專(zhuān)利名稱(chēng)：一種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細(xì)管電色譜測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及ー種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細(xì)管電色譜測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
吸煙引起的危害是當(dāng)今世界最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。如何深入研究煙堿在體內(nèi)的代謝情況，發(fā)展高效、高選擇性的分離手段，分離煙堿代謝物(降煙堿、降可替寧、3-羥 基可替寧、N-氧化可替寧、N-氧化煙堿、可替寧糖苷)，對(duì)于客觀反應(yīng)煙氣感受量是很有必要。目前，煙堿及其代謝產(chǎn)物含量的測(cè)定主要采用放射免疫法、氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜或高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等方法。放射免疫法需要使用兩種放射性同位素125I和3H,方法特異、靈敏且易于操作，但放射免疫法不僅需要煙堿的抗體，還需要煙堿各種代謝物的抗體，而制備抗血清是個(gè)技術(shù)瓶頸。色譜法技術(shù)特異性好且靈敏度高，可以同時(shí)測(cè)定體液中的煙堿和可替寧等，與放射免疫法相比，色譜法不易受其它因素的影響。由于氣質(zhì)聯(lián)用儀器只能監(jiān)控?zé)焿A和可替寧等少數(shù)代謝物，且質(zhì)譜儀的成本昂貴，不利于推廣；高效液相色譜法洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，且使用大量對(duì)人體有毒有害的有機(jī)溶齊U，并易對(duì)環(huán)境造成污染。因此，創(chuàng)新發(fā)展高效、高選擇性分離手段和靈敏的檢測(cè)模式，已成為測(cè)定煙堿及其結(jié)構(gòu)相似的代謝物，準(zhǔn)確判定人體實(shí)際煙氣感受量的關(guān)鍵問(wèn)題。毛細(xì)管電色譜(CEC)技術(shù)作為新興分析技術(shù)，為提高分離效率和分離選擇性提供了極好的契機(jī)。在CEC中，煙堿化合物在適當(dāng)?shù)臈l件下帶有正電荷，帶電荷的煙堿物質(zhì)在CEC中的輸運(yùn)不僅在固定相和流動(dòng)相間分配，而且受到電滲流驅(qū)動(dòng)作用，在分離綜合了 CE和HPLC的分離機(jī)制，電泳遷移對(duì)整體輸運(yùn)過(guò)程的貢獻(xiàn)也占有非常重要的地位。毛細(xì)管電色譜柱作為ー種柱內(nèi)原位聚合或填充的固定相，毛細(xì)管電色譜整體柱基質(zhì)表面性質(zhì)多樣化、多孔性能優(yōu)越，柱容量高，具有分離快速、高效、高容量的特點(diǎn)，是應(yīng)復(fù)雜生物樣品高通量分析需要而發(fā)展起來(lái)的ー種新型色譜微分離手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提供的一種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細(xì)管電色譜測(cè)定方法。本發(fā)明的研究機(jī)理在于針對(duì)堿性煙堿及其代謝物在硅膠基團(tuán)上的不可逆吸附問(wèn)題，將功能化的整體柱引入CEC分離模式，在毛細(xì)管柱中修飾內(nèi)鹽兩性表面活性剤、或引入有機(jī)無(wú)機(jī)雜化多面體倍半硅氧烷、或?qū)ΤＲ?guī)無(wú)機(jī)硅膠進(jìn)行端基動(dòng)態(tài)修飾，抑制極性煙堿的吸附作用，在功能化毛細(xì)管硅膠柱的基礎(chǔ)上，發(fā)展ー種用于煙堿及其代謝物分離的毛細(xì)管電色譜方法。