專利名稱：一種食品中2-萘胺的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種檢測食品中偶氮染料的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，屬于免疫學檢測分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
偶氮是染料中形成基礎(chǔ)顏色的物質(zhì)，且偶氮染料合成方法較為簡單、結(jié)構(gòu)多變，因而種類繁多，很多染料都屬于此。偶氮染料因其易于發(fā)生偶氮還原裂解而可以產(chǎn)生20余種致癌芳香胺而備受關(guān)注，并成為食品、皮革、玩具等產(chǎn)品中化學品成分分析的一項極其重要的內(nèi)容，而聯(lián)苯胺和2-萘胺是其中致癌性最強的兩種芳香胺，它們是合成許多工業(yè)染料及食品色素的中間物。然而隨著食品工業(yè)的不斷發(fā)展，人們對于食品感官品質(zhì)的要求也不斷提高，偶氮染料憑借其自身顏色鮮艷、著色簡單、穩(wěn)定等其它染料不可比擬的優(yōu)越性，而被謀取暴利的不法商販越來越多地添加到食品中，如蘇丹紅。對于偶氮染料的檢測，主要是通過檢測其產(chǎn)生的芳香胺來實現(xiàn)對其監(jiān)控的。目前，芳香胺的檢測主要依靠傳統(tǒng)的氣相色譜、液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用等儀器分析檢測，這些檢測方法雖靈敏、準確，但均依賴昂貴 而龐大的儀器設(shè)備，因此檢測成本較高，而且耗時、前處理復雜繁瑣，很難滿足現(xiàn)場檢測的快速簡便而靈敏高效的要求。故而，研究出一種快速、靈敏、簡便、準確、高效而價廉的免疫學檢測方法，勢在必行。然而酶聯(lián)免疫學迄今在此領(lǐng)域鮮有涉足，因而，開展此項研究的必要性和重要性可見一斑。

發(fā)明內(nèi)容
(一 )要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明旨在建立一種具有高特異性、高靈敏度、高準確度、高精確度、操作方法簡單、快速、價廉等特點的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，用于含偶氮染料的食品的批量、快速檢測分析。( 二 )技術(shù)方案
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了 2-萘胺的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，并對檢測方法進行了條件優(yōu)化。其中，樣品前處理根據(jù)國標GB/T 17592-2006 :將食品樣品剪成5mmX5mm的碎片，均勻混合后準確稱取3. OOg樣品置于具塞錐形瓶中，加入50mL pH 6. O的檸檬酸鹽緩沖溶液，70°C水浴攪拌反應(yīng)30min，然后加入IOmL連二亞硫酸鈉溶液，繼續(xù)上述水浴攪拌反應(yīng)30min，待反應(yīng)結(jié)束后，將試管迅速用流動自來水冷卻至室溫，如此即可將食品中的偶氮染料還原為相應(yīng)的芳香胺，然后濾去殘渣，備用。其中，包被2-萘胺抗原的酶標板的制備過程中，所用的包被原是半抗原2-萘胺與卵清蛋白(OVA)的偶聯(lián)復合物，所用包被緩沖液是O. 05 M pH9. 6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含2%明膠的上述包被緩沖液。其中，2-萘胺多克隆抗體是用2-萘胺與牛血清白蛋白(BSA)的重氮化法偶聯(lián)復合物，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，并以一定的免疫劑量多次加強免疫健康的新西蘭大白兔制備得到的。
其中，酶標二抗是辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(GAR-HRP)。其中主要溶液的配制
O. OlM磷酸鹽(PBS)緩沖液氯化鈉8 g、磷酸二氫鉀O. 24 g、磷酸氫二鈉3. 62 g、氯化鉀O. 2g，用超純水定容至1L。洗滌液(PBST):為含有O. 05%吐溫-20的O. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液?？贵w稀釋液含O. 1%明膠的PBST溶液。標準品稀釋液為甲醇溶液。O. 05M pH 9. 6 的碳酸鹽(CBS)緩沖溶液稱取 I. 59g Na2CO3^2. 93g NaHCO3,加超純水稀釋至1L。顯色液由A液和B液兩種溶液構(gòu)成，A液配方為9. 33 g檸檬酸，36. 8 gNa2HPO4 · 12H20,180 μ L 30%的H2O2，用超純水定容至IL ；Β液配方為600 mg四甲基聯(lián)苯胺溶于IL乙二醇，并超聲振蕩幾分鐘。二者均貯于4°C冰箱中保存，使用時將A液和B液以A B=5 I的體積比混勻即可。終止液為2mol/L 的 H2S04。本發(fā)明方法的檢測分析原理是
