一種用于檢測己烷雌酚的免疫電化學(xué)傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測己烷雌酚的納米復(fù)合物免疫電化學(xué)傳感器及其應(yīng)用。所述傳感器包括：基底電極，沉積于基底電極外表面的納米金膜及修飾于納米金膜外表面的石墨烯/己烷雌酚復(fù)合物膜。本發(fā)明提供的電化學(xué)傳感器制備方法簡單，穩(wěn)定性好，靈敏度高，使用方便，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場快速檢測己烷雌酚，其檢測限為0.2ng/mL，線性范圍為0～4000ng/mL。
【專利說明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于分析和檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種己烷雌酚的檢測裝置，更具體的說是 涉及一種用于檢測己烷雌酚的免疫電化學(xué)傳感器及其應(yīng)用。 -種用于檢測己烷雌酚的免疫電化學(xué)傳感器 【背景技術(shù)】
[0002] 己烷雌酚（hexestrol，HEX)是一種人工合成的雌激素類似物，具有促進(jìn)動物生 長、提高飼料轉(zhuǎn)化率和減少脂肪合成等作用，20世紀(jì)60年代曾為各國官方批準(zhǔn)使用的促生 長劑，用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。但是濫用己烷雌酚會導(dǎo)致動物生理系統(tǒng)功能失調(diào)甚至不可逆的病 變，并通過食物鏈最終危害人類健康，長期攝入會干擾人體正常的激素平衡，導(dǎo)致機(jī)體代謝 紊亂、發(fā)育異常腫瘤、女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位、胎兒畸形等嚴(yán)重的問題，在我國和歐美 等國家都禁止在動物養(yǎng)殖過程中使用。目前應(yīng)用最多的己烷雌酚的測定方法主要有液相色 譜、液質(zhì)連用法、高效液相色譜等。但是這些分析方法需要大型分析儀器，過程操作繁瑣，不 能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測，有必要研究建立更加高效、快速、靈敏的分析測試方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了 一種用于快速檢測己烷雌酚的免疫電化學(xué)傳感器及其在檢測實(shí) 際樣品中所含己烷雌酚的應(yīng)用，具有較低的檢出限（〇.2ng/mL)和較寬的線性范圍（0? 4000ng/mL)。
[0004] 所述的用于檢測己烷雌酚的免疫電化學(xué)傳感器包括：基底電極，其特征在于所述 的基底電極表面沉積納米金后，繼續(xù)在納米金膜表面修飾石墨烯/己烷雌酚復(fù)合物。
[0005] 本發(fā)明通過以下方式實(shí)現(xiàn)己烷雌酚的檢測：將修飾好的傳感器浸入總體積為 50yL的含有不同濃度的游離己烷雌酚，和效價(jià)濃度為1 : 6400的己烷雌酚的單克隆抗體 的磷酸緩沖溶液中，在37°C孵育25min，用磷酸緩沖溶液沖洗后于2mmol/L的K 3Fe(CN)6溶 液中進(jìn)行差分脈沖伏安（DPV)掃描。
[0006] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著己烷雌酚在孵育液中濃度的增加，DPV峰電流增大。定義在只 含有己烷雌酚抗體的孵育液中孵育的修飾傳感器的DPV峰電流為L，含有游離雌酚的標(biāo)樣 的DPV峰電流為I x，峰電流的增加值Λ I等于含有游離雌酚的標(biāo)樣的響應(yīng)電流Ix與空白標(biāo) 樣的響應(yīng)電流1〇的差值。將所述Λ I與標(biāo)準(zhǔn)溶液中雌酚的濃度C繪制成Λ Ι-C工作曲線， 采用線性回歸法得到Λ Ι-C線性回歸方程。己烷雌酚濃度在范圍內(nèi)0?4000ng/mL與Λ I 成正比，斜率為0. 00181，線性相關(guān)系數(shù)為0. 99045。
[0007] 本發(fā)明有如下的有益效果：由于石墨烯有大的比表面積且能夠很好的促進(jìn)生物 電活性分子的電子傳遞，納米金顆粒具有比表面積大、生物親和性高等優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明 的固定己烷雌酚抗體的電化學(xué)傳感器可以在常溫下，穩(wěn)定而迅速的檢測殘留己烷雌酚的濃 度。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1為納米金/石墨烯/己烷雌酚修飾的免疫電化學(xué)傳感器在含有效價(jià)濃度 為1 : 6400的己烷雌酚的單克隆抗體和不同濃度的游離的己烷雌酚（a)4000ng/mL， (b)3000ng/mL, (c) 1000ng/mL, (d)100ng/mL, (e)10ng/mL, (f)0ng/mL，的孵育液中孵育后， 在2mmol/L的K3[Fe(CN)6]的PBS溶液中的DPV曲線圖。插入圖為響應(yīng)電流的變化Λ I與 己烷雌酚濃度的線性曲線圖。 【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面對本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施給出了詳細(xì)的實(shí)施方案和具體的操作過程。但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。
