專利名稱：維生素b12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及維生素B12 (VB12)化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
維生素B12 (vitamin B12, VB12)又叫鈷胺素，是一種含鈷的維生素，是所有具有氰鈷胺素生物活性的類咕啉的總稱，自然界中的VB12都是微生物合成的，高等動(dòng)植物不能制造VB12，VB12是需要一種腸道分泌物(內(nèi)源因子)幫助才能被吸收的唯一的一種維生素。另外，維生素B12也是唯一含必須礦物質(zhì)的維生素，因含鈷而呈紅色，又稱紅色維生素，是少數(shù)有色的維生素。VB12屬B群維生素，貯存量很少，約疒3mg在肝臟。人體維生素B12需要量極少，只要飲食正常，就不會(huì)缺乏。主要從尿排出，部分從膽汁排出。其主要生理功能包括①提高葉酸利用率，缺乏VB12時(shí)，從甲基四氫葉酸上轉(zhuǎn)移 甲基基團(tuán)的活動(dòng)減少，使葉酸變成不能利用的形式，導(dǎo)致葉酸缺乏癥。②維護(hù)神經(jīng)髓鞘的代謝與功能。缺乏VB12時(shí)，可引起神經(jīng)障礙、脊髓變性，并可引起嚴(yán)重的精神癥狀。VB12缺乏可導(dǎo)致周圍神經(jīng)炎。小孩缺乏VB12的早期表現(xiàn)是情緒異常、表情呆滯、反應(yīng)遲鈍，最后導(dǎo)致貧血。③促進(jìn)紅細(xì)胞的發(fā)育和成熟。將甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化成琥珀酰輔酶A，參與三羧酸循環(huán)，其中琥珀酰輔酶A與血紅素的合成有關(guān)。④參與脫氧核酸(DNA)的合成，脂肪、碳水化合物及蛋白質(zhì)的代謝，增加核酸與蛋白質(zhì)的合成。維生素B12為機(jī)體維持正常代謝、DNA合成和紅細(xì)胞再生所必需。維生素B12缺乏得不到及時(shí)糾正可導(dǎo)致巨幼細(xì)胞貧血及不可逆性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。維生素B12或葉酸測(cè)定對(duì)查明維生素B12、葉酸缺乏有診斷價(jià)值，尤其對(duì)巨幼細(xì)胞貧血的鑒別診斷有意義診斷方法目前臨床上維生素B12定量檢測(cè)常用方法有(I)放射免疫分析技術(shù)(RIA):較早的臨床定量檢測(cè)方法，靈敏度高，特異性高，但因?yàn)橛蟹派湫晕廴?，且操作繁瑣，市?chǎng)逐漸萎縮。(2)酶聯(lián)免疫分析法(ELISA) =RIA之后出現(xiàn)的分析方法，因操作簡(jiǎn)單，無(wú)放射性污染，價(jià)格較低，現(xiàn)在有一定的市場(chǎng)占有率，但ELISA靈敏度不如RIA?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)為當(dāng)今最為敏感的微量免疫測(cè)定法，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好，無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用到基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，成為取代RIA的首選技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析起步于80年代初，快速發(fā)展應(yīng)用于90年代，主要特點(diǎn)是高敏感性、可測(cè)定濃度范圍寬、樣本無(wú)需稀釋即可檢測(cè)、試劑有效期長(zhǎng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)自動(dòng)化成度高、數(shù)據(jù)自動(dòng)生成處理能力強(qiáng)、測(cè)定儀器兼容性好、無(wú)環(huán)境污染等，因而得到了迅速發(fā)展與應(yīng)用。但目前使用化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)VB 12的試劑盒還較少，臨床應(yīng)用較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供維生素B12 (VB12)的化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法，解決了靈敏度低，檢測(cè)范圍窄，成本高的缺陷。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括VB12抗體包被板、VB12抗原酶結(jié)合物、VB12校準(zhǔn)品、VB12質(zhì)控品、20倍濃縮洗液、發(fā)光液A液和B液、樣本處理液A液和B液。所述的VB12抗體包被板為包被有VB12抗體的96孔或48孔白色微孔板，孔間平均變異(CV%)不高于10%。所述的抗原酶結(jié)合物所用的酶為辣根過(guò)氧化物酶，純度要求RZ ^ 3.0，活性^ 250U/mL,購(gòu)自 Sigma 公司。VB12抗體來(lái)源于Fitzgerald公司，在外觀上應(yīng)澄清透明，無(wú)沉淀,純度應(yīng)彡90%,采用倍比稀釋測(cè)定效價(jià)應(yīng)不低于IO5倍稀釋，應(yīng)確保VB12測(cè)定的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。所述的VB12質(zhì)控品包括低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其中低值質(zhì)控品 的濃度范圍是158. 68 238. 02pg/mL,高值質(zhì)控品的濃度范圍是1141. 37 1712. 05pg/
