專利名稱：一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫磁珠的制備方法及應用，具體涉及一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應用，該制備方法用于分離致病性金黃色葡萄球菌 {Staphylococcus aarem)，包括金黃色葡萄球菌免疫磁珠的制備方法和應用方法，屬于病原菌分離技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
^BMM^Mik^· (Immunomagnetic bead-based separation, IMS)
展起來的一項新的免疫學技術(shù)。包裹有一定復合有機材料的微小磁珠在一定條件下既可結(jié)合蛋白質(zhì)抗體成為抗體一磁珠二聯(lián)體，將其加入經(jīng)過前處理的樣品中，磁珠上的特異性抗體可以和相應的抗原結(jié)合從而形成抗原一抗體一磁珠復合物(免疫磁珠，Immunomagnetic bead, 1MB),這種復合物在磁力作用下，發(fā)生力學移動，使之與樣品中的其它物質(zhì)分離，而達到分離特定抗原的目的。免疫磁珠(MB)是一個平臺，凡是利用抗原抗體結(jié)合原理進行工作的領(lǐng)域都可以應用，并且已在醫(yī)學和生物學的骨髓移植、分離干細胞、細胞器、癌細胞、 激素、病原菌等方面取得了顯著成績。近年來1MB以其高度的敏感性和特異性被廣泛應用于食品、水、生物樣品、環(huán)境等標本中病原微生物的分離和檢測工作中，顯示出良好的開發(fā)應用前景。在分離致病性微生物方面，1MB可有效地收集、濃縮大量樣品中的少量病原微生物。1MB對目的菌的富集具有高分離率、高特異性、高穩(wěn)定性、無污染、無毒性、操作簡便的特點。使用該方法樣品用量少且不會傷及細菌，較之常規(guī)檢驗法相比，更高效、更敏感。該方法省去了常規(guī)方法中的預富集培養(yǎng)步驟，直接對致病菌進行分離，在2- 內(nèi)即可完成。此外，由于1MB特異性高，且能夠識別性質(zhì)極為相近的菌株，可以有效的區(qū)分致病性與非致病性菌株，從而減少漏檢，顯著地提高了分離準確率，減少了假陽性的出現(xiàn)。近年來，免疫磁珠技術(shù)對食源性致病菌分離的研究集中于沙門氏菌、大腸桿菌 0157:H7、單增李斯特氏菌、副溶血弧菌等。根據(jù)常規(guī)免疫磁珠的制備原理，對于上述致病菌的免疫磁珠制備較繁瑣，首先要制備這些菌種的單克隆抗體或多克隆抗體，然后將抗體與磁珠偶聯(lián)，從而對菌株進行分離。因此，免疫磁珠的分離效果(準確度和靈敏度)直接受到抗體純度的影響。本發(fā)明提及的人IgG免疫磁珠制備的原理是金黃色葡萄球菌細胞表面一種特有的蛋白質(zhì)？ -金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)，它具有與人IgG的Fc片段特異性結(jié)合的能力，每個SPA分子可以同時結(jié)合2個人IgG分子，將人IgG與磁珠偶聯(lián)制成免疫磁珠，便可以用于分離金黃色葡萄球菌。人IgG分子的制備及純化的技術(shù)現(xiàn)已成熟，市場上可以買到低價位，高純度的人IgG標準品，為高質(zhì)量低成本的人IgG免疫磁珠制備提供了條件。目前，利用SPA分子與人IgG特異性結(jié)合的原理分離人IgG的方法已相對成熟，而利用人IgG免疫磁珠分離金黃色葡萄球菌的研究僅處于初步階段，對磁珠的制備和用于金葡菌的分離等條件的優(yōu)化沒有進行詳細的研究，磁珠的穩(wěn)定性和富集能力還不高。本發(fā)明利用此原理對用于金黃色葡萄球菌富集的人IgG免疫磁珠的制備工藝及富集應用條件進行了優(yōu)化，大大提高了對金黃色葡萄球菌的富集能力和檢測靈敏度，同時憑借其免疫磁珠自身的快速方便、不需要大型檢測儀器、價格低廉的特點運用于食品、飼料、醫(yī)療環(huán)境和自然環(huán)境中金黃色葡萄球菌的分離與富集，可以進一步提高快速檢測金黃色葡萄球菌效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了彌補現(xiàn)有金葡菌檢測技術(shù)存在的不足，提供一種用于富集金黃色葡菌球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應用。磁珠經(jīng)過適量活化劑(EDC-NHS組合) 處理后與人IgG在合適的條件下進行偶聯(lián)，制成人IgG免疫磁珠，將人IgG免疫磁珠加入待測經(jīng)過前處理的樣品中，在一定的條件下捕獲金黃色葡萄球菌。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是該用于富集金黃色葡菌球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法是以磁珠為載體，偶聯(lián)人IgG，制備成能夠富集金黃色葡萄球菌的免疫磁珠；
