05min:3%A, 97%B; 12.05min:3%A，97%B; 12.10min:95%A，5%B。流速 = 0.6mL/min;UV_Vis = 220nm。
[O%6] 實(shí)施例1-13示于表1中。膚如下合成:起始樹脂是Fmoc-Ser (tBu)-0-2-氯S苯甲基 樹脂，其如上所述制備。向該樹脂最終在第4位接枝Xaa4。W如下序列按照上述程序在固體 支持物上合成線性膚：樹脂-Sers-Xaa 4-Thr3-Xaa2-Xaai-Xaai3-Xaai 2-Xaaii-XaaiD-Xaa9-Xaa8-Xa a7-Xaa6。在如上所述的最終Fmoc去保護(hù)后，如上所示將膚從樹脂切掉、環(huán)化、去保 護(hù)和純化。
[0287] 使用如上所述的分析方法測(cè)定的HPLC保留時(shí)間和UV純度顯示于表1中。
[0288] 實(shí)施例14、16示于表1中。膚如下合成：起始樹脂是Fmoc-Pro-O-S-氯S苯甲基樹 月旨，其如上所述制備。向該樹脂最終在第12位接枝XaaU。W如下序列按照上述程序在固體支 持物上合成線性膚：樹脂-Pr〇U-Xaai 2-Xaaii-Xaai 日-Xaa9-Xaa8-Xaa7-Xaa6-Ser 日-Xaa4-Thr3- Xa a2-Xaai。在如上所述的最終Fmoc去保護(hù)后，如上所示將膚從樹脂切掉、環(huán)化、去保護(hù)和純 化。
[0289] 使用如上所述的分析方法測(cè)定的HPLC保留時(shí)間和UV純度顯示于表1中。
[0290] 實(shí)施例15示于表1中。膚如下合成:起始樹脂是Fmoc-Pro-O-S-氯S苯甲基樹脂，其 如上所述制備。向該樹脂最終在第12位接枝XaaU。W如下序列按照上述程序在固體支持物 上合成線性膚：樹脂-Proi 3-Xaai2-Xaaii-XaaW-Xaa9-Xaa8-Xaa 7-Xaa6-SerS-Xaa4-Ser3-Xaa 2-Glui。在最后的Fmoc-去保護(hù)之前，應(yīng)用程序AW將苯乙胺附接至Glui的側(cè)鏈。在如上所述的 最終Fmoc去保護(hù)后，如上所示將膚從樹脂切掉、環(huán)化、去保護(hù)和純化。
[0291] 使用如上所述的分析方法測(cè)定的HPLC保留時(shí)間和UV純度顯示于表1中。
[0292] 實(shí)施例17-18示于表1中。膚如下合成：起始樹脂是Fmoc-Pro-O-S-氯S苯甲基樹 月旨，其如上所述制備。向該樹脂最終在第7位接枝Xaa 7。W如下序列按照上述程序在固體支 持物上合成線性膚：樹脂-Pro8-Xaa7-Xaa 6-Sers-Xaa4-Ilir3-Xaa2-Xaai-Xaai 3-Xaai2-Xaaii-XaaW-Xaa9。在如上所述的最終Fmoc去保護(hù)后，如上所示將膚從樹脂切掉、環(huán)化、去保護(hù)和純 化。
[0293] 使用如上所述的分析方法測(cè)定的HPLC保留時(shí)間和UV純度顯示于表1中。
[0巧4] 表1:實(shí)例
[0297]
[029引a)氨基酸的縮寫參見上文的列表。
[0299] 6)]?5:[]\1+1扣^或[]\1+2扣2+。
[0300] C)分析方法B
[0301] d)分析方法C
[0302] e)Glu(Phen)=Glu(苯乙基）
[0303] 2.生物學(xué)方法
[0304] 2.1.膚樣品的制備
[03化]將凍干的膚在微天平(Mettler MT5)上稱重并溶解于DMSO中至終濃度lOmM。母液 避光保存在+4°C。除非另外說明，否則在具有小于1%DMS0的分析條件下實(shí)施生物學(xué)測(cè)定 法。
[0306] 2.2.人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的抑制
[0307] 本發(fā)明的膚抑制人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Serva Electrophoresis ,Germany) 的水解活性的能力使用合成的四膚底物MeOSuc-AAPV-pNA(Bachem, Switzer land)如下測(cè) 定：
[030引將上述底物（0.3mM)和人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（IOnM)與測(cè)定緩沖液（50mM 化is，pH 8,300mM化Cl，0.01%Tween20)中的膚a%DMS0終濃度）的連續(xù)稀釋液在37°C溫 育。在pNA的釋放之后監(jiān)測(cè)405nm處的吸光度的變化30分鐘。具有上述的相同測(cè)定設(shè)置但不 具有膚的對(duì)照測(cè)定線性運(yùn)行。將劑量-響應(yīng)數(shù)據(jù)擬合至4-參數(shù)Hill方程，從而提供使用 Gra地pad (Prism 5)的 IC加值。
[0309] 2.3.豬膜彈性蛋白酶的抑制