mLo所述的VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，所述的發(fā)光液A液包含O. 7g/L魯米諾，O. 165g/L對(duì)碘酚；B液是濃度為O. 675g/L的過(guò)氧化脲水溶液。樣本處理液A液包含36g/L NaOH ;樣本處理液B液包含10. 66g/L MES (2- (N-嗎啉代)乙磺酸)，L 03g/L DTT (二硫蘇糖醇)，lg/L Proclin300, ρΗ5· 5。所述的20 倍濃縮洗液包括 75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20, lg/LProclin300o上述試劑盒的制備方法，包括以下步驟I) VB12抗體包被板的制備將VB12抗體用O. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL,加入到白色微孔板中，37°C包被2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7. 4PBS緩沖液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，37°C封閉2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，甩干后37°C烘干4小時(shí)；裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封口，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于2l°C ；2)采用高碘酸鈉氧化法制備VB12抗原-HRP酶結(jié)合物，并在酶結(jié)合物中加入HRP穩(wěn)定劑，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于疒8°C ；3) VB12 校準(zhǔn)品將VB12用1%BSA校準(zhǔn)品稀釋液配制成濃度為0，100，200，500，1000, 2000pg/mL的校準(zhǔn)品，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于疒8°C ；4)VB12質(zhì)控品的配制正常人血清經(jīng)56°C水浴30min滅活和HBsAg、anti_HCV和anti-HIV檢測(cè)呈陰性(使用經(jīng)SFDA批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法)后，并加入Proclin300作為防腐劑。低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其濃度的平均值分別為198. 35pg/mL和1426. 71pg/mL ；5 )配制發(fā)光液A液和B液A液是含有O. 7g/L魯米諾和O. 165g/L對(duì)碘酚的ρΗ8· 6的5mmol/LTris *HC1緩沖液液是濃度為O. 675g/L的過(guò)氧化脲水溶液，用工藝用水配制；6)配制20倍濃縮洗液20 倍濃縮洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20,1g/LProclin300 ；7)樣本處理液的配制樣本處理液A包含36g/L NaOH ;樣本處理液B包含10. 66g/L MES (2- (N-嗎啉代)乙磺酸)，I. 03g/L DTT (二硫蘇糖醇)，lg/L Proclin300, ρΗ5· 5 ；8)組裝將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2 8°C ;9)對(duì)采用該方法制的的試劑盒的進(jìn)行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。ProClin300以其廣譜活性、優(yōu)越的兼容性和穩(wěn)定性及其在使用濃度下的低毒性， ProClin300成為用于診斷試劑的理想高效防腐劑。Proclin300防腐劑可在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)根除細(xì)菌、真菌及酵母，從而延長(zhǎng)產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間。其水溶性確保其可輕易溶入所需試劑中。特別是，ProClin300防腐對(duì)大多數(shù)的酶或抗體交聯(lián)反應(yīng)的功能無(wú)影響，所以不會(huì)干擾檢驗(yàn)指示劑。維生素B12 (VB12)定量檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)采用競(jìng)爭(zhēng)法原理測(cè)定VB12，樣本加到包被有豬內(nèi)因子的白色不透明的條板微孔中，再加入鼠抗人抗體-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合物，若樣本中含有VB12，則形成固相VB12抗體-VB12-VB12抗體-HRP復(fù)合物，洗掉游離成分，加入底物工作液，在氧化劑作用下，HRP催化魯米諾生成處于激發(fā)態(tài)的氨基鄰苯二甲酸離子，其恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，釋放出425nm的光子，于第5 15分鐘測(cè)定各加樣本孔的發(fā)光值RLU。樣本的RLU與樣本VB12濃度呈負(fù)相關(guān)。樣本中的VB12濃度依據(jù)由校準(zhǔn)品VB12濃度和對(duì)應(yīng)的RLU建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量，從而檢測(cè)人血清、血漿中的VB12含量。本專利發(fā)明的維生素B12 (VB12)化學(xué)發(fā)光免疫定量測(cè)定試劑盒，采用當(dāng)今最為靈敏的檢測(cè)方法——化學(xué)發(fā)光免疫分析，具有一下優(yōu)點(diǎn)(I)反應(yīng)快速，可在65分鐘內(nèi)判斷檢測(cè)結(jié)果；操作簡(jiǎn)便，無(wú)污染。(2)靈敏度高，本試劑盒的分析靈敏度不高于50pg/mL。(3)特異性強(qiáng)，與鈷啉醇酰胺的交叉特異性均小于1%。(4)精密度良好，批內(nèi)精密度不高于15%，批間精密度不高于20%。(5)穩(wěn)定性良好，本產(chǎn)品在37°C可存放7天以上，在2 8°C可存放I年。(6)成本低，與市場(chǎng)上同類產(chǎn)品比較，本試劑盒性能良好，成本低，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。