一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法，該方法以磁珠為載體， 偶聯(lián)人IgG，制備成能夠富集金黃色葡萄球菌的免疫磁珠； 具體方法是
(1)活化取磁珠放入離心管中，加入活化緩沖液洗滌磁珠，反復三次，每次間隔3飛分鐘，除去活化緩沖液后加入活化劑EDC和NHS各200 μ L，混勻，將磁珠于22 25°C條件下震蕩孵育30 60分鐘，將磁珠進行活化；
(2)偶聯(lián)用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠，反復三次，每次間隔3飛分鐘，加入人IgG，混勻，于 22 25°C條件下震蕩孵育M小時，制成人IgG免疫磁珠；
(3)封阻人IgG免疫磁珠經(jīng)洗滌緩沖液洗滌，反復三次，每次間隔3飛分鐘，加入封阻緩沖液于22 25°C條件下作用1 2小時，存放于保存緩沖液中，4°C保存待用；
上述各步驟中所述
活化緩沖液0. IM MES 和 0. 05% 吐溫-20，pH6. 0-6. 5 ； 偶聯(lián)緩沖液:0. IM MES 和 0. 05% 吐溫-20，ρΗ7· 0-7. 4 ； 洗滌緩沖液:0. IM MES, 0. 1%BSA，0. 05% 吐溫-20 ； 封阻緩沖液:0. 2M pH8. 5 Tris 溶液，0. 1%BSA，0. 05% 吐溫-20 ； 保存緩沖液:0. IM MES, ρΗ7· 4 ；
活化劑EDC和NHS，濃度均為l_5mg/mL，用活化緩沖液溶解，先加入EDC，混勻后加入 NHS，震蕩均勻；
上述的百分比為重量百分比。一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的應用方法，是通過將人IgG免疫磁珠添加到各種待檢樣品中，在一定條件下達到分離或富集并檢測金黃色葡萄球菌的目的。1)按照國標法的樣品前處理方法處理樣品，免疫磁珠與樣品在偶聯(lián)緩沖液中于 37°C充分震蕩孵育1小時，對金黃色葡萄球菌富集；
2)經(jīng)富集后的金黃色葡萄球菌在7. 5%NaCl營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)18- 小時培養(yǎng)，計數(shù)，獲得樣品中金黃色葡萄球菌的數(shù)量。
該金黃色葡萄球菌免疫磁珠產(chǎn)品應用于食品、飼料、化妝品、公共場所工具和臨床樣本檢驗中。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明首次將活化劑(EDC和NHS)活化后的磁珠應用于金黃色葡萄球菌免疫磁珠的制備，根據(jù)金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)分子與人IgG特異性結(jié)合的原理富集金黃色葡萄球菌，特異性強，高效快速。目前人IgG產(chǎn)品在國內(nèi)已商品化，和金黃色葡萄球菌免疫血清相比，純度高，性能穩(wěn)定，成本低廉；制備出的免疫磁珠穩(wěn)定性好，分離效率高，價格低。本發(fā)明利用上述原理經(jīng)磁珠類型及活化劑的選擇、抗體-磁珠偶聯(lián)和1MB-菌體捕獲等條件優(yōu)化， 建立了利用人IgG免疫磁珠對樣品中的金黃色葡萄球菌進行富集的方法，較先前相關(guān)研究大大提高了檢測靈敏度(由100CFU/ml提高到2. 6CFU/ml)，與國標法GB/T 4789. 10-2010相比，也顯著地提高了檢測下限，縮短了檢測時間(由55小時縮減到26. 5小時)。本發(fā)明用于富集金黃色葡菌球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法操作簡單，不需要大型儀器和特殊培訓的專業(yè)人員，樣品不需要特殊前處理，可廣泛應用于食品、飼料、化妝品、環(huán)境和臨床中金黃色葡萄球菌的分離與檢測。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。一、人IgG免疫磁珠的制備
1.取磁珠放入離心管中，加入活化緩沖液洗滌磁珠反復三次，每次間隔3分鐘，除去活化緩沖液后加入活化劑EDC和NHS各200 μ L，混勻，于震蕩孵育30分鐘，進行磁珠活化；
2.用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠三遍，每次間隔3分鐘，加入人IgG，混勻，于震蕩孵育 Mh，制備成人IgG免疫磁珠；
