專利名稱：肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
肌酸磷酸激酶(Creatine Kinase, CK)是由腦型亞單位(B)和肌型亞單位(M)組成的二聚體，有CK-MM、CK-MB和CK-BB三種同工酶，CK大量存在于心肌、骨骼肌和腦等組織，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，其中CK-BB主要
存在于大腦、前列腺、腸、肺；骨骼肌中存在大量的CK-MM和少量的CK-MB ;而心肌組織雖以CK-MM為主，但CK-MB所占比例遠(yuǎn)較其他組織高。目前，心肌損傷、心肌梗塞和急性心肌梗死(AMI)已經(jīng)成為威脅人類生命的主要疾病之一，心肌是唯一含CK-MB較多的器官，CK-MB是心肌類疾病早期診斷的重要指標(biāo)。正常人血清中CK-MM占94% 96%，CK-MB僅占5%以下，若血清中CK-MB明顯增高，說明心肌受累，一般認(rèn)為當(dāng)血清中CK-MB大于總活性的6%以上為心肌損傷的特異性指標(biāo)。另外，CK-MB診斷透壁型心肌梗死的敏感性和特異性均極高，在起病4h后CK-MB含量增高，在16 24小時(shí)后達(dá)高峰，3 4天恢復(fù)正常。若CK-MB在急性心肌梗死(AMI)后仍保持在高水平，則意味著心肌壞死還繼續(xù)進(jìn)行；若恢復(fù)正常后再次升高，提示原梗死部位擴(kuò)展或有新的梗死出現(xiàn)，由于半衰期短，CK-MB和亞型在監(jiān)測(cè)再發(fā)損傷中比肌鈣蛋白更為敏感；其增高的程度能較準(zhǔn)確地反映梗死的范圍；其高峰出現(xiàn)時(shí)間是否提前有助于判斷溶栓治療是否成功。單獨(dú)進(jìn)行檢測(cè)，CK-MB是很理想的標(biāo)志物；與心肌肌鈣蛋白進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，更有助于提高AMI的診斷陽性率。目前，臨床領(lǐng)域應(yīng)用的CK-MB檢測(cè)方法主要有電泳、放射性免疫法、免疫抑制法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法和化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法等。電泳法和免疫抑制法均會(huì)受到溶血和巨CK的干擾，此外，免疫抑制法還受CK-BB的干擾，使這兩種檢測(cè)方法的應(yīng)用受到了限制；酶聯(lián)免疫測(cè)定法由于存在敏感性相對(duì)較低，所用標(biāo)記酶與底物可定量測(cè)定范圍窄、儀器測(cè)定范圍窄等缺點(diǎn)，限制了其在微量免疫定量測(cè)定中的應(yīng)用；放射性免疫由于存在試劑有效期短、操作繁瑣、放射性污染等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到了限制?；瘜W(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的研究起步于80年代初，快速發(fā)展應(yīng)用于90年代，為當(dāng)今最為敏感的微量免疫測(cè)定法。主要特點(diǎn)是高敏感性、可測(cè)定濃度范圍寬、樣本無需稀釋即可檢測(cè)、試劑有效期長(zhǎng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)自動(dòng)化成度高、數(shù)據(jù)自動(dòng)生成處理能力強(qiáng)、測(cè)定儀器兼容性好、無環(huán)境污染等，因而得到了迅速發(fā)展與應(yīng)用。但目前使用化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)CK-MB還沒有廣泛應(yīng)用在臨床上，也未見相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供血肌酸磷酸激酶(Creatine Kinase, CK)的化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法，解決了靈敏度低，檢測(cè)范圍窄的缺陷。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括=CK-MB抗體包被板、CK-MB抗體酶結(jié)合物、CK-MB校準(zhǔn)品、CK-MB質(zhì)控品、20倍濃縮洗液、發(fā)光液A液和B液。所述的肌酸磷酸激酶同工酶抗體包被板為包被有CK-MB抗體的96孔或48孔白色微孔板，孔間平均變異不高于10%。所述的抗體酶結(jié)合物所用的酶為辣根過氧化物酶，純度要求RZ ≥ 3.0，活性^ 250U/mL,購自 Sigma 公司。所述的CK-MB抗體購自Fitzgerald公司，濃度與標(biāo)示濃度相差≤10%，效價(jià)不低于IO5倍稀釋。所述的CK-MB質(zhì)控品包括低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其中低值質(zhì)控品的濃度范圍是8 12ng/mL，高值質(zhì)控品的濃度范圍是120 180ng/mL。所述的肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，所述的發(fā)光液A液包含O. 7g/L魯米諾，O. 165g/L對(duì)碘酚；B液是濃度為O. 675g/L過氧化脲的水溶液。所述的20 倍濃縮洗液包括 75. 