檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標板、特異性抗體、酶標記物、吡蟲啉標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原為吡蟲啉偶聯(lián)抗原，所述酶標記物為酶標記抗抗體。本發(fā)明還公開了一種應用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測吡蟲啉的方法，它包括：首先進行樣品前處理，然后用試劑盒進行檢測，最后分析檢測結果。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于檢測蔬菜、水果中吡蟲啉的含量，其操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的篩查。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑 盒，其特別適于蔬菜、水果樣本中吡蟲啉殘留量的檢測。 檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用

【背景技術】
[0002] 吡蟲啉（IMI)是煙堿類超高效殺蟲劑，具有廣譜、高效、低毒、低殘留，害蟲不易產(chǎn) 生抗性，對人、畜、植物和天敵安全等特點，并有觸殺、胃毒和內(nèi)吸等多重作用。
[0003] 目前，含頂I的農(nóng)藥產(chǎn)品已在120多個國家的140余種農(nóng)作物上登記使用，應用 范圍涉及糧食、經(jīng)濟、果樹、茶葉和蔬菜等60余種作物，防治對象涉及同翅目、半翅目、纓翅 目、雙翅目、鞘翅目、鱗翅目等7個目50多種害蟲。
[0004] IMI的大量使用不僅對環(huán)境造成了嚴重影響，同時畜禽因長期食用含IMI殘留的 植物，使其在體內(nèi)富集，最后經(jīng)食物鏈進入人體，危害人體健康。目前國內(nèi)外已制訂出多種 農(nóng)產(chǎn)品中頂I的最大殘留限量標準（MRLs)。2008年歐盟重新審理和修正了頂I在近400 種農(nóng)產(chǎn)品中的MRLs，其中大部分谷物、水果、蔬菜中的MRL均為0.05 mg/kg。美國規(guī)定谷 物、蔬菜中頂I的MRL為0. 05 mg/kg，畜肉產(chǎn)品中頂I的MRL為0. 3 mg/kg，家禽產(chǎn)品中為 0.05 mg/kg。日本于2006年5月29日起執(zhí)行的食品中農(nóng)業(yè)化學品殘留"肯定列表制度" (Positive List System)對畜、禽產(chǎn)品中IMI的MRLs的規(guī)定更為苛刻，其中不同動物的不 同組織均有相應的MRLs，大部分肌肉組織中是0. 02 mg/kg，肝臟中為0. 05 mg/kg，脂肪中為 0. 3 mg/kg，對未制訂MRLs的農(nóng)用化學品，其在食品中的含量執(zhí)行"一律標準"，即一律不能 超過0. 01 mg/kg。國內(nèi)對農(nóng)產(chǎn)品中IMI的MRL只有大致的規(guī)定，即在谷物、蔬菜中不超過 0.5 mg/kg，從整體上看我國在食品中IMI的MRLs制定方面還落后于國外。
[0005] 從文獻報道看，有關頂1殘留的檢測方法主要集中于高效液相色譜法（HPLC)、氣 相色譜法（GC)、電化學分析法（EA)和免疫分析法（ELISA)四個方面，更傾向于色譜技術和 免疫檢測技術。盡管色譜法是目前公認的藥物殘留檢測方法，但這類方法普遍存在著所需 儀器昂貴、儀器操作技術要求高、樣品前處理繁瑣和分析耗時長、檢測成本高、不適于現(xiàn)場 實時檢測等問題。而藥物殘留免疫檢測技術在殘留樣本檢測過程中的復雜程度、速度、靈敏 度、準確性、特異性、單位時間內(nèi)樣本分析容量、檢測成本等方面與儀器分析法的比較優(yōu)勢 突出，幾乎克服了儀器分析法所表現(xiàn)出來的所有不足，近年來已經(jīng)在食品質(zhì)量安全檢測中 得到了越來越廣泛的應用，且逐漸被人們所認可。
[0006] 在對環(huán)境保護和農(nóng)產(chǎn)品安全呼聲日益提高的今天，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的有效檢測 手段致關重要。隨著國際上對IMI在農(nóng)產(chǎn)品中MRLs的規(guī)定日益嚴格，為更好地適應進出 口貿(mào)易和保護人民的健康，開發(fā)食品中頂1的殘留快速檢測技術勢在必行。殘留物的免疫 學檢測方法不僅檢測限低、特異性強，而且操作簡便、檢測速度快、檢測成本低，非常容易推 廣，是當前藥物殘留檢測的研究熱點。盡管國外已有頂I殘留免疫學檢測的文獻報道，但均 不同程度地存在著殘留樣本前處理程序復雜、費用高、檢測限偏高，不能滿足國際上頂I在 食品中的MRLs等問題。因此，找到一個更有效的方法解決這些問題，是擺在我們面前亟待 解決的重要問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠檢測蔬菜、水果樣本中吡蟲啉殘留量的酶聯(lián)免疫 試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。
[0008] 本發(fā)明試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標板、特異性抗體、酶標記物、吡蟲啉標 準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原為吡蟲啉偶聯(lián)抗原，所述酶標 記物為酶標記抗抗體。
[0009] 所述吡蟲啉偶聯(lián)抗原是由吡蟲啉半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述吡蟲啉半抗原 是由氧化還原反應得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血 清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。
[0010] 所述吡蟲啉特異性抗體是以吡蟲啉偶聯(lián)抗原作為免疫原制備獲得，所述吡蟲啉特 異性抗體可為吡蟲啉單克隆抗體或吡蟲啉多克隆抗體，其中優(yōu)選吡蟲啉單克隆抗體。
[0011] 所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，其中優(yōu)選羊抗鼠抗抗體。
[0012] 所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣 根過氧化物酶；酶標記的抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯(lián) 得到的。