3.用洗滌緩沖液洗滌免疫磁珠反復三次，每次間隔3分鐘，用封阻緩沖液于震蕩孵育1 2小時，置于保存緩沖液中4°C保存待用；
4.按照國標法的樣品前處理方法處理樣品，取人IgG免疫磁珠加入樣品中，混勻，于 37°C震蕩孵育1小時，使得免疫磁珠與樣品充分接觸，于磁力架上對金黃色葡萄球菌富集。二、人IgG免疫磁珠對樣品中金黃色葡萄球菌富集的應用 實施例1
以無菌吸管吸取25mL液體類食品樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。將免疫磁珠加入合適濃度的樣品中，充分混勻后于37°C孵育1小時。作用完畢后，置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋，傾注法于7. 5%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。實施例2
稱取25g半固體類食品待測樣品至225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min 10 000r/min均質(zhì)1 2分鐘，制成1 10的樣品勻液。將人IgG免疫磁珠加入經(jīng)處理的樣品中，充分混勻后于37°C孵育1小時。置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋，傾注法于7. 5%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。實施例3
稱取25g固體類食品待測樣品至225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min 10 000r/min均質(zhì)1 2分鐘，制成1 10的樣品勻液。將人IgG免疫磁珠加入經(jīng)處理的樣品中，充分混勻后于37°C孵育1小時。置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋，傾注法于7. 5%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。實施例4
以無菌吸管吸取25mL液體類飼料樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成1 10的樣品勻液。將人IgG免疫磁珠加入經(jīng)處理的樣品中，充分混勻后于37°C孵育1小時。置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋，傾注法于7. 5%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。實施例5
稱取25g半固體類飼料待測樣品至225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min 10 000r/min均質(zhì)1 2分鐘，制成1 10的樣品勻液。將人IgG免疫磁珠加入經(jīng)處理的樣品中，充分混勻后于37°C孵育1小時。置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋，傾注法于7. 5%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。實施例6
稱取25g固體類飼料待測樣品至225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min 10 000r/min均質(zhì)1 2分鐘，制成1 10的樣品勻液。將人IgG免疫磁珠加入經(jīng)處理的樣品中，充分混勻后于37°C孵育1小時。置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋，傾注法于7. 5%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。實施例7
將待檢化妝品類樣品制成1:10的樣品勻液，將人IgG免疫磁珠加入經(jīng)處理的樣品中， 充分混勻后于37°C孵育1小時。置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋， 傾注法于7. 5%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。實施例8
將待測公共場所空氣樣本加入至含有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌袋中，制成1:10的樣品勻液。將人IgG免疫磁珠加入經(jīng)處理的樣品中，充分混勻后于37°C孵育1小時。置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋，傾注法于7. 5%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。實施例9