[0010] 實(shí)施例1免疫電化學(xué)傳感器的制備
[0011] 1)玻碳電極處理：直徑為3mm的玻碳傳感器用分別用1. 0 μ m和0. 3 μ m的A1203 粉乳液打磨拋光后，分別在乙醇和水中各超聲清洗3min ;
[0012] 2)納米金沉積：清洗后的玻碳傳感器用電化學(xué)方法沉積金納米粒子，于100mg/L 的HAuC14溶液中，在-0. 2V電勢下恒電位掃描60s ;
[0013] 3)石墨烯懸浮液的配制：準(zhǔn)確稱取5g石墨烯樣品于2ml水中，超聲分散lh，制得 石墨稀懸浮液；
[0014] 4)傳感器表面修飾：將4uL石墨烯懸浮液與2uL濃度為0. 2mg/mL的己烷雌酚溶 液混合，滴涂于步驟3)制得的玻碳傳感器表面，40°C下烘干30min，得到所述免疫電化學(xué)傳 感器。
[0015] 實(shí)施例2對己烷雌酚的檢測
[〇〇16] 將修飾好的傳感器浸入總體積為50μ L的含有不同濃度的游離己烷雌酚，和效價(jià) 濃度為1 : 6400的己烷雌酚的單克隆抗體的磷酸緩沖溶液中，在37°C孵育40min，用磷酸 緩沖溶液沖洗后于2mm〇l/I^^K3Fe(CN)6溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安（DPV)掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯示，隨著己烷雌酚在孵育液中濃度的增加，DPV峰電流增大。
[0017] 工作曲線的繪制：在不同的己烷雌酚濃度下，所述免疫電化學(xué)傳感器浸入含有 K3 [Fe (CN) 6]的PBS緩沖液得DPV圖。隨著己烷雌酚濃度在孵育液中的增加，DPV峰電流增 大。也就是說，游離的己烷雌酚濃度越高，固定在傳感器上的己烷雌酚分子結(jié)合的抗體越 少。定義在只含有己烷雌酚抗體的孵育液中孵育的修飾傳感器的DPV峰電流為L，含有游 離己烷雌酚標(biāo)樣的DPV峰電流為I x，峰電流的增加值△ I等于含有游離雌酚的標(biāo)樣的響應(yīng) 電流Ix與空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流1〇的差值。將所述△ I與標(biāo)準(zhǔn)溶液中雌酚的濃度C繪制成 Λ Ι-C工作曲線，采用線性回歸法得到Λ Ι-C線性回歸方程。己烷雌酚濃度在范圍內(nèi)0? 4000ng/mL與Λ I成正比，斜率為0. 00181，線性相關(guān)系數(shù)為0. 99045。上述檢測方法的檢測 限采用能觀察到最小峰電流變化值Λ I處所對應(yīng)的濃度C來計(jì)算，為0. 2ng/mL。
[0018] 實(shí)施例3豬肉樣品中加標(biāo)己烷雌酚的測定
[0019] 1)豬肉樣品的處理：稱取1±0. 0050g豬肉于到10mL的樣品管中，加入己烯雌酚 標(biāo)準(zhǔn)液，和3mL乙腈-丙酮提取液（V : V = 4 : 1)，混合物超聲振蕩30分鐘，于2000r/m 下離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，殘?jiān)?mL的相同提取液重復(fù)提取1次，上清液 合并在氮吹管中。提取物在氮吹條件下于50°C溫度下濃縮蒸發(fā)，濃縮物加入lmL的pH為 7. 4磷酸緩沖溶液溶解后用于電化學(xué)分析。
[0020] 2)豬肉樣品中加標(biāo)己烷雌酚的測定：分別取等量的不同豬肉提取液樣品，和己烷 雌酚抗體溶液及磷酸緩沖溶液混合配成孵育液，使得總體積為50 μ L，且己烷雌酚抗體濃度 均相等。將納米金/己烷雌酚/石墨烯復(fù)合物修飾的免疫電化學(xué)傳感器浸入孵育液中，在 37°C孵育25分鐘，用磷酸緩沖溶液沖洗后于2mmol/L的K 3[Fe(CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖 伏安（DPV)掃描。定義空白樣品的峰電流為L，其他樣品的峰電流I x，計(jì)算ΛΙ =込-Ip通 過采用與實(shí)施例1中相同的方法得到的DPV峰電流差值Λ I與己烷雌酚的濃度C的Λ I-C 工作曲線，得到己烷雌酚的濃度，檢測回收率結(jié)果如表1。
[0021] 表1為免疫傳感器檢測加標(biāo)豬肉中的己烷雌酚濃度的回收率
[0022]
【權(quán)利要求】
1. 一種用于己烷雌酚檢測的納米復(fù)合物免疫電化學(xué)傳感器，包括：基底電極，沉積于 基底電極外表面的納米金膜以及修飾于納米金膜外表面的石墨烯/己烷雌酚復(fù)合物膜。
2. -種將權(quán)利要求1所述的電化學(xué)傳感器應(yīng)用于實(shí)際樣品中所含己烷雌酚檢測的方 法，其特征在于，所述的電化學(xué)傳感器上用納米材料固定了己烷雌酚。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的實(shí)際樣品中所含己烷雌酚檢測的方法，其特征在于，可用于 各種動物源性食品包括豬、牛、羊等常用動物的肉制品、內(nèi)臟以及乳制品等中含有己烷雌酚 的檢測。
【文檔編號】G01N27/48GK104101641SQ201310123228
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月9日
【發(fā)明者】王傳現(xiàn), 田楨干, 何宇平, 邵科峰, 陳昌云, 趙波 申請人:王傳現(xiàn), 田楨干, 何宇平