以相同量(100 μ L)的抗原包被到酶標板的各個孔中，加入待測含2-萘胺食品樣品和2-萘胺多克隆抗體后，待測樣品中的2-萘胺與固相包被抗原相互競爭有限的抗待測物的抗體(一抗)，并與之結(jié)合，由于每個孔中的固相抗原和加入的抗體含量均相同，所以當待測樣品所含的2-萘胺濃度高時，與固相抗原結(jié)合的抗體就會減少，而反應(yīng)達到平衡時，將上清液傾倒出來，并用洗液洗滌，故只有與固相抗原結(jié)合的抗體留在酶標板孔中，并與加入的酶標二抗反應(yīng)，顯然此時酶標二抗與被固定的抗體結(jié)合量減少，用洗滌液洗滌后加入底物液(即顯色液A液)和顯色液(即B液)，顯色反應(yīng)淺，用酶標儀檢測450nm處的OD值低，表明抑制率高；反之，當待測2-萘胺濃度低時，則所測的OD值高，抑制率低。根據(jù)所作的標準曲線，可以推算出待測樣品中所含2-萘胺的濃度高低。一種食品中偶氮染料的還原物2-萘胺的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，步驟為
(1)抗原的包被
將2-萘胺與卵清蛋白OVA重氮化法偶聯(lián)，并以此偶聯(lián)復合物作為包被抗原，以O(shè). 05 M、pH 9. 6的碳酸鈉緩沖液稀釋包被抗原，抗原稀釋倍數(shù)分別為2000、4000、8000、16000倍，向酶標板的每孔中加入上述不同稀釋倍數(shù)的包被液100 μ L，4°C孵育過夜，用添加有2%明膠的上述包被緩沖液作為封閉液封閉；
(2)競爭反應(yīng)
將免疫制備的2-萘胺多克隆抗體用抗體稀釋液分別稀釋1000、3000、9000倍后，力口入酶標板中，每孔加50 μ L,同時分別加入濃度為O ng/mL, 2 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL的2-萘胺標準品，每孔加入50 μ L，37°C孵育lh，然后用PBST洗滌液置于搖床上洗滌3次，每次3min ；
所述洗滌液PBST :為含有O. 05%吐溫-20的O. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；
抗體稀釋液含O. 1%明膠的PBST溶液；
(3)加酶標二抗
加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體GAR-HRP，用抗體稀釋液進行5000倍稀釋，每孔加入100 μ L，37°C溫育lh，以PBST置于搖床上洗滌3次，每次3min ；
(4)顯色
向酶標板的各孔中分別加入100 μ L顯色液，于37°C恒溫箱中反應(yīng)15 min，取出酶標板，向每孔加入100 μ L終止液2 mol/L的硫酸,用酶標儀測定450nnm處的吸光值A(chǔ)45(l。(三)有益效果
本發(fā)明提供的食品偶氮染料檢測方法采用了 2-萘胺多克隆抗體，能準確靈敏地檢測食品中的部分偶氮染料，樣品的前處理過程簡單、耗時少、檢測成本低、反應(yīng)條件溫和、方法環(huán)保、能實現(xiàn)食品的大通量檢測，而且本發(fā)明方法穩(wěn)定性好，基本無有機溶劑的污染。本發(fā)明對于含偶氮染料的現(xiàn)場檢測具有重要的現(xiàn)實意義，并對于其它相關(guān)偶氮染料的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法的建立具有重要的指導意義。


圖I 2-萘胺的標準抑制曲線。
具體實施例方式實施例I檢測方法的操作及結(jié)果計算 一種定量檢測食品中2-萘胺的酶聯(lián)免疫吸附方法，包括以下步驟
(1)制備2-萘胺-BSA免疫原；
(2)制備抗2-萘胺的多克隆抗體；
(3)制備2-萘胺-OVA包被原；
(4)制備包被板；
(5)競爭反應(yīng)；
(6)加酶標二抗；
(7)顯色；
其中
(I)制備2-萘胺-BSA免疫原
