檢測β-興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測方法及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于免疫檢測【技術(shù)領(lǐng)域】的檢測β-興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測方法及其試劑盒。該試劑盒包括：β-興奮劑特異性抗體、包被有β-興奮劑特異性抗體的酶標(biāo)板、β-興奮劑辣根過氧化物酶標(biāo)記物、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和濃縮樣品稀釋液。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高精確度、高準(zhǔn)確度、對儀器設(shè)備要求低、試劑保存期長、自動化程度高、無放射性同位素污染等優(yōu)點，可在動物源性食品及飼料產(chǎn)品檢測中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】檢測β-興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測方法及其試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及檢測β-興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]β興奮劑是一種人和獸醫(yī)作為治療哮喘的藥物。在牲畜中超劑量使用可以將牲畜的脂肪組織轉(zhuǎn)化為肌肉組織，由于能夠顯著改善脂肪率和生產(chǎn)效率，β興奮劑往往被濫用于畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中。近年來已經(jīng)有沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林中毒的病例報道。
[0003]在β興奮劑中，沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林毒性較大，檢測這些物質(zhì)一般將沙丁胺醇與載體合成抗原或半抗原，免疫動物，獲得多克隆抗體，可與其他β興奮劑有交叉反應(yīng)，進(jìn)而也可以檢測其他β興奮劑，但是，目前，尚沒有一種可以同時檢測沙丁胺醇、妥布特羅、溴布特羅、克倫特羅、西布特羅、馬布特羅、特布他林這7種β興奮劑的異性抗體。
[0004]傳統(tǒng)的試劑盒檢測用顯色劑一般將它調(diào)配成Α、B兩種液體，當(dāng)需要顯色時就分別加入A和B液，當(dāng)混合液與實驗中復(fù)合物反應(yīng)就會產(chǎn)生顯色效果。A液一般由PBS緩沖液、檸檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、過氧化氫組成，B液一般由PBS緩沖液、檸檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300、硫代硫酸鈉組成；使用時需要將兩種液體按比例混合后才能使用，且兩種液體都需要避光保存，使用起來比較麻煩。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測β -興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0006]本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測β -興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測的方法。
[0007]—種檢測β -興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，該試劑盒包括:β -興奮劑特異性抗體、包被有β_興奮劑特異性抗體的酶標(biāo)板、β_興奮劑辣根過氧化物酶標(biāo)記物、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
[0008]所述顯色劑為過氧化氫或過氧化脲，鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺與穩(wěn)定劑K按體積比5: 5: I混合而成的溶液，穩(wěn)定劑K、含酶穩(wěn)定劑AH和酶保護(hù)劑均購自美國International Diagostica System 公司。
[0009]所述的酶標(biāo)物稀釋液為含酶穩(wěn)定劑AH和酶保護(hù)劑KEN的磷酸鹽緩沖液。
[0010]所述的終止液為2mol/L的鹽酸溶液。
[0011 ] 所述的濃縮樣品稀釋液為含I % BSA的5倍濃縮磷酸鹽緩沖液。
[0012]所述β -興奮劑特異性抗體是以特異免疫原免疫動物制得，所述特異免疫原是將克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、溴布特羅、妥布特羅和西布特羅通過戊二醛法交聯(lián)到載體蛋白上制成。
[0013]所述載體蛋白為多聚賴氨酸、牛血清白蛋白、雞丙種球蛋白、人血丙種球蛋白或卵清蛋白。
[0014]所述動物為兔、鼠或羊。
[0015]9、一種檢測興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行:
[0016](I)將試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫,恢復(fù)時間為1-5小時；
[0017](2)預(yù)先進(jìn)行編號，標(biāo)記Btl、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，進(jìn)行雙孔檢測；
[0018](3)從包被有β -興奮劑特異性抗體的酶標(biāo)板上取下所需數(shù)量的微孔，將
[0019]多余的微孔重新密封并放回2?8°C保存；
[0020](4)將酶標(biāo)物、濃縮樣品稀釋液、清洗液根據(jù)稀釋倍數(shù)用蒸餾水配制成工作液；
[0021](5)在B?？字屑尤?0 μ L0.0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50 μ L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在各樣品孔中加入50 μ L樣品溶液；
[0022](6)在所有孔中加入100 μ L的酶標(biāo)物，晃動反應(yīng)Ι-lOs，室溫下孵育30min ；
[0023](7)倒掉微孔中的液體，在所有微孔中加滿清洗液，用微量移液器在每個微孔中加Λ 100 μ L顯色劑,晃動酶標(biāo)板使之混勻；
[0024](8)室溫下顯色I(xiàn)Omin,每孔中加入100 μ L終止液,混勻；
[0025](9)在450nm下檢測吸光度,分析計算檢測結(jié)果。
[0026]本發(fā)明的有益效果:本試劑盒主要采用直接競爭酶聯(lián)免疫法可同時定性或定量檢測7種β興奮劑的含量。β_興奮劑特異性抗體采用特制的免疫原免疫大白兔得到，該免疫原通過7種β_興奮劑與載體蛋白采用戊二醛偶聯(lián)方法得到。該試劑盒室溫下即可進(jìn)行檢測，無需保溫37°C。顯色液為混合顯色液，無需分次單獨添加，減少了操作程序。此外，本試劑盒的顯色過程無需避光，直接在室內(nèi)顯色I(xiàn)Omin即可。全部檢測過程僅需40min。酶標(biāo)物一凍干粉形式提供，穩(wěn)定性更好。另外主要試劑以工作液形式提供，可以減少檢測的操作步驟，為使用者節(jié)省時間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高精確度、高準(zhǔn)確度、對儀器設(shè)備要求低、試劑保存期長、自動化程度高、無放射性同位素污染等優(yōu)點，可在動物源性食品及飼料產(chǎn)品檢測中發(fā)揮重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為檢測β -興奮劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0029]實施例1 β -興奮劑特異性抗體的制備
