專利名稱：一種檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接elisa方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA方法，屬于動物傳染病學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自2010年4月以來，一種由黃病毒引起的種(蛋)鴨產(chǎn)蛋驟降的新發(fā)疫病在我國江蘇、浙江、山東、河南、福建等地相繼發(fā)生，可致使產(chǎn)蛋鴨采食量迅速下降、產(chǎn)蛋率急速下降、 甚至停產(chǎn)及不同程度死亡。產(chǎn)蛋率高的鴨群患病后4飛天左右從產(chǎn)蛋高峰的809Γ95%迅速下降至209Γ30%，嚴(yán)重的可在發(fā)病后7天左右出現(xiàn)停產(chǎn)；剛開產(chǎn)種(蛋)鴨產(chǎn)蛋率上升緩慢或減蛋、長時間低產(chǎn)蛋率或無產(chǎn)蛋高峰出現(xiàn)。不同地區(qū)、不同品種鴨群發(fā)病率高低不一，群內(nèi)發(fā)病率幾乎100%，病死率為(Γ12%。其臨床癥狀除了產(chǎn)蛋驟降外，很重要的一個特征是發(fā)生鴨卵巢出血的病鴨伴有搖頭扭頸等神經(jīng)癥狀，剖檢病變主要為卵泡膜出血、充血，卵泡變形萎縮等，部分出現(xiàn)腦膜出血。研究人員從表現(xiàn)產(chǎn)蛋驟降的病死種鴨中采集其卵巢、肝臟、腦等進行病毒分離，經(jīng)對所分離的病毒進行形態(tài)學(xué)觀察、理化特性測定、RT-PCR檢測及序列分析明確該病病原為黃病毒科(/^^iririifee)的一個新成員[1_3]。明確病因是為了更好地做好防治工作。當(dāng)務(wù)之急，做好鴨黃病毒感染的診斷和免疫防制工作是擺在科研工作者、基層獸醫(yī)和蛋鴨養(yǎng)殖戶面前的一件大事，建立鴨黃病毒抗體檢測方法，對該病的主動免疫效果評價、血清流行病學(xué)調(diào)查極有意義，而ELISA方法因其檢測通量大、結(jié)果確切、靈敏度高而倍受歡迎。目前，Su[4]等已初步建立起檢測鴨黃病毒病抗體的ELISA方法，但所建立的方法較為粗糙，數(shù)據(jù)不明，各種條件尚未優(yōu)化，不適于臨床應(yīng)用及推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能快速、簡便地檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA 方法，該方法也可對鴨黃病毒病進行快速診斷，以減少損失、提高養(yǎng)殖效益。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
以鴨黃病毒作為包被抗原，建立了檢測鴨血清中鴨黃病毒抗體的間接ELISA方法。所述鴨黃病毒為鴨黃病毒(Duck fla ν virus) WR株，保藏登記號為CGMCC NO. 4906。所述抗原先經(jīng)過濃縮，包括如下步驟收集含有鴨黃病毒的胚尿囊液后于4°C、 8000 r/min離心30 min,上清于45000 r/min離心4°C離心2 h,棄上清后沉淀用滅菌PBS 重懸，得到病毒濃縮液，儲存于-70°C。所述病毒濃縮液經(jīng)蔗糖梯度離心進一步純化，經(jīng)超速離心濃縮獲得。進一步純化的步驟為制備10%、20%、30%、40%和50%等5個梯度的蔗糖平衡液， 將病毒濃縮液加在10%蔗糖液上層，于4°C、40000 r/min水平離心2 h ；結(jié)果在10%_20%、 30%-40%、40%-50%間發(fā)現(xiàn)有病毒帶，收集各帶后4°C下45000 r/min離心2 h，棄上清后沉淀
3用滅菌PBS重懸，并用RT-PCR方法檢測各帶的病毒含量，以30%-40%帶病毒量最大，得到病毒純化液，儲存于一 70°C為抗原備用。 所述間接ELISA方法包括包被抗原、封閉、加樣、加酶標(biāo)二抗、顯色、終止。 所述間接ELISA方法的最佳工作條件為抗原稀釋3200倍，樣品稀釋160倍，酶標(biāo)