圖I是本發(fā)明的博奧賽斯化學(xué)發(fā)光試劑盒測(cè)定VB12與放免試劑盒測(cè)定VB12的測(cè)定結(jié)果比較圖，其中縱坐標(biāo)為博奧賽斯測(cè)得的VB12值，橫坐標(biāo)為放免試劑盒測(cè)定VB12值，兩種方法相關(guān)系數(shù)(r) =0. 9571，直線方程y=l. 049χ-22. 175。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :制備VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括VB12抗體包被板、VB12抗原酶結(jié)合物、VB12校準(zhǔn)品、VB12質(zhì)控品、20倍濃縮洗液、發(fā)光液A液和B液、樣本處理液A液和B液。通過(guò)下述方法制備VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒I) VB12抗體包被板的制備
將VB12抗體用O. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL,加入到白色微孔板中，37°C包被2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7. 4PBS緩沖液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，37°C封閉2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，甩干后37°C烘干4小時(shí)；裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封口，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于2l°C ；2)采用高碘酸鈉氧化法制備VB12抗原-HRP酶結(jié)合物，并在酶結(jié)合物中加入HRP穩(wěn)定劑，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于疒8°C ；3) VB12 校準(zhǔn)品將VB12用1%BSA校準(zhǔn)品稀釋液配制成濃度為0，100，200，500，1000, 2000pg/mL的校準(zhǔn)品，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于疒8°C ;4)VB12質(zhì)控品的配制正常人血清經(jīng)56°C水浴30min滅活和HBsAg、anti_HCV和anti-HIV檢測(cè)呈陰性(使用經(jīng)SFDA批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法)后，并加入Proclin300作為防腐劑。 低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其濃度的平均值分別為198. 35pg/mL和1426. 71pg/mL ；5 )配制發(fā)光液A液和B液A液是有O. 7g/L魯米諾和O. 165g/L對(duì)碘酚的ρΗ8· 6的5mmol/LTris · HCl緩沖液液是濃度為O. 675g/L的過(guò)氧化脲水溶液，用工藝用水配制；6)配制20倍濃縮洗液20 倍濃縮洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20,1g/LProclin300 ；7)樣本處理液的配制樣本處理液A包含36g/L NaOH ;樣本處理液B包含10. 66g/L MES (2- (N-嗎啉代)乙磺酸)，I. 03g/L DTT (二硫蘇糖醇)，lg/L Proclin300, ρΗ5· 5 ；8)組裝將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2 8°C ;9)對(duì)采用該方法制的的試劑盒的進(jìn)行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。說(shuō)明測(cè)定指標(biāo)物理檢查液體組分應(yīng)澄清，無(wú)沉淀或絮狀物；其他組分應(yīng)無(wú)包裝破損。準(zhǔn)確性試劑盒校準(zhǔn)品與企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品系列同時(shí)進(jìn)行分析測(cè)定，用Log (X) -Logit (Y)數(shù)學(xué)模型擬合，要求兩條劑量-反應(yīng)曲線不顯著偏離平行(t檢驗(yàn)，111〈2. 447);以企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，試劑盒校準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值比值的平均值應(yīng)在O. 90 1· 10范圍內(nèi)。企業(yè)校準(zhǔn)品是將VB12純品用校準(zhǔn)品稀釋液配成系列濃度，濃度分別為0，100，200，500，1000，2000pg/mL，根據(jù) VB12 藥典參考標(biāo)準(zhǔn)(Lot. 00H288)為其定值，儲(chǔ)存于 _20°C。劑量-反應(yīng)曲線的線性用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，劑量_反應(yīng)曲線在(T2000pg/mL濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r不低于O. 9900。分析靈敏度試劑盒分析靈敏度不高于50pg/mL。精密度批內(nèi)不精密度(CV%)應(yīng)不高于15% ;批間不精密度(CV%)應(yīng)不高于20%。質(zhì)控品測(cè)定值平行測(cè)定10孔高值和低值的質(zhì)控品，用Log(X)-Logit(Y)數(shù)學(xué)模型擬合，質(zhì)控品測(cè)值應(yīng)在允許范圍內(nèi)，QcL和QcH的允許范圍分別為158. 68 238. 02pg/mL和 1141.37 1712. 05pg/mL。特異性交叉反應(yīng)符合下表要求；
權(quán)利要求