本發(fā)明所述的毛細(xì)管硅膠功能柱由三甲銨こ內(nèi)酯修飾的雜化硅膠毛細(xì)管柱、端基封尾的十八烷基硅烷鍵合硅膠毛細(xì)管柱或多面體倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羥こ酯聚合柱中的ー種組成,通過(guò)在毛細(xì)管柱末端施加負(fù)電荷高壓和進(jìn)樣端上施加液相泵輔助壓力，實(shí)現(xiàn)電泳分離和毛細(xì)管液相色譜分離的雙重作用，實(shí)現(xiàn)煙堿及其代謝物(包括煙堿、降煙堿、N-氧化煙堿、去甲基可替寧、3-羥基可替寧、可替寧、可替寧-葡(萄)糖苷、N-氧化可替寧)的連續(xù)分離。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
一種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細(xì)管電色譜測(cè)定方法，包括毛細(xì)管電色譜分離測(cè)定中使用的毛細(xì)管硅膠功能柱，其中毛細(xì)管硅膠功能柱為經(jīng)過(guò)處理的特定毛細(xì)管硅膠功能柱，所述特定毛細(xì)管硅膠功能柱由三甲銨こ內(nèi)酯修飾的雜化硅膠毛細(xì)管柱、端基封尾的十八烷基硅烷鍵合硅膠毛細(xì)管柱或多面體倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羥こ酯共聚聚合柱中的任意一種組成；同時(shí)在毛細(xì)管硅膠功能柱末端施加負(fù)電荷高壓和進(jìn)樣端上施加液相泵輔助壓力，在電泳分離和毛細(xì)管液相色譜分離的雙重作用下實(shí)現(xiàn)煙堿及其代謝物 的分離。所述煙堿及其代謝物化合物包括煙堿、降煙堿、N-氧化煙堿、去甲基可替寧、3-羥基可替寧、可替寧、可替寧-葡(萄)糖苷、N-氧化可替寧。本發(fā)明將功能化的整體柱引入CEC分離模式，篩選適合于煙堿及其代謝產(chǎn)物分離的分離柱，針對(duì)堿性煙堿在硅膠基團(tuán)上的不可逆吸附問(wèn)題，在毛細(xì)管柱中修飾內(nèi)鹽兩性表面活性剤、或引入有機(jī)無(wú)機(jī)雜化多面體倍半硅氧烷、或?qū)ΤＲ?guī)無(wú)機(jī)硅膠進(jìn)行端基動(dòng)態(tài)修飾，抑制極性煙堿的吸附作用，同時(shí)，強(qiáng)化整體柱電滲流，加快分離速度。該技術(shù)綜合應(yīng)用了電泳和色譜模式分離待測(cè)物，快速、高效。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明所述的毛細(xì)管硅膠功能柱(包括三甲銨こ內(nèi)酯修飾的雜化硅膠毛細(xì)管柱、端基封尾的十八烷基硅烷鍵合硅膠毛細(xì)管柱或多面體倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羥こ酯共聚聚合柱)，通過(guò)修飾內(nèi)鹽兩性表面活性剤、或引入不含硅羥基的有機(jī)無(wú)機(jī)雜化多面體倍半硅氧烷、或通過(guò)三こ胺修飾屏蔽常規(guī)無(wú)機(jī)硅膠硅羥基端基，抑制負(fù)電荷性的硅羥基基團(tuán)和正電荷煙堿及其代謝物的靜電吸附作用，消除商品化硅膠柱和常規(guī)硅膠柱分離堿性物質(zhì)存在的拖尾和柱吸附問(wèn)題，加快分離速度。該方法同傳統(tǒng)的基于反相色譜作用的電色譜技術(shù)比較，大幅度降低了陽(yáng)離子電荷的煙堿物質(zhì)在硅膠基質(zhì)或硅羥基基團(tuán)上的不可逆作用，而且通過(guò)在毛細(xì)管柱末端施加負(fù)電荷高壓和進(jìn)樣端上施加液相泵輔助壓力，大幅度提高了煙堿及其代謝物的色譜洗脫效率和分離柱效，使得該電色譜技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)煙堿及其代謝物(包括煙堿、降煙堿、N-氧化煙堿、去甲基可替寧、3-羥基可替寧、可替寧、可替寧-葡(萄)糖苷、N-氧化可替寧)的連續(xù)分離。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以下結(jié)合實(shí)施例做進(jìn)ー步描述，但并不限制本發(fā)明。實(shí)施例I