5g/LTris, 120g/LNaCl, 5mL/L Tween-20, lg/LProclin300o上述試劑盒的制備方法，包括以下步驟I) CK-MB抗體包被板制備將CK-MB抗體用O. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL,加入到白色微孔板中，37°C包被2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7. 4 PBS-T緩沖液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，37°C封閉2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，甩干后37°C烘干4小時(shí)；裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封口，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于2l°C ；2 )辣根過氧化物酶標(biāo)記CK-MB抗體，得CK-MB抗體酶結(jié)合物用高碘酸鈉氧化法制備CK-MB抗體-HRP酶結(jié)合物，并在酶結(jié)合物中加入酶結(jié)合物穩(wěn)定劑，于-20°C下儲(chǔ)存；3) CK-MB 校準(zhǔn)品將CK-MB用校準(zhǔn)品稀釋液，稀釋成不同濃度的校準(zhǔn)品，濃度分別為O, 5, 25, 100, 250, 500ng/mL ；4)CK-MB質(zhì)控品的配制在正常人血清中加入適量的CK-MB純品，配制低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其濃度的平均值分別為10ng/mL和150ng/mL ；5 )配制發(fā)光液A液和B液A液是含有O. 7g/L魯米諾和O. 165g/L對(duì)碘酚的ρΗ8· 6的5mmol/LTris *HC1緩沖液液是濃度為O. 675g/L的過氧化脲水溶液，用工藝用水配制；6)配制20倍濃縮洗液20 倍濃縮洗液的配方如下75. 5g/LTris, 120g/LNaCl, 5mL/L Tween-20, lg/LProclin300 ；7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2 8°C ;8)對(duì)采用該方法制的的試劑盒的進(jìn)行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。ProClin 300以其廣譜活性、優(yōu)越的兼容性和穩(wěn)定性及其在使用濃度下的低毒性，ProClin300成為用于診斷試劑的理想高效防腐劑。Proclin 300防腐劑可在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)根除細(xì)菌、真菌及酵母，從而延長(zhǎng)產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間。其水溶性確保其可輕易溶入所需試劑中。特別是，ProClin300防腐對(duì)大多數(shù)的酶或抗體交聯(lián)反應(yīng)的功能無影響，所以不會(huì)干擾檢驗(yàn)指示劑。肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)定量檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)是基于微孔板雙抗體夾心原理的化學(xué)發(fā)光免疫分析，在本專利中使用了兩株在CK-MB分子上有著不同結(jié)合位點(diǎn)的特異性抗體，首先采用一株特異性CK-MB抗體包被發(fā)光板，加入待檢樣本和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的另一株CK-MB抗體后，若樣本中含有CK-MB，則形成固相抗體-CK-MB-抗體-HRP復(fù)合物。反應(yīng)后洗滌，除去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體。然后加入發(fā)光液，測(cè)定光信號(hào)，光信號(hào)強(qiáng)度與樣本中的CK-MB含量成正比。根據(jù)本產(chǎn)品中已知濃度的系列校準(zhǔn)品及其對(duì)應(yīng)的光信號(hào)強(qiáng)度作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出樣本中的CK-MB含量。 本專利發(fā)明的肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)化學(xué)發(fā)光免疫定量測(cè)定試劑盒，采用當(dāng)今最為靈敏的檢測(cè)方法——化學(xué)發(fā)光免疫分析，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)反應(yīng)快速，可在30分鐘內(nèi)判斷檢測(cè)結(jié)果；操作簡(jiǎn)便，無污染。(2)靈敏度高，本試劑盒的分析靈敏度不高于O. 5ng/mL。(3)特異性強(qiáng)，與肌酸磷酸激酶同工酶麗(CK-MM)、肌酸磷酸激酶同工酶BB(CK-BB)的交叉特異性均小于1%。(4)精密度良好，批內(nèi)精密度不高于15%，批間精密度不高于20%。(5)穩(wěn)定性良好，本產(chǎn)品在37°C可存放7天以上，在疒8°C可存放I年。(6)成本低，與市場(chǎng)上同類產(chǎn)品比較，本試劑盒性能良好，成本低，適用于臨床常規(guī)檢測(cè)。