[0013] 為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括吡蟲啉標準品溶液、底 物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。
[0014] 所述吡蟲啉標準品溶液6瓶，濃度分別為〇Pg/L、4Pg/L、12Pg/L、36Pg/L、108Pg/L、 324Pg/L。
[0015] 當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成， A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為l~2mol/L的硫 酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸鹽 緩沖液，所述終止液為l~2mol/L氫氧化鈉溶液。
[0016] 所述洗滌液優(yōu)選為pH值為L 4,含有(λ 59TL 0%吐溫-20、(λ 01%。、· 03%。疊氮化 鈉防腐劑、〇. 1、. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0017] 所述復溶液優(yōu)選為pH值為7. 0、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體 積百分比。
[0018] 其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9. 6,0. 05mol/L的碳酸 鹽緩沖液，封閉液為pH值為7. 1~7. 5,含有19Γ3%酪蛋白、0. 1~0. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液， 所述百分比為重量體積百分比。
[0019] 本發(fā)明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20 μ g/ml，每孔加 入100 μ 1，37°C避光孵育2h或4°C過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干， 然后在每孔中加入15(Γ200μ 1封閉液，37°C避光孵育l~2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用 鋁膜真空密封保存。
[0020] 本發(fā)明的檢測原理為：
[0021] 在微孔條上預包被吡蟲啉偶聯(lián)抗原，加入樣本溶液或標準品溶液后，再加入吡蟲 啉特異性抗體溶液，樣本中的吡蟲啉與酶標板上包被的吡蟲啉偶聯(lián)抗原競爭抗吡蟲啉特異 性抗體，加入酶標記抗抗體進行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光度值與吡蟲啉的含量呈 負相關，與標準曲線比較即可得到樣本中吡蟲啉的殘留量；同時根據(jù)酶標板上顏色的深淺， 與系列濃度的標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中吡蟲啉殘留量的濃度范圍。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種應用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測吡蟲啉的方法，它包括步驟：
[0023] (1)樣品前處理；
[0024] (2)用試劑盒進行檢測；
[0025] (3)分析檢測結果。
[0026] 本發(fā)明檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用競爭ELISA方法定性或定量檢測 樣品中吡蟲啉的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批 量樣品；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確 度高、準確度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便 利、檢測方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1 :吡蟲啉半抗原合成路線圖
[0028] 圖2 :吡蟲啉半抗原核磁共振氫譜圖
[0029] 圖3:試劑盒標準曲線圖

【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0031] 實施例1試劑盒組分的制備
[0032] 1、吡蟲啉半抗原的制備
[0033] 100ml二口瓶中加入吡蟲啉0. 25g，lml的二甲基甲酰胺（DMF)，水合氯化錫0. 75g 和10ml的乙醇，氮氣排空，控溫65°C反應40min，反應液顯褐色，薄層色譜（TLC)檢測反應完 全。處理：降溫至室溫，加乙酸乙酯50ml，加飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)至弱堿性，大量鹽析 出，乙酸乙酯40ml X 2次萃取渾濁液，合并有機相，鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑， 得固體產(chǎn)物〇. 22g。
[0034] 取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測定，如圖2所示，4. 7ppm左右的峰為咪唑啉環(huán)上的 兩個亞甲基信號峰，5. Oppm左右的峰為節(jié)基信號峰，7. 2-8. 7ppm為氨基與芳環(huán)混合信號 峰，說明目標半抗原合成成功。
[0035] 2、抗原的制備
[0036] 免疫原制備--吡蟲啉半抗原與牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0037] 取7mg半抗原，溶解于1ml DMF中；取戊二醛水溶液0. 1ml加入半抗原溶液中，室 溫下攪拌24h，即可得到反應液A ;稱取牛血清白蛋白（BSA) 30mg，使之充分溶解在2. 7ml 0. lmol/L碳酸鹽緩沖液（CB) (pH 9. 6)中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室 溫下攪拌24h，用5mol/L的硼氫化鈉水溶液0· 2ml還原反應4h，用0· 01mol/L磷酸緩沖液 (PBS) 4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質(zhì)；分裝，于-20°C保存?zhèn)?用。
