專利名稱：檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)的時間分辨熒光免疫分析(TR-FIA)檢測試劑盒及其檢測方法，屬于時間分辨熒光免疫分析(TR-FIA)技術領域，用于動物源性食品中泰樂菌素和替米考星藥物殘留量的檢測。
背景技術：
泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)半合成大環(huán)內酯類畜禽專用抗生素，具有很強的抗菌活性，耐藥性低，抗菌譜廣，對所有的革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌、霉形體、螺旋體等均有抑制作用，尤其是對多種支原體及螺旋體也具有很強的抑制作用。在畜牧生產上，泰樂菌素(TYL)還用作飼料添加劑，促進動物生長。近年來，由于動物疾病流行，泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)在畜牧獸醫(yī)上應用最多的藥物，在獸用的抗生素中占有重要的地位。在生產中，由于不合理的使用劑量和不遵守休藥期造成泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)殘留，其殘留對消費者可產生毒性作用。我國和歐盟分別對泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)在組織中殘留也制定了最高殘留限量(MRL)。為了控制泰樂菌素和替米考星殘留，保障消費者健康，有必要建立ー種快速、有效的殘留檢測方法對其殘留進行監(jiān)測。目前在動物性食品中泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)的分析檢測方法有很多，包括高效液相色譜法(HPLC)、液質連用(LC-MS)、氣質連用(GC-MS)和ELISA。儀器檢測主要存在儀器購置費用昂貴、樣品前處理復雜、程序繁瑣費吋、檢測費用高、不能現(xiàn)場操作等缺陷，其應用受到一定限制。而時間分辨熒光免疫分析法(TR-FIA)由于其特異性強、靈敏度高、操作簡單、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點而越來越被人們所重視和采用。目前還沒有針對泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)殘留檢測的時間分辨熒光免疫分析法的專利和文獻報道。

發(fā)明內容
為解決以上技術問題，本發(fā)明的目的之ー在于提供一種檢測動物可食性組織中泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)殘留的時間分辨熒光免疫分析試劑盒。本發(fā)明的目的之ニ在于提供ー種快速簡便地檢測動物可食性組織中泰樂菌素和替米考星殘留的時間的分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，用于定量或定性地檢測動物源性食品中泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)殘留量。本發(fā)明目的之一是這樣實現(xiàn)的檢測泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關鍵在于由多孔包被板、緩沖液、去碳霉糖泰樂菌素(DES)標準品溶液、抗DES的抗體凍干品、銪標記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液所組成。 本發(fā)明目的之ニ是這樣實現(xiàn)的檢測泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測，其關鍵在于a、免疫原的制備將半抗原去碳霉糖泰樂菌素(DES)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，得到免疫原(DES-BSA)；b、包被原的制備將半抗原去碳霉糖泰樂菌素(DES)與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，得到包被原(DES-OVA)；C、單克隆抗體的制備(I)用步驟a的免疫原(DES-BSA)免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗DES的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；(2)以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得抗DES的單克隆抗體IgG，該抗體與TYL和TIL有很高交叉反應；