圖I是本發(fā)明的博奧賽斯化學(xué)發(fā)光試劑盒測(cè)定CK-MB與放免試劑盒測(cè)定CK-MB的測(cè)定結(jié)果比較圖，其中縱坐標(biāo)為博奧賽斯測(cè)得的CK-MB值，橫坐標(biāo)為放免試劑盒測(cè)定CK-MB值，兩種方法相關(guān)系數(shù)(r) =0. 9528，直線方程y=l. 0098x+0. 2187。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :制備肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括=CK-MB抗體包被板、CK-MB抗體酶結(jié)合物、CK-MB校準(zhǔn)品、CK-MB質(zhì)控品、20倍濃縮洗液、發(fā)光液A液和B液。通過下述方法制備肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒I )CK-MB抗體包被板的制備將CK-MB抗體用O. 05mol/LpH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL，加入到白色微孔板中，37°C包被2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7. 4PBS-T緩沖液洗板，然后加入含有O. 5%BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，37°C封閉2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，甩干后37°C烘干4小時(shí)；裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封口，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于2 8°C ；2)CK-MB抗體酶結(jié)合物的制備采用高碘酸鈉氧化法制備CK-MB抗體-HRP酶結(jié)合物。3) CK-MB 校準(zhǔn)品
將CK-MB用校準(zhǔn)品稀釋液，稀釋成不太濃度的校準(zhǔn)品，濃度分別為O, 5, 25, 100, 250, 500ng/mL。4)CK-MB質(zhì)控品的配制在正常人血清中加入適量的CK-MB純品，配制低值質(zhì)控品(QcL)和高值質(zhì)控品(QcH)，其濃度的平均值分別為10ng/mL和150ng/mL ； 5 )配制發(fā)光液A液和B液A液是含有O. 7g/L魯米諾和O. 165g/L對(duì)碘酚的ρΗ8· 6的5mmol/LTris *HC1緩沖液為液是濃度為O. 675g/L的過氧化脲水溶液，用工藝用水配制；6)配制20倍濃縮洗液
20 倍濃縮洗液的配方如下75. 5g/LTris, 120g/LNaCl，5mL/LTween_20，lg/LProclin300 ；7)組裝將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2 8°C ;8)對(duì)采用該方法制的的試劑盒的進(jìn)行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品的測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定說明物理檢查在外觀上液體組分應(yīng)澄清，無沉淀或絮狀物；其他組分應(yīng)無包裝破損。準(zhǔn)確性試劑盒校準(zhǔn)品與企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品系列同時(shí)進(jìn)行分析測(cè)定，用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，要求兩條劑量-反應(yīng)曲線不明顯偏離平行(t檢驗(yàn)，111〈2. 447)；以企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，試劑盒校準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)值與標(biāo)示值比值的平均值應(yīng)在O. 9(Tl. 10范圍內(nèi)。企業(yè)校準(zhǔn)品的配制將高純度的CK-MB用校準(zhǔn)品稀釋液(含有牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液)配成系列濃度的校準(zhǔn)品，濃度分別為0，5，25，100，250，500ng/mL,儲(chǔ)存于-20。。。分析靈敏度分析靈敏度不高于O. 5ng/mL。精密度批內(nèi)不精密度(CV%)應(yīng)不高于15.0%;批間不精密度(CV%)應(yīng)不高于20. 0%。質(zhì)控品測(cè)定值平行測(cè)定10孔高值和低值的質(zhì)控品，用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，質(zhì)控品測(cè)值應(yīng)在允許范圍內(nèi)，QcL和QcH的允許范圍分別為8 12ng/mL和120 150ng/mL。特異性交叉反應(yīng)應(yīng)符合下表要求。
權(quán)利要求