[0038] 包被原制備--吡蟲啉半抗原與卵清蛋白（OVA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0039] 取7mg半抗原，溶解于1ml DMF中；取戊二醛水溶液0. 1ml加入半抗原溶液中，室 溫下攪拌24h，即可得到反應液A ;稱取OVA 30mg，使之充分溶解在2. 7ml 0. lmol/L CB(pH 9. 6)中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用5M的硼氫化鈉水 溶液0. 2ml還原反應4h，用0. 01mol/L PBS 4?透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應 的小分子物質(zhì)；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040] 3、吡蟲啉單克隆抗體的制備
[0041] 動物免疫：將上述步驟得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為 150 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。
[0042] 細胞融合和克隆化：小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按8:1 (數(shù)量配比η匕 例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限 稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌吡蟲啉單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0043] 細胞凍存和復蘇：將單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成IX 106個/ml的細胞懸 液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后， 移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0044] 單克隆抗體的生產(chǎn)與純化：將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只，7天后 腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細胞株5X 105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸 銨法進行腹水純化，-20°C保存。
[0045] 4、羊抗鼠抗抗體的制備
[0046] 以羊為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體。
[0047] 5、酶標記抗抗體的制備
[0048] 將羊抗鼠抗抗體與辣根過氧化物酶（HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯(lián)。傳 統(tǒng)的過碘酸鈉法要求反應體系中酶與抗體的摩爾濃度比為4:1，由于辣根過氧化物酶在強 氧化作用下產(chǎn)生許多與抗體結合的位點，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當了連接各分 子的橋梁，降低了酶標記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體。為了解決這個問 題，我們將傳統(tǒng)的方法進行了改良，BP :
[0049] (1)省去了氨基的封閉過程，因為能產(chǎn)生自身氨基連接的氨基實際很少；
[0050] (2)降低辣根過氧化物酶與抗體的摩爾濃度比率至2:1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方 法簡便，對酶活性的損失減少。
[0051] 6、酶標板的制備
[0052] 用包被緩沖液將包被原稀釋成20 μ g/ml，每孔加入100 μ 1，37°C避光孵育2h，傾 去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200 μ 1封閉液，37°C避 光孵育2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。
[0053] 實施例2檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建
[0054] 組建檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分：
[0055] (1)包被吡蟲啉偶聯(lián)抗原的酶標板；
[0056] (2)吡蟲啉標準品溶液 6 瓶，濃度分別為(^g/L、4Pg/L、12Pg/L、36Pg/L、108Pg/L、 324μδ/? ；
[0057] (3)吡蟲啉單克隆抗體工作液；
[0058] (4)用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；
[0059] (5)底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化脲，B液為四甲基聯(lián)苯胺；
[0060] (6)終止液為2mol/L硫酸；
[0061] (7)洗滌液為pH值為7. 4,含有0· 5%?L 0%吐溫-20、0· 01%。?03%。疊氮化鈉防 腐劑、0. 1、. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；
[0062] (8)復溶液為pH值為7. 0、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百 分比。
[0063] 實施例3蔬菜、水果樣品中吡蟲啉的檢測
[0064] 1、樣品前處理
[0065] 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取2. 0±0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，分別加入 2ml 2mol/L氫氧化鈉溶液，10ml乙酸乙酯，用渦旋儀渦旋5min，3000g以上，室溫（20-25°C ) 離心5min ;移取lml上層有機相至15ml干凈玻璃試管中，于（50-60°C)水浴氮氣/空氣流 下吹干；加入lml復溶工作液，潤動3min ;取50ul用于分析。