[0030]克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、溴布特羅、妥布特羅和西布特羅各取
0.lmol，溶于50ml PBS (0.01mol/L)溶液中，充分溶解后逐滴加入250 μ L25%的戊二醛，反應(yīng)30min。另稱取多聚賴氨酸(或者牛血清白蛋白，或者雞丙種球蛋白，或者卵清蛋白)，溶于13mL PBS(0.01mol/L)中逐滴加入上述反應(yīng)液，室溫下攪拌反應(yīng)3h。
[0031]取50cm的透析袋,于沸水中煮沸5min,再用60°C的去離子水中沖洗3min,保存在4°C的去離子水中備用。
[0032]將人工抗原混合液移入透析袋中，用2x2L的0.0lM pH7.4的PBS緩沖液和2x2L的去離子水透析3天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，得到偶聯(lián)有7種β-興奮劑的特異免疫原。
[0033]免疫動物選用新西蘭大白兔，免疫前耳緣靜脈取血5-10mL，作為陰性血清對照。初次免疫將0.5mg的特異免疫原與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化后，采用背部多點皮下注射新西蘭大白兔，三周后取相同劑量免疫原與弗式不完全佐劑混合后同法進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每兩周加強(qiáng)免疫一次，共免疫6次后，血清效價達(dá)到很高時，最后一次加強(qiáng)免疫，4d后頸動脈采全血。
[0034]采全血后，3000rpm離心20min，取上層抗血清，與等量甘油混合后保存于_20°C冰箱內(nèi)。
[0035]將5mL抗血清與等體積的生理鹽水混合后，邊攪拌邊逐滴加入IOmL的飽和硫酸銨。4°C冰箱靜置過夜。第二天，4000rpm離心20min，棄上清。沉淀少量生理鹽水重新溶解后，放入透析袋中于4°C進(jìn)行透析，以出去殘留的硫酸銨。透析完后冷凍干燥，得到純化的的β興奮劑特異抗體，與等量甘油混合后_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0036]實施例2 β -興奮劑抗血清效價的測定
[0037]采用直接ELISA法進(jìn)行測定。酶標(biāo)反應(yīng)板包被β興奮劑特異抗體、洗滌、封閉，并以同樣的稀釋度的陰性血清為對照，第I行I至12孔依次加入倍比稀釋的β興奮劑過氧化物酶結(jié)合物，均為IOOuL/孔，22-23°C溫育10分鐘；再加入辣根過氧化物酶(ARP)底物IOOuL/孔，經(jīng)過10分鐘孵育，終止反應(yīng)后測定OD45tl值?？贵w的OD450值與相同稀釋度的陰性血清OD45tl值之比大于2的最大稀釋度定為β興奮劑特異抗體的效價。經(jīng)測定β興奮劑特異抗體的效價為1000。
[0038]實施例3棋盤滴定法確定抗體包被濃度和酶標(biāo)抗原工作濃度
[0039]通過棋盤滴定法對IC5tl值、最大吸光度值和樣品添加回收率的比較，確定抗體的包被濃度和酶標(biāo)抗原的工作濃度。
[0040]表1最大吸光度值(0D值)比較
【權(quán)利要求】
1.一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:β-興奮劑特異性抗體、包被有β-興奮劑特異性抗體的酶標(biāo)板、β-興奮劑辣根過氧化物酶標(biāo)記物、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)物稀釋液、顯色劑、清洗液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述顯色劑為過氧化氫或過氧化脲，鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺與穩(wěn)定劑K按體積比5:5:1混合而成的溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)物稀釋液為含酶穩(wěn)定劑AH和酶保護(hù)劑KEN的磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述的終止液為2mol/L的鹽酸溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述的濃縮樣品稀釋液為含1% BSA的5倍濃縮磷酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述β -興奮劑特異性抗體是以特異免疫原免疫動物制得，所述特異免疫原是將克倫特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、溴布特羅、妥布特羅和西布特羅通過戊二醛法交聯(lián)到載體蛋白上制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述載體蛋白為多聚賴氨酸、牛血清白蛋白、雞丙種球蛋白人血丙種球蛋白、或卵清蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種檢測β-興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述動物為兔、鼠或羊。
9.一種檢測β_興奮劑類的一步法酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行: (1)將試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫，恢復(fù)時間為1-5小時； (2)預(yù)先進(jìn)行編號，標(biāo)記Β0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，進(jìn)行雙孔檢測； (3)從包被有β_興奮劑特異性抗體的酶標(biāo)板上取下所需數(shù)量的微孔，將 多余的微孔重新密封并放回2?8°C保存； (4)將酶標(biāo)物、濃縮樣品稀釋液、清洗液根據(jù)稀釋倍數(shù)用蒸餾水配制成工作液； (5)在BO孔中加入50μ L0.0ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50 μ L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在各樣品孔中加入50 μ L樣品溶液； (6)在所有孔中加入100μ L的酶標(biāo)物，晃動反應(yīng)Ι-lOs，室溫下孵育30min ； (7)倒掉微孔中的液體，在所有微孔中加滿清洗液，用微量移液器在每個微孔中加入.100 μ L顯色劑,晃動酶標(biāo)板使之混勻； (8)室溫下顯色I(xiàn)Omin,每孔中加入100μ L終止液,混勻； (9)在450nm下檢測吸光度，分析計算檢測結(jié)果。
【文檔編號】G01N33/544GK103592434SQ201310091146
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月21日
【發(fā)明者】徐華莉, 李亮, 張明洲, 王旻子, 魏建良, 程曄 申請人:杭州迪恩科技有限公司