1.VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括VB12抗體包被板、VB12酶結(jié)合物、VB12校準(zhǔn)品、VB12質(zhì)控品、20倍濃縮洗液、發(fā)光液A液和B液、樣本處理液A液和B液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的VB12抗體包被板為包被有VB12抗體的96孔或48孔白色微孔板，白色微孔板的孔間平均變異不高于10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的抗原酶結(jié)合物所用的酶為辣根過(guò)氧化物酶HRP，純度要求RZ > 3. 0，活性> 250U/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的VB12抗體純度> 90%,效價(jià)不低于IO5倍稀釋。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的VB12質(zhì)控品包括低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其中低值質(zhì)控品的濃度范圍是158. 68 238. 02pg/mL，高值質(zhì)控品的濃度范圍是114L 37 1712. 05pg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的發(fā)光液A液中包含O. 7g/L魯米諾，O. 165g/L對(duì)碘酚；B液是濃度為O. 675g/L過(guò)氧化脲水溶液；樣本處理液A液包含36g/L NaOH ;樣本處理液B液包含10. 66g/L MES, I. 03g/L DTT, lg/LProclin300, pH5. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的20倍濃縮洗液包括 75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl,5mL/L Tween-20，lg/LProclin300。
8.一種制備所述權(quán)利要求I的試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟 OVB12抗體包被板的制備 將VB12抗體用O. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL，加入到白色微孔板中，37°C包被2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7. 4PBS緩沖液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，37°C封閉2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，甩干后37°C烘干4小時(shí)；裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封口，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于疒8°C ； 2)采用高碘酸鈉氧化法制備VB12抗原-HRP酶結(jié)合物，并在酶結(jié)合物中加入HRP穩(wěn)定齊U，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于疒8°C ； 3)VB12校準(zhǔn)品 將VB12用1%BSA校準(zhǔn)品稀釋液配制成濃度分別為0，100，200，500，1000, 2000pg/mL的校準(zhǔn)品，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于疒8°C ; 4)VB12質(zhì)控品的配制正常人血清經(jīng)56°C水浴30min滅活和HBsAg、anti-HCV和anti-HIV檢測(cè)呈陰性后，并加入Proclin300作為防腐劑。低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其濃度的平均值分別為198. 35pg/mL和1426. 71pg/mL ； 5)配制發(fā)光液A液和B液 A液是含有O. 7g/L魯米諾和O. 165g/L對(duì)碘酚的pH8. 6的5mmol/LTriS · HCl緩沖液；B液是濃度為O. 675g/L的過(guò)氧化脲水溶液，用工藝用水配制； 6)配制20倍濃縮洗液 . 20 倍濃縮洗液的配方如下75. 5g/L Tris, 120g/L NaCl，5mL/L Tween-20, lg/LProclin300 ；7)樣本處理液的配制 樣本處理液A包含36g/L NaOH ;樣本處理液B包含10. 66g/L MES, I. 03g/L DTT，lg/LProclin300, pH5. 5 ； 8)組裝 將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2 8°C ; 9)對(duì)采用該方法制的的試劑盒的進(jìn)行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的包被板的固相載體為96孔或48孔的白色微孔板。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括VB12抗體包被板、VB12酶結(jié)合物、VB12校準(zhǔn)品、VB12質(zhì)控品、20倍濃縮洗液、發(fā)光液A液和B液、樣本處理液A液和B液。另外本發(fā)明還公開(kāi)了一種VB12化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有試劑盒相比操作簡(jiǎn)便，安全無(wú)環(huán)境污染。此外，本發(fā)明還具有檢測(cè)樣品的濃度范圍寬、試劑有效期長(zhǎng)、穩(wěn)定性好，成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/82GK102798726SQ20121026170
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者劉萍, 宋啟超, 董婷婷, 李克錦, 范利花 申請(qǐng)人:博奧賽斯(天津)生物科技有限公司