二抗稀釋濃度為1:3000，陰陽臨界值為0. 43。本發(fā)明的顯著優(yōu)點建立的檢測鴨黃病毒病抗體的間接ELISA方法，該方法可以對目前我國流行的鴨黃病毒病進行有效的診斷，并可開展大規(guī)模的血清流行病學(xué)調(diào)查，為鴨黃病毒病的防治和流行情況的掌握提供一種快速、簡便的檢測方法。
具體實施例方式實施例1
本發(fā)明的鴨黃病毒抗原，是通過如下方式獲得的 (1)抗原的濃縮
用半番胚大量培養(yǎng)本研究室分離鑒定的一株具有良好免疫活性的黃病毒W(wǎng)R株(菌株的保藏號CGMCC No. 4906，來源于申請人申請的一項發(fā)明專利申請?zhí)枮?01110143407. 6， 一種鴨黃病毒及其滅活疫苗)，收集含有病毒的胚尿囊液后于4°C、8000 r/min離心30 min, 上清于45000 r/min離心4°C離心2 h，棄上清后沉淀用滅菌PBS重懸，得到病毒濃縮液，儲存于-70°C。(2)抗原的純化
抗原的純化是通過蔗糖梯度離心及超速離心加以濃縮獲得。制備10%、20%、30%、40%和 50%等5個梯度的蔗糖平衡液，在10%蔗糖液上加上病毒濃縮液，于4°C、40000 r/min水平離心2 h后。在10%-20%、30%-40%、40%-50%間發(fā)現(xiàn)有病毒帶，收集各帶后4°C下45000 r/ min離心2 h，棄上清后沉淀用滅菌PBS重懸。并用RT-PCR方法檢測各帶的病毒含量，以 30%-40%帶病毒量最大，得到病毒純化液，儲存于一 70°C為抗原備用。實施例2
本發(fā)明的鴨黃病毒病陽性血清和陰性血清，是通過如下方式獲得的 (1)陽性血清
以WR株病毒純化液(實施例1步驟(2)得到的病毒純化液)用甲醛滅活后與弗氏完全佐劑按1 :1比例進行乳化，然后免疫成年開產(chǎn)蛋鴨，間隔15 d后再次免疫，三免后心臟采血、離心收集血清，于56°C滅活后并經(jīng)中和試驗證明為鴨黃病毒病陽性血清、備用。(2)陰性血清
采集沒有感染鴨黃病毒或未免疫過鴨黃病毒病疫苗的健康鴨的全血，離心后收集上清，于56°C滅活，并經(jīng)中和試驗證明為鴨黃病毒病陰性血清。實施例3
本發(fā)明的鴨黃病毒病抗體間接ELISA檢測方法的最適抗原抗體濃度、酶標(biāo)二抗體濃度及臨界值，是通過如下方式獲得的 (1)最適抗原抗體濃度
以矩陣法測定。以純化的抗原(病毒純化液)用包被液按1 100、1 200、1 400、1 800、 1 1600、1 3200、1 6400、1 12800,1 25600 進行稀釋，包被于 96 孔 Costar 酶標(biāo)板，4°C過夜后，以PBST洗滌3次后用5%脫脂牛奶37°C封閉2 h，以PBST洗滌3次，陰陽性血清以PBS 稀釋20倍、40倍、80倍、160倍、320倍和640倍，每個陰陽性血清滴度重復(fù)4次，與包被抗原進行作用2 h，以PBST洗滌3次后以1000倍的酶標(biāo)二抗進行反應(yīng)1 h后洗滌3次，TMB 顯色15 min后以2 mol/L H2S04終止反應(yīng)，并測定每孔的0D450值。由陰陽性血清的每個滴度的平均值的比值(P/N值)測定得到，在抗原稀釋3200倍，血清稀釋160倍時，P/N值最高，高達6.5，且陽性血清的00450值為1.092( 1)，所以抗原抗體最佳稀釋濃度為抗原稀釋3200倍，血清稀釋160倍。(2)酶標(biāo)二抗體濃度
以純化的抗原用包被液按1:3200進行稀釋，包被于96孔Costar酶標(biāo)板，4°C過夜后， 以PBST洗滌3次后用5%脫脂牛奶封閉2 h，以PBST洗滌3次，陰陽性血清以PBS稀釋160 倍，每個陰陽性血清滴度重復(fù)4次，與包被抗原進行作用2 h，以PBST洗滌3次后用酶標(biāo)二抗(1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800 和 1:25600 稀釋)進行反應(yīng) 1 h 后洗滌3次，TMB顯色15 min后以2 mol/L H2S04終止反應(yīng)，并測定每孔的0D450值。由陰陽性血清的每個滴度的平均值的比值(P/N值)測定得到，在酶標(biāo)二抗稀釋1 1600和1 3200 時，二者P/N值最高，分別達14和8. 16。但陽性血清的0D450值分別為2. 661和0. 922，調(diào)整酶標(biāo)二抗?jié)舛?1 1500、1 2000、1 2500、1 3000和1 3500)重新測定各個滴度的P/N值， 得到1 3000酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊腜/N值最大(P/N值為9)，且0D450值1. 094。故酶標(biāo)二抗最佳稀釋濃度為1:3000。(3)臨界值