[0310] 本發(fā)明的膚抑制豬膜彈性蛋白酶(Sigma, USA)的水解活性的能力使用合成的立膚 底物MeOSuc-AAA-pNA(Bachem, Switzerland)如下測(cè)定： 惦川將上述底物（ImM)和人豬膜彈性蛋白酶（15nM)與測(cè)定緩沖液（50mM Tris,pH 8， IOOmM化Cl，0.01 %Tween20)中的膚(0.5 %DMS0終濃度）的連續(xù)稀釋液在37 °C溫育。在pNA 的釋放之后監(jiān)測(cè)405nm處的吸光度的變化30分鐘。具有上述的相同測(cè)定設(shè)置但不具有膚的 對(duì)照測(cè)定線性運(yùn)行。將劑量-響應(yīng)數(shù)據(jù)擬合至4-參數(shù)化11方程，從而提供使用Graphpad (Prism 5)的IC加值。
[0312] 2.4.人蛋白酶3的抑制
[0313] 本發(fā)明的膚對(duì)人蛋白酶3(Elastin Products Company,USA)的滅活使用合成的S 膚底物Boc-Ala-Ala-Nva-SBzKElastin Products Company,USA)如下測(cè)定：
[0314]將上述底物（11111)、4,4'-二硫代二化晚(250測(cè))和人蛋白酶3(10碰)與測(cè)定緩沖液 (50mM lYistpH 7.4，150mM 胞(：1，0.01%1'訊661120)中的膚(0.5%0150終濃度）的連續(xù)稀釋 液在37°C溫育。在該反應(yīng)過程之后監(jiān)測(cè)340皿處的吸光度的變化30分鐘。具有上述的相同測(cè) 定設(shè)置但不具有膚的對(duì)照測(cè)定線性運(yùn)行。將劑量-響應(yīng)數(shù)據(jù)擬合至4-參數(shù)化11方程，從而提 供使用Gra地pad(PriSm 5)的IC日日值。
[0：31引3.0結(jié)果
[0316]在上文2.2-2.4中描述的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于下表2中。
[0：317]表 2
[031引 n.d.=未確定
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 通式(I)的主鏈環(huán)化肽化合物： 環(huán) (-Xaa1-Xaa2-Thr3-Xaa 4-Ser5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa 9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-) ⑴， 及其藥學(xué)上可接受的鹽，所述化合物由13個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成， 其中 }^&1是0(^617;六作;1^作;〇1&;6111(苯乙基）；或0&13(丁?；? Xaa2 是Glu;Val;Leu;Nle;Phe;hPhe;DiHPhe;Tyr;hTyr;或Trp; Xaa4是Ala; A1 lylGly; Abu;或Val; Xaa6是I le;或OctGly; Xaa7 是 Pro; Xaa8 是 Pro; Xaa9 是 Gin;或 Tyr; Xaa10 是 Lys;或 Asn; Xaa11是hLeu;Ser;hSer;hSer(Me);Thr;alloThr;Asn;Gln;hGln;Dap;Tyr;或 His; )^&12是％『〇;和 Xaa13^Pro；Tic；Glu；Asp；Ala；Val ；^cLys ； 條件是 如果Xaa1是OctGly，貝丨J Xaa2 是 Glu;或 Nle; Xaa4 是 Ala;或 Abu; Xaa6是I le;或OctGly; Xaa1Q 是 Lys; Xaa11 是 Ser; Thr; Asn;或 Gin; Xaa13是Pro; Tic; Ala; Val;或Lys; 和/或如果Xaa6是OctGly，則 Xaa1 是 OctGly; Arg;或 Cha; Xaa2 是 Glu;或 Nle; Xaa4 是 Ala;或 Abu; Xaa1Q 是 Lys; Xaa11 是 Ser; Thr; Asn; Gin; Xaa13是Pro; Tic; Ala; Val;或Lys; 并且進(jìn)一步的條件是 如果Xaa11是Tyr;或His，則 Xaa1 是Arg; hArg;或Glu(苯乙基）。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的式I的化合物，其中 Xaa1 是OctGly ;Arg;hArg;或Glu(苯乙基）； Xaa2是Glu;Nle;hTyr;或Val; Xaa4 是 Ala;或 A1 lylGly; Xaa6是I le; Xaa7 是 Pro; Xaa8 是 Pro; Xaa9 是 Gin;或 Tyr; Xaa1Q 是 Lys; Xaa11 是 hLeu; Ser; Thr; Asn; Tyr; hGln;或 Hi s; Xaa12 是 DPro;和 Xaa13 是 Pro; 條件是 如果Xaa1是OctGly，貝丨J Xaa2 是 Glu;或 Nle; Xaa4 是 Ala; Xaa6是I le; Xaa1Q 是 Lys; Xaa11 是 Ser; Thr;或 Asn Xaa13 是 Pro; 并且進(jìn)一步的條件是 如果Xaa11是Tyr;或His，則 Xaa1 是Arg; hArg或Glu(苯乙基）。