將公共場所用具(賓館、理發(fā)、美容、游泳場、飯店等場所用具)用涂抹法取樣，待測樣品制成1:10的樣品勻液。將人IgG免疫磁珠加入經(jīng)處理的樣品中，充分混勻后于37°C孵育1 小時。置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋，傾注法于7. 5%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。實施例10
將各種臨床標本(門診及住院患者血、痰、尿、咽拭子、切口分泌物、穿刺液、便及骨髓等)制成1:10待測樣品勻液。將人IgG免疫磁珠加入經(jīng)處理的樣品中，充分混勻后于37°C 孵育1小時。置于磁力架上捕獲磁珠，除去上清液，以無菌水適度稀釋，傾注法于7. 5%氯化
6鈉營養(yǎng)瓊脂平板37°C培養(yǎng)18 M小時后計數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法，其特征在于該方法以磁珠為載體，偶聯(lián)人IgG，制備成能夠富集金黃色葡萄球菌的免疫磁珠；具體方法是(1)活化取磁珠放入離心管中，加入活化緩沖液洗滌磁珠，反復三次，每次間隔3飛分鐘，除去活化緩沖液后加入活化劑碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)各200 μ L， 混勻，將磁珠于22 25°C條件下震蕩孵育30 60分鐘，將磁珠活化；(2)偶聯(lián)用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠，反復三次，每次間隔3飛分鐘，加入人IgG，混勻，于 22 25°C條件下震蕩孵育M小時，制成人IgG免疫磁珠；(3)封阻人IgG免疫磁珠經(jīng)洗滌緩沖液洗滌，反復三次，每次間隔3飛分鐘，加入封阻緩沖液于22 25°C條件下作用1 2小時，存放于保存緩沖液中，4°C保存待用；上述各步驟中所述活化緩沖液0. IM MES 和 0. 05% 吐溫-20，pH6. 0-6. 5 ；偶聯(lián)緩沖液:0. IM MES 和 0. 05% 吐溫-20，ρΗ7· 0-7. 4 ；洗滌緩沖液:0. IM MES, 0. 1%BSA，0. 05% 吐溫-20 ；封阻緩沖液:0. 2M pH8. 5 Tris 溶液，0. 1%BSA，0. 05% 吐溫-20保存緩沖液:0. IM MES, ρΗ7· 4 ；活化劑EDC和NHS，濃度均為l_5mg/mL，用活化緩沖液溶解，先加入EDC，混勻后加入 NHS，震蕩均勻。
2.一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的應用，其特征在于通過將免疫磁珠添加到待檢樣品中，在一定條件下達到分離或富集并檢測金黃色葡萄球菌的目的，并以人IgG免疫磁珠分離效果為依據(jù)進行產(chǎn)品標注和宣傳，具體應用為1)按照金黃色葡萄球菌檢驗國標方法中的樣品前處理辦法處理樣品，免疫磁珠與樣品在偶聯(lián)緩沖液中于37°C充分震蕩孵育1小時，對樣品中金黃色葡萄球菌進行富集；2)在37°C條件下，將富集的金黃色葡萄球菌在7.5%NaCl營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)1814 小時后計數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的應用，其特征在于利用制備的人IgG免疫磁珠對食品、飼料、化妝品、公共場所工具和臨床樣本中的金黃色葡萄球菌進行富集和檢驗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于富集金黃色葡萄球菌的人IgG免疫磁珠的制備方法及應用，它是以磁珠為載體，人IgG為識別中間體，經(jīng)過活化-偶聯(lián)-洗滌-封阻的過程制備出人IgG免疫磁珠，在合適的緩沖液中于一定條件下孵育可以高效捕捉、富集檢測樣本中的金黃色葡萄球菌；該方法特異性強，高效快速，操作簡單，價格低廉，不需要大型儀器和特殊培訓的專業(yè)操作人員，樣品不需要特殊前處理，可廣泛應用于食品、飼料、化妝品、環(huán)境和臨床中金黃色葡萄球菌的富集分離與檢測。
文檔編號G01N1/40GK102426229SQ20111028837
公開日2012年4月25日 申請日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者劉喚明, 劉陽, 孫力軍, 徐德峰, 王雅玲, 聶芳紅 申請人:廣東海洋大學