應(yīng)用三甲銨こ內(nèi)酯修飾的雜化硅膠毛細(xì)管柱，以こ腈三こ胺磷酸鹽緩沖液(5. Ommol/L,pH 7. 0)=50:50為流動(dòng)相,分離電壓_20kV,反壓閥IOOpsi,在毛細(xì)管柱末端施加負(fù)電荷高壓和進(jìn)樣端上施加液相泵輔助壓力，對(duì)煙堿代謝物進(jìn)行毛細(xì)管電色譜分離，洗脫峰依次為N-氧化可替寧、可替寧-葡(萄)糖苷、可替寧、3-羥基可替寧、去甲基可替寧、N-氧化煙堿、降煙堿。實(shí)施例2:
應(yīng)用O. 01%三こ胺進(jìn)行端基封尾處理的十八烷基硅烷鍵合硅膠毛細(xì)管柱，以こ腈磷酸鹽緩沖液(7. O mmol/L,pH 3. 5)=80:20為流動(dòng)相，分離電壓_10kV，反壓閥IOOOpsi，在毛細(xì)管柱末端施加負(fù)電荷高壓和進(jìn)樣端上施加液相泵輔助壓力，對(duì)煙堿代謝物進(jìn)行毛細(xì)管電色譜分離，洗脫峰依次為降煙堿、N-氧化煙堿、去甲基可替寧、3-羥基可替寧、可替寧、可替寧-葡(萄)糖苷、N-氧化可替寧。實(shí)施例3:
應(yīng)用多面體倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羥こ酯共聚聚合柱，以こ腈磷酸鹽 緩沖液(2. O mmol/L, pH 3.5)=90:10為流動(dòng)相，分離電壓_10kV，反壓閥250psi，在毛細(xì)管柱末端施加負(fù)電荷高壓和進(jìn)樣端上施加液相泵輔助壓カ，對(duì)煙堿代謝物進(jìn)行毛細(xì)管電色譜分離，洗脫峰依次為N-氧化可替寧、可替寧-葡(萄)糖苷、可替寧、3-羥基可替寧、去甲基可替寧、N-氧化煙堿、降煙堿。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細(xì)管電色譜測(cè)定方法，包括毛細(xì)管電色譜分離測(cè)定中使用的毛細(xì)管硅膠功能柱，其特征在于毛細(xì)管硅膠功能柱為經(jīng)過(guò)處理的特定毛細(xì)管硅膠功能柱，所述特定毛細(xì)管硅膠功能柱由三甲銨乙內(nèi)酯修飾的雜化硅膠毛細(xì)管柱、端基封尾的十八烷基硅烷鍵合硅膠毛細(xì)管柱或多面體倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羥乙酯共聚聚合柱中的任意一種組成；同時(shí)在毛細(xì)管硅膠功能柱末端施加負(fù)電荷高壓和進(jìn)樣端上施加液相泵輔助壓力，在電泳分離和毛細(xì)管液相色譜分離的雙重作用下實(shí)現(xiàn)煙堿及其代謝物的分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的適用于煙堿及其代謝物分離的毛細(xì)管電色譜測(cè)定方法，其特征在于所述煙堿及其代謝物化合物包括煙堿、降煙堿、N-氧化煙堿、去甲基可替寧、3-羥基可替寧、可替寧、可替寧-葡(萄)糖苷、N-氧化可替寧。
全文摘要
一種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細(xì)管電色譜測(cè)定方法，包括毛細(xì)管電色譜分離測(cè)定中使用的毛細(xì)管硅膠功能柱，其特征在于毛細(xì)管硅膠功能柱為經(jīng)過(guò)處理的特定毛細(xì)管硅膠功能柱，所述特定毛細(xì)管硅膠功能柱，由三甲銨乙內(nèi)酯修飾的雜化硅膠毛細(xì)管柱、端基封尾的十八烷基硅烷鍵合硅膠毛細(xì)管柱或多面體倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羥乙酯共聚聚合柱中的任意一種組成；同時(shí)在毛細(xì)管硅膠功能柱末端施加負(fù)電荷高壓和進(jìn)樣端上施加液相泵輔助壓力，在電泳分離和毛細(xì)管液相色譜分離的雙重作用下實(shí)現(xiàn)煙堿及其代謝物的連續(xù)分離。本發(fā)明綜合應(yīng)用了電泳和色譜模式分離待測(cè)物，大幅度提高了煙堿及其代謝物的色譜洗脫效率和分離柱效。
文檔編號(hào)G01N30/60GK102967675SQ20121054835
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者劉紹鋒, 劉惠民, 謝復(fù)煒, 張曉兵 申請(qǐng)人:中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院