(3)用步驟b的包被原包被48或者96多孔包被板；d、樣品的前處理及檢測取包被有包被原(DES-OVA)的多孔包被板，加入50 ill的TYL或TIL到各自的微孔中，加50 ill以緩沖液稀釋的抗DES抗體，25°C 37°C振蕩0. 5 I小時，洗滌液洗三次，加以緩沖液稀釋的100 ill Eu3+-兔抗鼠抗體，25 °C 37°C振蕩0. 5 I小時，用洗滌液洗六次，加200 u I增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據(jù)標準曲線計算樣品中的TYL或TIL含量。上述的固相載體是多孔包被板，采用48或者96孔的多孔包被板作為固相載體。本發(fā)明主要采用時間分辨熒光免疫分析方法來檢測TYL和TIL。采用時間分辨熒光免疫分析法的技術主要有兩個方面第一，特異性單抗隆抗體制備，用偶聯(lián)的免疫原免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗DES的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得抗DES的單克隆抗體IgG。第二，Eu3+標記抗體的制備。本發(fā)明測定方法測定的基礎是標記免疫反應。包被有DES-OVA的多孔包被板，加入測試樣品到各自的微孔中，再加入抗DES抗體，振蕩反應，游離的TYL或TIL與微孔板上的DES-OVA競爭抗DES抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的TYL或TIL抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗體，進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的Eu3+-兔抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中TYL和TIL的量。有益效果本發(fā)明檢測方法不需要昂貴的儀器，檢測時間短、平均回收率高、樣品前處理簡單、能現(xiàn)場操作檢測，應用廣泛，同時具有檢測特異性強、批內和批間誤差小、靈敏度高和操作簡單快速準確廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點。


圖I為本發(fā)明的TR-FIA標準曲線圖。
具體實施例方式實施例
I、免疫原與包被原制備本發(fā)明免疫原(DES-BSA)和包被原(DES-OVA)合成方法。稱取0_羧甲基羥胺半鹽酸鹽21. 9mg、碳酸氫鈉8. 4mg溶解于三蒸水4mL中。將上述液逐滴加入到154mg DES溶解于4mL甲醇中配制得到的DES溶液中，室溫磁力攪拌反應3h。反應后，減壓旋轉蒸發(fā)至含少量水，加入二氯甲烷4mL、無水乙醇2mL重新溶解，加入無水硫酸鈉5g，振搖后靜置過夜。過濾后，60°C減壓旋轉。稱取上述蒸干物44. 2mg、N, N- 二環(huán)已基碳二亞胺(DCC) 12. 4mg、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 6. 9mg溶解于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF) 3mL中，室溫下磁力攪拌反應12h。將上述反應液逐滴加入IlOmg BSA溶解于0. lmol/L磷酸鈉緩沖液(pH8. 0)配制得到的17mL的BSA溶液中，邊加邊攪拌，置室溫下磁力攪拌反應過夜。離心后取上清，4°C生理鹽水中透析3天，每天更換透析液2次，即得偶聯(lián)物DES-BSA。2000rpm離心5mim后,取上清液分裝，冷凍干燥后，_20°C冰箱保存。在上述反應中，將BSA換成OVA后，得到反應偶 聯(lián)物DES-0VA，該偶聯(lián)物作為TR-FIA檢測時作為包被原使用。2、單克隆抗體制備2. I動物免疫用步驟I制備的免疫原分別免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量為100 u g/0. 2mL。首次免疫，用無菌0. 01mol/L pH7. 4PBS溶解免疫原(DES-BSA)，再與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化，頸背部皮下分2 3點注射；加強免疫，用0. 01mol/L pH7. 4PBS溶解免疫原與等量弗氏不完全佐劑混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次間隔14 21天，第3次免疫后7 10天開始對免疫小鼠尾靜脈采血，收集血清,用ELISA檢測小鼠血清效價。末次免疫后間隔4周以上，在細胞融合前3 4天，腹腔注射DES-BSA抗原100 u g/0. 2mL/只，注射后每天注意觀察，保證融合前小鼠狀態(tài)良好。2. 2單克隆抗體制備分離免疫小鼠的脾細胞，并進行勻漿制備免疫睥細胞。取I只免疫的Balb/c小鼠，從眼眶放血分離血清作為陰性血清，處死。小鼠用75%酒精中浸泡5min，進行整體消毒。將小鼠四肢固定，然后用鑷子夾住小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，再用鑷子撕開皮膚，露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪一小口。換一套鑷子和剪刀，用剪刀剪開腹膜，露出脾臟，再換一套器械用鑷子夾住脾臟，用剪刀將脾臟外膜剪破，然后放入事先滅菌的勻漿器中。加適量基礎培養(yǎng)基(RPMI-1640)于勻漿器中，進行研磨，擠壓出脾細胞，取出勻漿器的勻漿棒，再補加適量基礎培養(yǎng)基(RPMI-1640)，靜置2min，將上層細胞懸液吸取后，放入腹腔巨噬細胞離心管中，重復上述操作I次。1200r/min離心IOmin,除去上清。將IO8個免疫脾細胞與I 2X IO7個SP2/0骨髓瘤細胞按照I : 10或I : 5的比例加入50mL離心管中，進行混勻，然后于1500r/min水平離心lOmin，棄去上清。