1.肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括CK-MB抗體包被板、CK-MB抗體酶結(jié)合物、CK-MB校準(zhǔn)品、CK-MB質(zhì)控品、20倍濃縮洗液、發(fā)光液A液和B液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的肌酸磷酸激酶同工酶抗體包被板為包被有CK-MB抗體的96孔或48孔的白色微孔板，白色微孔板的孔間平均變異不高于10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的抗體酶結(jié)合物所用的酶為辣根過氧化物酶，純度要求RZ ^ 3. 0，活性> 250U/mLo
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的CK-MB抗體購自Fitzgerald公司，濃度與標(biāo)示濃度相差彡10%,效價(jià)不低于IO5倍稀釋。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的醛固酮化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于CK-MB質(zhì)控品包括低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其中低值質(zhì)控品的濃度范圍是8 12ng/mL，高值質(zhì)控品的濃度范圍是120 180ng/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的發(fā)光液A液包含0. 7g/L魯米諾，0. 165g/L對(duì)碘酚；B液包含0. 675g/L過氧化脲。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的 20 倍濃縮洗液包括 75. 5g/LTris，120g/LNaCl，5mL/LTween_20，lg/LProclin300o
8.一種制備所述權(quán)利要求I的試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟 . 1)CK-MB抗體包被板的制備 將CK-MB抗體用0. 05mol/LpH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋至I 10ug/mL，加入到白色微孔板中，37°C包被2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7. 4PBS-T緩沖液洗板，然后加入含有0. 5%BSA的磷酸鹽緩沖液封閉微孔板，37°C封閉2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，甩干后37°C烘干4小時(shí)；裝入鋁箔袋，加入干燥劑，封口，貼標(biāo)簽，儲(chǔ)存于21 °C ； . 2)采用高碘酸鈉氧化法將辣根過氧化物酶和CK-MB抗體連接在一起，得CK-MB抗體酶結(jié)合物，并加入酶結(jié)合物穩(wěn)定劑，于-20°C下儲(chǔ)存； . 3)CK-MB校準(zhǔn)品 將高純度的CK-MB用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋成濃度分別為0，5，25，100，250，500ng/mL的校準(zhǔn)品; . 4)CK-MB質(zhì)控品的配制在正常人血清中加入適量的CK-MB純品，配制低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其濃度的平均值分別為10ng/mL和150ng/mL ; .5)配制發(fā)光液A液和B液 A液是含有0. 7g/L魯米諾和0. 165g/L對(duì)碘酚的pH8. 6的5mmol/LTriS HCl緩沖液為液是濃度為0. 675g/L的過氧化脲水溶液，用工藝用水配制；. 6)配制20倍濃縮洗液 .20 倍濃縮洗液的配方如下:75. 5g/LTris，120g/LNaCl，5mL/LTween-20，lg/LProclin300 ； 7)組裝 將上述試劑組裝成盒，儲(chǔ)存于2 8°C ; 8)對(duì)采用該方法制的的試劑盒的進(jìn)行物理檢查，準(zhǔn)確度、劑量-反應(yīng)曲線的線性、精密度、特異性、靈敏度、質(zhì)控品測(cè)定值和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的包被板為包被有CK-MB抗體的96孔或48孔白色微孔板。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括CK-MB抗體包被板、CK-MB抗體酶結(jié)合物、CK-MB校準(zhǔn)品、CK-MB質(zhì)控品、20倍濃縮洗液、發(fā)光液A液和B液。另外本發(fā)明還公開了一種肌酸磷酸激酶同工酶化學(xué)發(fā)光免疫定量檢測(cè)試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒與現(xiàn)有試劑盒相比操作簡(jiǎn)便，安全無環(huán)境污染。此外，本發(fā)明還具有檢測(cè)樣品的濃度范圍寬、試劑有效期長(zhǎng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/573GK102809651SQ20121026167
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者劉萍, 宋啟超, 董婷婷, 李克錦, 范利花 申請(qǐng)人:博奧賽斯(天津)生物科技有限公司