[0066] 2、用試劑盒檢測
[0067] 向包被有吡蟲啉偶聯(lián)抗原的酶標板微孔中加入吡蟲啉標準品溶液或經(jīng)前處理的 樣品溶液50 μ 1/孔，再加入吡蟲啉單克隆抗體50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后 置25°C避光環(huán)境中反應30min ;倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250 μ 1洗滌液充分洗滌4飛次，每 次間隔l〇s，用吸水紙拍干；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體100 μ 1/孔，輕輕振 蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應30min，取出洗板；每孔加入底物顯色液A 液過氧化氫50 μ 1，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺（TMB) 50 μ 1，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋 板后置25°C避光顯色15min，每孔加入終止液2mol/L硫酸50 μ 1，輕輕振蕩混勻，用酶標儀 波長設定在450nm處，測定每孔吸光度值（0D值)。
[0068] 3、檢測結果分析
[0069] 標準品或樣本的平均吸光度值(雙孔）除以第一個標準品（0標準）的平均吸光度 值，再乘以100%，得到標準品或樣本的百分吸光度值。以標準品百分吸光率為縱坐標，以吡 蟲啉標準品濃度（ppb)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中， 從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中吡蟲啉實際濃 度。
[0070] 實施例4吡蟲啉技術參數(shù)的確定試驗
[0071] 1、試劑盒靈敏度和檢測限
[0072] 按照常規(guī)方法測定試劑盒靈敏度，試劑盒標準曲線最低點為4μ g/L，標準曲線的 范圍為4?324 μ g/L，IC5(I (50%抑制濃度）浮動范圍為1(Γ16 μ g/L ;對20份樣品進行檢測， 從標準曲線上查出對應于各百分吸光度值的濃度，以20份樣本濃度的平均值加上3倍標準 差表示檢測限，結果得該方法對樣本的檢測限為20 μ g/kg。
[0073] 2、樣本精密度和準確度試驗
[0074] 以回收率作為準確度評價指標，重復測定某一濃度樣品的檢測結果相對標準偏差 (RSD%)作為精密度評價指標。計算公式為：回收率（％)=實際測定值/理論值X100%，其 中理論值為樣品的添加濃度；相對標準偏差RSD% = SD/XX 100%，其中SD為標準偏差，X為 測定數(shù)據(jù)的平均值。
[0075] 按100M€/kg、300Pg/kg、500Pg/kg三個濃度批蟲啉分別對蔬菜和水果樣品進行添 加回收測定，每個樣品做4個平行，用三批不同試劑進行測定，計算樣品的平均回收率及精 密度結果見下表。
[0076] 表1 蔬菜精密度及準確度試驗
[0077]

【權利要求】
1. 一種檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于包括：包被有包被原的酶標板、特 異性抗體、酶標記物、吡蟲啉標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原 為吡蟲啉偶聯(lián)抗原，所述酶標記物為酶標記抗抗體。
2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述吡蟲啉偶聯(lián)抗原是由吡蟲啉半抗原與 載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋 白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。
3. 如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述吡蟲啉半抗原是由氧化還原反應得 至IJ，分子結構式為：
4. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述吡蟲啉特異性抗體是以吡蟲啉偶聯(lián)抗 原作為免疫原制備獲得，所述吡蟲啉特異性抗體可為吡蟲啉單克隆抗體或吡蟲啉多克隆抗 體。
5. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗 體。
6. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶 或細菌提取堿性磷酸酯酶，當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液A液為過氧化氫或 過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為l~2mol/L的硫酸或鹽酸 緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液，終止液 為]_~2mol/L氫氧化鈉。
7. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述洗滌液為pH值為7. 4,含有0. 59Γ1. 0% 吐溫-20、0. 01%。、. 03%。疊氮化鈉防腐劑、0. 1、. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述復溶液為 pH值為7. 0、0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
8. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述吡蟲啉標準品溶液的濃度分別為OPg/ L、4Pg/L、12Pg/L、36Pg/L、108Pg/L、324Pg/L。
9. 一種檢測樣品中吡蟲啉含量的方法，包括步驟： (1) 樣品前處理； (2) 用權利要求Γ8任一項所述的試劑盒進行檢測； (3) 分析檢測結果。
【文檔編號】G01N33/68GK104101712SQ201310123319
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月10日 優(yōu)先權日:2013年4月10日
【發(fā)明者】何方洋, 萬宇平, 羅曉琴, 楊學林, 馮靜, 賈芳芳, 楊爍, 齊向武 申請人:北京勤邦生物技術有限公司