將離心管倒扣在滅菌的吸水紙上，把管中液體吸干。用手指或桌面輕輕敲擊管底，讓沉淀的細胞松動，再把離心管置于37°C水浴鍋中。在Imin內緩慢將50% PEG 0. 8mL滴入離心管中，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌沉淀細胞。再繼續(xù)攪拌30sec后，靜置lmin，然后慢慢加入事先進行37°C預溫的40mL基礎培養(yǎng)基(RPMI-1640)。加基礎培養(yǎng)基方法為第Imin內逐滴滴入lmL，第2min內加2mL,第3min內加3mL,第4min內加其余的4mL,在每次加培養(yǎng)基時需緩慢加入，并輕輕地攪拌培養(yǎng)基，最后將剩余的RPMI-1640培養(yǎng)基慢慢加入。1000r/min離心5min，除去上清。然后用HAT培養(yǎng)基懸浮混合的細胞，再加入飼養(yǎng)脾細胞。根據(jù)需要補加適量的HAT培養(yǎng)基，混合均勻，再將含有飼養(yǎng)細胞的細胞融合液滴加到96孔細胞培養(yǎng)板上，滴加量約為150 μ L/孔。將培養(yǎng)板置于37°C、5% 0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中，進行培養(yǎng)。用建立的間接ELISA篩選陽性細胞克隆。選擇強陽性集落生長的孔，用有限稀釋法進行克隆。并對其他陽性孔，進行24孔擴大培養(yǎng)，用間接ELISA和間接競爭ELISA對擴大培養(yǎng)孔的上清液進行檢測，對間接ELISA和間接競爭ELISA均為陽性孔的細胞進行液氮冷凍保存。通過融合檢測，并進行3次亞克隆后獲得雜交瘤細胞株。雜交瘤細胞株經(jīng)過多次傳代、凍存、復蘇，雜交瘤細胞分泌抗體穩(wěn)定。進行雜交瘤細胞染色體的計數(shù)，將每株雜交瘤細胞隨機選擇20個細胞，進行細胞染色體條數(shù)的計數(shù)，再計算細胞染色體條數(shù)的平均值。小鼠脾細胞染色體數(shù)為40條，SP2/0細胞的染色體數(shù)目平均數(shù)為62 68條，而本試驗獲得的20株雜交瘤細胞染色體數(shù)目都在92 103條之間，平均為97. 8條。本雜交瘤細胞染色體數(shù)目高于兩親本細胞的染色體數(shù)目，說明是兩種細胞的雜交產物。取細胞株細胞分泌的培養(yǎng)上清液，進行I 10稀釋后，用夾心ELISA方法測定抗體亞型，該細胞株分泌的抗體亞型為IgGl。采用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化。該單克隆抗體可用于制備時間分辨熒光檢測試劑盒。2. 3單克隆抗體的純化
采用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化取小鼠腹水10. OmL，加入等體積的巴比妥緩沖液，適量的ニ氧化硅混合，室溫振蕩30min。室溫靜置15min后，取上清于潔凈離心管中，4°C, 1800r/min離心20min ;取上清液18. OmL,加入36. OmL O. 06mol/L醋酸鈉緩沖液，用HCl調pH值至4. 5，充分攪拌下在30min內緩慢加入辛酸297 μ L ;繼續(xù)攪拌lOmin，然后轉入4°C冰箱靜置2h，4°C，15000r/min離心30min，上清液經(jīng)O. 45 μ m濾膜過濾后體積為50mL ;加入5. OmL O. lmol/L的磷酸緩沖液，用NaOH調pH值至7. 6，攪拌下緩緩加入硫酸銨至終濃度為O. 277g/mL ;4°C冰箱靜置2h后，4°C，12000r/min離心30min，棄上清；沉淀用5. OmL O. lmol/L的磷酸緩沖液重懸，裝入透析袋，對5000mL0. 01mol/L pH7. 2PBS緩沖液充分透析后，再對2000mL蒸懼水透析,最后對3000mL三蒸去離子水透析；然后4°C,12000r/min離心30min,棄沉淀,收集上清液，測蛋白濃度。作SDS-PAGE電泳,鑒定單克隆抗體的純度。2. 4兔抗鼠IgG抗體的制備用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西蘭大白兔，制備高效價的兔抗鼠IgG高免血清，采用飽和硫酸銨沉淀法對血清進行粗提，經(jīng)G-200過柱后得到高純度的兔抗鼠IgG。3、組織樣品預處理方法將豬肌肉、肝臟、腎臟等待檢組織樣品勻漿，取2g加入4mLこ酸こ酯振蕩2min，室溫3000r/min離心5min,取300 μ L上層液體于I. 5mL離心管中80°C水浴蒸干(大約30min)或在氮氣流下吹干，用150 μ L稀釋液溶解殘留物。4、制備試劑盒和檢測組織樣品4. IEu3+-兔抗鼠抗體的制備取溶解于50mmol/L PBS pH7. O的5g/L兔抗鼠抗體l_2mL，經(jīng)PD-10柱轉換緩沖條件，洗脫液為含0. 155mmol/LNaCl的50mmol/L Na2C03-NaHC03pH8. 5緩沖液。收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量(1.46Α28(Γ0.74Α26(Ι)，用上述洗脫液稀釋兔抗鼠抗體至2g/L。取500-1000 μ I稀釋后的兔抗鼠抗體加入含0. 2mg-0. 4mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-ニこ烯三胺四こ酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30°C磁力攪拌反應20小吋。反應液經(jīng)用80mmol/LTris-HCl pH7. 8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(I X 40cm)層析,A28c!監(jiān)測收集蛋白峰，稀釋分裝備用。4. 2包被板固相抗原制備將DES-OVA用50mmol/L Na2C03_NaHC03pH9. 6 緩沖液稀釋至 lmg/L 的包被液，48 (或96)孔包被板各孔加100 U L，4°C放置過夜。棄去包被液，沖洗三次，加150 ii L含3g/L OVA的上述緩沖液封閉，4°C放置過夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置_20°C冷凍保存。4. 3試劑的配制(I)DES標準品溶液配置將DES標準品，稀釋成為0ng/mL，0. 01ng/mL,0. 025ng/mL, 0. Ing/mL, 0. 25ng/mL, Ing/mL, 2. 5ng/mL, lOng/mL, 25ng/mL, lOOng/mL 系列濃度，稀釋液為0. lmol/L pH7. 5磷酸鹽緩沖液。(2)緩沖液8mmol/L NaCl.O. 2% 0VA、50 y mol/L 二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0. lml/L Tween-80 和 0. 1% NaN3 的 Tris-HCl pH7. 8。(3)洗漆液14. Smmol /T, NaCl、0. 2ml/L Tween-80 和 0. 2 NaN3 的 SOmmoI /I,Tris-HCl pH7. 8。(4)增強液的配制由15iimol P -萘甲酰三氟丙酮、50 y mol三正辛基氧化膦和ImL曲拉通X-100加入到pH3. 2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中，再定容至I升配制而成。4. 4試劑盒提供的試劑每一個盒中的試劑足夠進行96個測量，盒中的材料如下(1)2X96孔板(8條X 12孔，可以拆分為單孔)包被有DES-0VA。(2) I XDES 標準品溶液，I. 0mg/mL/ 瓶。(3) I X抗DES抗體凍干品，用時0. 5mL蒸餾水溶解。(4) I XEu3+-兔抗鼠抗體凍干品，用時0. 5mL蒸餾水溶解。(5)1X 增強液15mL。(6) I X洗滌液30mL，用時以蒸餾水I : 25稀釋。(7) I X 緩沖液30mL。4. 5測定之前注意事項(I)使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30°C )。(2)使用之后立即將所有試劑放回2V _8°C。(3)如果樣品量大建議使用多通道移液器。(4)在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。(5)取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2V -8°C。
4. 6具體檢測步驟如下取DES-OVA板條，加入50 y L的樣品溶液到各自的微孔中，每個樣品必須使用新的吸頭，加緩沖液I : 5000稀釋的抗DES抗體50 iiL，37°C振蕩I小時，洗滌液洗四次，力口緩沖液I : 600稀釋的Eu3+-兔抗鼠抗體IOOii L，37°C振蕩45分鐘，用洗滌液洗六次，力口200 u L增強液振蕩5分鐘后測量。根據(jù)標準抑制曲線(圖I)計算樣品中的TYL或TIL含量。表I為試劑盒標準曲線抑制率測定值。本試劑盒組織最低檢測線(LOD)為TYL的LOD為0. 03ng/mL，TIL的LOD為0. 05ng/mL ;組織最低定量線(LOQ)為=TYL和TIL的LOQ分別為 O. 07 和 O. ling IIir1O表I試劑盒標準曲線抑制率測定值
權利要求
1.一種檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于由下列組分組成 48或90孔包被板 抗DES的抗體凍干品 DES標準品溶液 銪標記的兔抗鼠抗體 緩沖液 洗滌液 增強液 所述 DES 標準品溶液濃度為 0ng/mL,0. 01ng/mL,O. 025ng/mL,O. Ing/mL,0. 25ng/mL,Ing/mL, 2. 5ng/mL, lOng/mL, 25ng/mL, lOOng/mL 系列濃度。
2.根據(jù)權利要求I所述檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于所述緩沖液由8mmol/L NaCl、0. 2%卵清蛋白、50 μ mol/L ニこ烯三胺五こ酸、O.lml/L Tween-80 和 O. 1% NaN3 的 Tris-HCl ρΗ7· 8 配制而成。
3.根據(jù)權利要求I或2所述檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于所述洗滌液由14. 5mmol/L NaCUO. 2ml/L Tween-80和O. 2% NaN3的50mmol/L Tris-HCl ρΗ7· 8 配制而成。