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的式I的化合物，其中 Xaa1 是OctGly ;Arg;或Glu(苯乙基）； Xaa2是Glu;Nle;hTyr;或Val; Xaa4 是 Ala; Xaa6是I le; Xaa7 是 Pro; Xaa8 是 Pro; Xaa9 是 Gin;或 Tyr; Xaa1Q 是 Lys; Xaa11 是 Ser; Thr; Asn; Tyr;或 His; )^&12是％『〇;和 Xaa13 是 Pro; 條件是 如果Xaa1是OctGly，貝丨J Xaa2 是 Glu;或 Nle; 并且進(jìn)一步的條件是 如果Xaa11是Tyr;或His，則 Xaa1 是 Arg〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1的式I的化合物，其中 Xaa1 是 Arg;或 hArg; Xaa2是Glu;Val;或hTyr; Xaa4 是 Ala;或 A1 lylGly; Xaa6是I le; Xaa7 是 Pro; Xaa8 是 Pro; Xaa9 是 Gin;或 Tyr; Xaa1Q 是 Lys; Xaa11 是 hLeu; Ser; Thr;或 hGln; )^&12是％『〇;和 }^&13是卩1'〇〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其選自： 5F(-0ctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Asn-DPr〇-Pr〇-)； 5F(-0ctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Tyr-Lys-Thr-DPr〇-Pr〇-)； 5F(-0ctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Ser- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-0ctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Thr- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-hTyr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Tyr- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-Nle-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Tyr- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-Glu-Thr-AllylGly-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Thr- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Tyr-Lys-Ser- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-hArg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Thr- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-hLeu- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Thr- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Tyr-Lys-hGln- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Tyr-Lys-Thr- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Tyr-Lys-His- DPr〇-Pr〇-)； 環(huán)（-0111(苯乙基）-6111-1'111'-六1&-361'-116-?1'〇-?1'〇-6111-1^8-丁71'- 1)?1'〇-?1'〇-); 5F(-Arg-Val-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Thr- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-hTyr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Thr- DPr〇-Pr〇-)； 5F(-Arg-Val-Thr-Ala-Ser-Ile-Pr〇-Pr〇-Gln-Lys-Tyr- DPr〇-Pr〇-) 〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的式I的化合物，其為游離形式或藥學(xué)上可接受的鹽形 式，其用作藥劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的式I的化合物，其為游離形式或藥學(xué)上可接受的鹽形 式，其具有用于治療或預(yù)防下列疾病的針對(duì)彈性蛋白酶的抑制活性:肺癌;乳腺癌;銀肩?。?