通過測定30份陰性血清獲得。以純化的抗原用包被液按1:3200進行稀釋，包被于96 孔Costar酶標(biāo)板，4°C過夜后，以PBST洗滌3次后用5%脫脂牛奶37°C封閉2 h，以PBST洗滌3次，陰性血清以PBS稀釋160倍，與包被抗原進行作用2 h，以PBST洗滌3次后用酶標(biāo)二抗(1 3000稀釋)進行反應(yīng)1 h后洗滌3次，TMB顯色15 min后以2 mol/L H2S04終止反
應(yīng)，并測定每孔的0D450值。求得平均值JT為0. 2096，標(biāo)準(zhǔn)差SD = 0. 0719，所以陰陽臨界值=X + 3SD = 0. 2096 + 3X0. 079 = 0. 426 ^ 0. 43，因此判定樣品OD值如果高于臨界
值即為陽性，低于臨界值即為陰性。(4)特異性檢驗
以免疫過H9亞型禽流感疫苗、H5亞型禽流感疫苗、減蛋綜合征疫苗、鴨瘟疫苗、鴨大腸桿菌病疫苗鴨群血清抗體進行特異性檢驗。采集免疫過H9亞型禽流感疫苗、H5亞型禽流感疫苗、減蛋綜合征疫苗、鴨瘟疫苗、鴨大腸桿菌病疫苗的鴨群全血各10份，離心后收集血清備用；以純化的抗原(實施例1步驟(2)得到的純化液)用包被液按1:3200進行稀釋，包被于96孔Costar酶標(biāo)板，4°C過夜后，以PBST洗滌3次后用5%脫脂牛奶封閉2 h，以PBST 洗滌3次，將H9亞型禽流感、H5亞型禽流感、減蛋綜合征、鴨瘟、鴨大腸桿菌病血清、陽性血清、陰性血清以PBS稀釋160倍，與包被抗原進行作用2 h，以PBST洗滌3次后用酶標(biāo)二抗 (1:3000稀釋)進行反應(yīng)1 h后洗滌3次，TMB顯色15 min后以2 mol/L H2S04終止反應(yīng)， 并測定每孔的0D450值。結(jié)果免疫過H9亞型禽流感疫苗、H5亞型禽流感疫苗、減蛋綜合征疫苗、鴨瘟疫苗、鴨大腸桿菌病疫苗的鴨群的血清和陰性血清的0D450值均低于0. 43，而陽性血清0D450值高于0. 43。(5)重復(fù)性檢驗重復(fù)3次對陰、陽性血清的檢測。以純化的抗原用包被液按1:3200進行稀釋，包被于96孔Costar酶標(biāo)板，4°C過夜后，以PBST洗滌3次后用5%脫脂牛奶封閉2 h，以PBST 洗滌3次，陽性血清和陰性血清以PBS稀釋160倍，與包被抗原進行作用2 h，以PBST洗滌 3次后用酶標(biāo)二抗(1:3000稀釋)進行反應(yīng)1 h后洗滌3次，TMB顯色15 min后以2 mol/ LH2S04終止反應(yīng)，并測定每孔的0D450值。結(jié)果陰性血清的0D450值均低于0. 43，而陽性血清0D450值均高于0. 43。(6)對臨床樣品的檢測實例
某蛋鴨場飼養(yǎng)1500只，按常規(guī)免疫程序接種了 H5，H5 + H9禽流感疫苗。應(yīng)場方的要求，產(chǎn)蛋前我們采集20份血樣分離血清，對H5和H9抗體進行檢測，結(jié)果H5和H9血清抗體均大于41呢2。該鴨場產(chǎn)蛋高峰時產(chǎn)蛋率為85%，之后產(chǎn)蛋率在7天內(nèi)突然下降到30%，我們采集30份血樣分離血清，同時加上檢測H5和H9抗體的20份血清，按已建好的鴨黃病毒病血清抗體間接ELISA檢測方法進行檢測。結(jié)果產(chǎn)蛋前血清抗體0D450均低于0. 43，最高的為0. 28 ；產(chǎn)蛋率下降后血清抗體的0D450值參差不齊，僅有33%的血清低于0. 43，其它均高于臨界值，最高為1. 582，以此診斷該鴨群感染鴨黃病毒。參考文獻
(1)曹貞貞，張存，黃瑜，刁有祥，葉偉成，劉月煥，韓婧文，馬國明，張冬冬，許豐，王丹， 姜甜甜，袁媛，謝小雨，高緒慧，唐熠，施少華，萬春和，張晨，何玢，楊夢婕，陸新浩，張冰，張國中，馬學(xué)軍，張大丙.鴨出血性卵巢炎的初步研究[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46 (12) 3-6.