稱取 . 2 mg的2-萘胺(約O. 05mmol),用lmol/L HCl溶液將其溶解并調(diào)pH至I左右，(TC預冷30min，得到A液；稱取6g NaNO2溶解于20mL純水中，配成30% NaNO2溶液，(TC預冷30min ;4°C、持續(xù)攪拌下，把配置的30% NaNO2溶液滴加到A液中，NaNO2溶液的加入量用淀粉-碘化鉀試紙檢測，當其變?yōu)樗{黑色，且2秒內(nèi)不變色即可停止加入，此后繼續(xù)反映15min ;稱取 67mg BSA，溶解于 9mL、0. IM pH9. 6 的 CB 溶液中，并置于(TC預冷 30min ;4°C、持續(xù)攪拌下將重氮化的2-萘胺緩慢滴加到BSA溶液中，并于4°C冰箱中攪拌反應(yīng)過夜，在此過程中要不斷檢測反應(yīng)體系pH，并用IM NaOH使其保持在pH8 9左右。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，然后于O. 01M、pH7.4的PBS中、4°C溫度下透析72h。然后用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。4°C保存?zhèn)溆谩?2)制備抗2-萘胺的多克隆抗體
所用免疫動物為新西蘭大白兔4只，分別編號為I號、2號、3號、4號。采用皮下和肌肉注射法進行免疫。免疫方法初次免疫用制得的免疫原和等體積的弗氏完全佐劑在帶有連接管的注射器中混合乳化，劑量為O. 5mg/kg，采用背部皮下多點注射；四周后進行第一次加強免疫，用弗氏不完全佐劑進行乳化，劑量為I mg/kg，采用肌肉注射；以后每隔兩周進行一次加強免疫，用弗氏不完全佐劑進行乳化，免疫劑量為I mg/kg，采用肌肉注射。從第二次加強免疫開始，每次免疫8-10天后耳緣采血，并將血液于5000r/min、4°C下離心lOmin，收集血清來測定效價和抑制率。當效價和抑制率均達到最大或滿足要求后，用心臟穿刺采血法采血，將血液經(jīng)同樣離心條件離心后收集血清，采用免疫親和層析法對抗體進行純化，向所得抗體中加入等量甘油和O. 1%疊氮鈉，-20°C保存。(3 )制備2-萘胺-OVA包被原
2-萘胺-OVA包被原的合成采用上述重氮化法合成，將BSA換成OVA即可。(4)包被板的制備
包被板為96孔酶標板并在微孔中包被2-萘胺-OVA偶聯(lián)物，采用O. 05M pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液作為包被液稀釋2-萘胺-OVA偶聯(lián)物，抗原稀釋倍數(shù)分別為2000、4000、8000、16000倍，然后向包被板的每個孔中加入100 μ L包被液，37°C烘箱放置2h或4°C過夜，用洗·滌液洗滌3min，每次在吸水紙上拍干，重復2次。然后加入含2%明膠的上述包被緩沖液作為封閉液封閉，37°C烘箱溫育2h，取出用上述洗滌液洗滌3次。(5)競爭反應(yīng)
分別將一系列濃度梯度分別為 O ng/mL, 2ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL的2-萘胺標準品和經(jīng)前處理過的樣品提取液分別加入到包被板各自的微孔中，每孔50 μ L，要雙孔平行加樣。再將免疫制備的2-萘胺多克隆抗體用抗體稀釋液(含O. 1%明膠、含O. 05%吐溫-20、pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液PBST)分別稀釋9000倍，加入酶標板中，每孔加入量為50 μ L，37°C恒溫箱孵育Ih后以PBST洗滌3次，每次洗3min ；
(6)加酶標二抗
加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(GAR-HRP)，用抗體稀釋液稀釋5000倍，向每孔中加100 μ L，37°C恒溫箱溫育Ih后以PBST洗滌3次，每次3min ；
(7)顯色
每孔加入100 μ L顯色液,置于37°C不透光恒溫箱中反應(yīng)15 min,取出后每孔加入100μ L終止液，用酶標儀測定450nm處吸光值A(chǔ)45tl。標準抑制曲線的繪制方法為把加入O ng/mL標準品孔的OD值減去加入最大濃度標準品孔的OD值所得差值定為Btl,把加入O ng/mL標準品孔的OD值減去加入其它濃度各孔的OD值之差記為B，計算出各個濃度對應(yīng)的B / Btl值；以標準品濃度為橫坐標，以其對應(yīng)的B / Btl值為縱坐標，繪制2-萘胺標準抑制曲線。根據(jù)曲線的回歸方程可以求出對應(yīng)樣品的濃度，也可以求出2-萘胺的最小檢測限IC9tl (B/Bo=90%時對應(yīng)的濃度)為2. Ong/mL,IC50 (B/Bo=50% 時對應(yīng)的濃度)為 14. 5 ng/mL。實施例2回收率及樣品提取方法的確定