α?抗胰蛋白酶缺乏癥;肺氣腫;囊性纖維化;慢性阻塞性肺疾病;特發(fā)性肺纖維化;支氣管擴(kuò) 張；肺性高血壓；肺動(dòng)脈高壓；心臟肥大；心肌炎；急性心肌梗塞;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;骨性關(guān)節(jié) 炎;動(dòng)脈粥樣硬化;多發(fā)性硬化癥;胰腺炎;過敏性鼻炎;全身炎癥呼吸綜合征;炎性皮膚病； 炎性腸病;或克羅恩病。8. -種藥物組合物，其包含游離形式或藥學(xué)上可接受的鹽形式的根據(jù)權(quán)利要求1至5的 任一項(xiàng)的式I的化合物或化合物的混合物，以及藥學(xué)上惰性的載體，所述藥物組合物特別地 是適合用于吸入的形式，用于口服、局部、透皮、注射、口腔、透黏膜、直腸、肺或吸入施用，特 別地是片劑、錠劑、膠囊劑、溶液、液體劑、凝膠劑、硬膏劑、乳膏劑、油膏劑、糖漿劑、膏劑、混 懸劑、粉劑或栓劑的形式。9. 游離形式或藥學(xué)上可接受的鹽形式的根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的式I的化合物用 作藥物活性物質(zhì)的用途，所述藥物活性物質(zhì)具有選擇性蛋白酶抑制活性，特別是針對(duì)人嗜 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，和/或抗癌活性和/或抗炎活性和/或抗感染活性和/或抗心血管活 性和/或抗免疫活性和/或抗神經(jīng)變性活性。10. 游離形式或藥學(xué)上可接受的鹽形式的根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的化合物或根據(jù) 權(quán)利要求8的組合物用作具有針對(duì)彈性蛋白酶的抑制活性的藥劑的用途，所述藥劑用于治 療或預(yù)防感染或與這樣的感染相關(guān)的疾病;或者，例如由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的肺 癌或乳腺癌;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的免疫性疾病，例如銀肩病;或由彈性蛋白酶 活性介導(dǎo)或引起的肺部疾病，例如α?抗胰蛋白酶缺乏癥、肺氣腫、囊性纖維化、慢性阻塞性 肺疾病、特發(fā)性肺纖維化、支氣管擴(kuò)張、肺性高血壓或肺動(dòng)脈高壓;或由彈性蛋白酶活性介 導(dǎo)或引起的心血管疾病，例如心臟肥大、心肌炎或急性心肌梗塞;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo) 或引起的神經(jīng)變性疾病;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的炎癥或與炎癥相關(guān)的疾病，例 如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化癥、胰腺炎、過敏性鼻炎、全身炎 癥呼吸綜合征、炎性皮膚病、炎性腸病或克羅恩病;或當(dāng)免疫反應(yīng)由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或 引起時(shí)。11. 游離形式或藥學(xué)上可接受的鹽形式的根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)的化合物用于制 備具有針對(duì)彈性蛋白酶的抑制活性的藥劑的用途，所述藥劑用于治療或預(yù)防感染或與這樣 的感染相關(guān)的疾病;或者由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的癌癥，例如肺癌，或乳腺癌;或由 彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的免疫性疾病，例如銀肩病;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起 的肺部疾病，例如α?