4.根據(jù)權利要求3所述檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于所述增強液由Ιδμπιο β-萘甲酰三氟丙酮、50 μ mol三正辛基氧化膦和ImL曲拉通X-100加入到pH3. 2鄰苯ニ甲酸氫鉀緩沖液中，再定容至I升配制而成。
5.一種用權利要求I所述檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，其特征在于按如下步驟進行 a、免疫原的制備將半抗原去碳霉糖泰樂菌素與牛血清白蛋白偶聯(lián)，得到免疫原DES-BSA ； b、包被原的制備將半抗原去碳霉糖泰樂菌素與卵清蛋白偶聯(lián)，得到包被原DES-OVA； C、單克隆抗體的制備 (1)用步驟a所述免疫原DES-BSA免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗DES的單克隆抗體的雜交瘤細胞株； (2)以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進行純化，獲得抗DES的單克隆抗體IgG ； (3)用步驟b所述包被原DES-OVA包被48或者96多孔包被板； d、樣品的前處理及檢測 取包被有包被原DES-OVA的48或者96多孔包被板，加入處理好的TYL或TIL到各自的微孔中，加入抗DES抗體，振蕩反應，洗滌液洗滌，加入Eu3+-兔抗鼠抗體，振蕩反應，用洗滌液洗滌，加增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據(jù)標準曲線計算樣品中的TYL或TIL含量。
6.根據(jù)權利要求5所述檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，其特征要在于所述步驟d的具體操作為取包被有DES-OVA的多孔包被板，加入50μ I的處理好的TYL或TIL到各自的微孔中，加50μ I以緩沖液稀釋的抗DES抗體，25°C 37°C振蕩O. 5 I小時，洗滌液洗三次，加以緩沖液稀釋的100 μ I Eu3+-兔抗鼠抗體，25°C 37°C振蕩O. 5 I小時，用洗滌液洗六次，加200 μ I增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據(jù)標準曲線計算樣品中的TYL或TIL含量。
7.根據(jù)權利要求5或6所述檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，其特征在于所述DES標準品溶液濃度為0ng/mL,0. 01ng/mL,0. 025ng/mL,O.Ing/mL, 0. 25ng/mL, Ing/mL, 2. 5ng/mL, lOng/mL, 25ng/mL, lOOng/mL 系歹Ι」 農
8.根據(jù)權利要求7所述檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，其特征在于所述緩沖液由8mmol/LNaCl、0. 2%卵清蛋白、50 μ mol/L ニこ烯三胺五こ酸、O. lml/L Tween-80 和 O. 1% NaN3 的 Tris_HClpH7. 8 配制而成。
9.根據(jù)權利要求5、6或8所述檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，其特征在于所述洗滌液由14. 5mmol/L NaCUO. 2ml/L Tween-80和O. 2%NaN3 的 50mmol/L Tris-HCl pH7. 8 配制而成。
10.根據(jù)權利要求9所述檢測泰樂菌素和替米考星的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，其特征在于所述增強液由15 μ mol β -萘甲酰三氟丙酮、50 μ mol三正辛基氧化膦和ImL曲拉通X-100加入到pH3. 2鄰苯ニ甲酸氫鉀緩沖液中，再定容至I升配制而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法。所述檢測泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒由多孔包被板、緩沖液、去碳霉糖泰樂菌素(DES)標準、抗DES的抗體凍干品、銪標記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液所組成。所述檢測泰樂菌素(TYL)和替米考星(TIL)的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法包括下列步驟a、免疫原的制備；b、包被原的制備；c、單克隆抗體的制備；d、樣品的前處理及檢測。本發(fā)明檢測方法不需要昂貴的儀器，檢測時間短、平均回收率高、樣品前處理簡單、能現(xiàn)場操作檢測，應用廣泛，同時具有檢測特異性強、批內和批間誤差小、靈敏度高和操作簡單快速準確廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優(yōu)點。
文檔編號G01N21/64GK102830232SQ201210351700
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權日2012年9月20日
發(fā)明者樂濤, 徐建, 何紅秋, 牛小東, 陳雍, 秦建波, 王玉, 段小煉 申請人:重慶市科學技術研究院