(O以新鮮彩色豆腐作為實驗添加樣品，依照前文所述前處理方法將其剪碎，以10.0ng/g、20. O ng/g、50. O ng/g的水平加入2-萘胺到研磨碎的新鮮彩色豆腐中,各濃度分別制備樣品4份，依照上述技術(shù)方案中的樣品前處理方法處理食品樣品，將其中的偶氮染料還原為相應(yīng)的芳香胺。同時設(shè)定一空白對照實驗。(2)按照前述方法，用移液槍準確移取50 μ 樣品提取液，直接加樣于96孔微孔中，進行ELISA測定。(3)回收率的計算根據(jù)不同添加濃度的樣品OD值計算相應(yīng)的抑制率，再根據(jù)相應(yīng)的抑制率從標準曲線上查到各自的濃度。檢測濃度與真實濃度之比為對應(yīng)濃度的回收率。結(jié)果見表I。表I添加回收率的測定
權(quán)利要求
1.ー種食品中偶氮染料的還原物2-萘胺的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，其特征在于 (1)抗原的包被 將2-萘胺與卵清蛋白OVA重氮化法偶聯(lián)，并以此偶聯(lián)復合物作為包被抗原，以O(shè). 05 M、pH 9. 6的碳酸鈉緩沖液稀釋包被抗原，抗原稀釋倍數(shù)分別為2000、4000、8000、16000倍，向酶標板的每孔中加入上述不同稀釋倍數(shù)的包被液100 μ L，4°C孵育過夜，用添加有2%明膠的上述包被緩沖液作為封閉液封閉； (2)競爭反應(yīng) 將免疫制備的2-萘胺多克隆抗體用抗體稀釋液分別稀釋1000、3000、9000倍后，カロ入酶標板中，姆孔加50 μ L,同時分別加入濃度為O ng/mL, 2 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL的2-萘胺標準品，每孔加入50 μ L，37°C孵育lh，然后用PBST洗滌液置于搖床上洗滌3次，毎次3min ； 所述洗滌液PBST :為含有O. 05%吐溫-20的O. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液； 抗體稀釋液含O. 1%明膠的PBST溶液； (3)加酶標ニ抗 加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體GAR-HRP，用抗體稀釋液進行5000倍稀釋，每孔加入100 μ L，37°C溫育lh，以PBST置于搖床上洗滌3次，每次3min ； (4)顯色 向酶標板的各孔中分別加入100 μ L顯色液，于37°C恒溫箱中反應(yīng)15 min，取出酶標板，向姆孔加入100 μ L終止液2 mol/L的硫酸,用酶標儀測定450nnm處的吸光值A(chǔ)4500
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的2-萘胺酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，其特征在干，PBST洗滌液的配方為1000 mL蒸餾水中加入氯化鈉8 g、磷酸ニ氫鉀O. 24 g、磷酸氫ニ鈉3. 62 g、氯化鉀O.2g、和吐溫-20 O. 5 mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的2-萘胺酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，其特征在于，顯色液由A液和B液兩種溶液構(gòu)成，A液配方為9. 33 g檸檬酸，36. 8 g Na2HPO4 · 12H20,180 μ L 30%的H2O2，用超純水定容至IL ；Β液配方為600 mg四甲基聯(lián)苯胺溶于ILこニ醇，并超聲振蕩幾分鐘，然后分裝使用；二者均貯于4°C冰箱中保存，使用時將A液和B液以A B=5 I的體積比混勻。
全文摘要
一種食品中2-萘胺的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，屬于免疫學檢測分析領(lǐng)域。以相同量的抗原包被到酶標板的各孔中，加入待測含2-萘胺食品樣品和2-萘胺多克隆抗體后，待測樣品中的2-萘胺與固相包被抗原相互競爭有限的一抗，并與之結(jié)合，當待測樣品的2-萘胺濃度高時，與固相抗原結(jié)合的抗體就會減少，反應(yīng)達平衡時，將上清傾出，用洗液洗滌，與固相抗原結(jié)合的抗體留在酶標板孔中，并與加入的酶標二抗反應(yīng)，此時酶標二抗與被固定的抗體結(jié)合量減少，顯色反應(yīng)淺，酶標儀檢測450nm處的OD值低，表明抑制率高；反之爾然。據(jù)所作標準曲線，算出待測樣品中2-萘胺的濃度高低。本發(fā)明樣品前處理過程簡單、耗時少、成本低、反應(yīng)條件溫和、方法環(huán)保、能實現(xiàn)食品的大通量檢測。
文檔編號G01N21/78GK102680675SQ201210189970
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者匡華, 尹玉云, 彭池方, 王利兵, 王文斌, 胥傳來 申請人:江南大學