抗胰蛋白酶缺乏癥、肺氣腫、囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性肺 纖維化、支氣管擴(kuò)張、肺性高血壓或肺動(dòng)脈高壓;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的心血管 疾病，例如心臟肥大、心肌炎或急性心肌梗塞;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的神經(jīng)變性 疾病;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的炎癥或與炎癥相關(guān)的疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨 性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化癥、胰腺炎、過敏性鼻炎、全身炎癥呼吸綜合征、炎性 皮膚病、炎性腸病或克羅恩病;或當(dāng)免疫反應(yīng)由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起時(shí)。12. -種方法，其治療感染或與這樣的感染相關(guān)的疾病或病癥，其由彈性蛋白酶活性引 起;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的癌癥;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的免疫性疾 病;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的肺部疾病;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的心血 管疾病;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起的神經(jīng)變性疾病;或由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引 起的炎癥;或當(dāng)免疫反應(yīng)由彈性蛋白酶活性介導(dǎo)或引起時(shí)，所述方法包括給有此需要的受 試者施用藥學(xué)上可接受的量的根據(jù)權(quán)利要求1至5或8的任一項(xiàng)的化合物或藥物組合物。13. 用于制備由權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)定義的式（I)的化合物的方法，其包括下列步 驟： (a) 將適當(dāng)官能化的固體支持物與在所需的終產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)于Xaan的適當(dāng)Ν-保護(hù)的氨基 酸衍生物偶聯(lián)，其中η是13、8、7、6、5或4,可以在所述N-保護(hù)的氨基酸衍生物中存在的任何 官能團(tuán)同樣適當(dāng)?shù)厥艿奖Ｗo(hù)； (b) 從如此獲得的產(chǎn)物移除Ν-保護(hù)基； (C)將如此獲得的產(chǎn)物用處在所需終產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)于Xaa1-1的適當(dāng)N保護(hù)的所述氨基酸衍 生物偶聯(lián)，可以在所述N-保護(hù)的氨基酸衍生物中存在的任何官能團(tuán)同樣適當(dāng)?shù)厥艿奖Ｗo(hù)； (d) 從步驟(c)中獲得的產(chǎn)物移除N-保護(hù)基； (e) 使用在所需終產(chǎn)物中處于位置n-2至1位置內(nèi)的適當(dāng)N-保護(hù)的氨基酸衍生物實(shí)施基 本上與步驟(c)和(d)相對(duì)應(yīng)的步驟，可以在所述N-保護(hù)的氨基酸衍生物中存在的任何官能 團(tuán)同樣適當(dāng)?shù)厥艿奖Ｗo(hù)； (f) 如果η不是13,則使用在所需終產(chǎn)物中處于位置13至n+1位置內(nèi)的適當(dāng)N-保護(hù)的氨 基酸衍生物進(jìn)一步實(shí)施基本上與步驟(c)和(d)相對(duì)應(yīng)的步驟，可以在所述N-保護(hù)的氨基酸 衍生物中存在的任何官能團(tuán)同樣適當(dāng)?shù)厥艿奖Ｗo(hù)； (g) 從固體支持物脫離如此獲得的產(chǎn)物； (h) 環(huán)化從固體支持物切下的產(chǎn)物； (i) 移除在氨基酸殘基鏈的任何組件的官能團(tuán)上存在的任何保護(hù)基;和 (j) 如果需要，將如此獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成藥學(xué)上可接受的鹽或?qū)⑷绱双@得的藥學(xué)上可 接受的或藥學(xué)上不可接受的鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的游離化合物或轉(zhuǎn)化成不同的藥學(xué)上可接受的 鹽。
【文檔編號(hào)】C07K7/64GK105873939SQ201380081887
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2013年12月27日
【發(fā)明人】F·O·貢貝爾, D·奧伯萊希特, O·塞利耶-凱斯勒
【申請(qǐng)人】波利弗爾股份公司