(2)萬春和，施少華，程龍飛，陳紅梅，傅光華，張大丙，林芳，林建生，黃瑜.一種引起種 (蛋)鴨產(chǎn)蛋驟降新病毒的分離與初步鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，25(6): 663-666.
(3)萬春和，施少華，程龍飛，陳紅梅，傅光華，彭春香，林芳，林建生，黃瑜.鴨出血性卵巢炎病毒RT-PCR檢測方法的建立[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，26 (1) :10-12.
(4)Jingliang Su, Shuang Li, Xudong Hu, Xiuling Yu, Yongyue Wang, Peipei Liu, Xishan Lu, Guozhong Zhang, Xueying Hu, Di Liu, Xiaoxia Li, Wenliang Su, Hao Lu, Ngai Shing Mok, Peiyi Wang, Ming Wang, Kegong Tian, George F. Gao. Duck Egg-Drop Syndrome Caused by BYD Virus, a New Tembusu-Related Flavivirus [J]. PLoS One. , 2011 Mar 24;6(3):el810權(quán)利要求
1.一種檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA方法，其特征在于以鴨黃病毒作為包被抗原，建立了檢測鴨血清中鴨黃病毒抗體的間接ELISA方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA方法，其特征在于 所述鴨黃病毒為鴨黃病毒Ofcd /Yaririrtt^ WR株，保藏登記號為CGMCC NO. 4906。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA方法，其特征在于 所述抗原先經(jīng)過濃縮，包括如下步驟收集含有鴨黃病毒的胚尿囊液后于4°C、8000 r/min 離心30 min，上清于45000 r/min離心4°C離心2 h，棄上清后沉淀用滅菌PBS重懸，得到病毒濃縮液，儲存于-70°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA方法，其特征在于 所述病毒濃縮液經(jīng)蔗糖梯度離心進一步純化，再經(jīng)超速離心濃縮獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA方法，其特征在于 進一步純化的步驟為制備10%、20%、30%、40%和50%等5個梯度的蔗糖平衡液，將病毒濃縮液加在10%蔗糖液上層，于40C >40000 r/min水平離心2 h ；結(jié)果在10%-20%、30%_40%、 40%-50%間發(fā)現(xiàn)有病毒帶，收集各帶后4°C下45000 r/min離心2 h，棄上清后沉淀用滅菌 PBS重懸，并用RT-PCR方法檢測各帶的病毒含量，以30%-40%帶病毒量最大，得到病毒純化液，儲存于一 70°C為抗原備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA方法，其特征在于 所述間接ELISA方法包括包被抗原、封閉、加樣、加酶標(biāo)二抗、顯色、終止。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA方法，其特征在于 所述間接ELISA方法的最佳工作條件為抗原稀釋3200倍，樣品稀釋160倍，酶標(biāo)二抗稀釋濃度為1:3000，陰陽臨界值為0. 43。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測鴨黃病毒病血清抗體的間接ELISA方法，以鴨黃病毒作為包被抗原，建立了檢測鴨血清中鴨黃病毒抗體的間接ELISA方法。該方法可以對目前我國流行的鴨黃病毒病進行有效的診斷，并可開展大規(guī)模的血清流行病學(xué)調(diào)查，為鴨黃病毒病的防治和流行情況的掌握提供一種快速、簡便的檢測方法。
文檔編號G01N33/569GK102384975SQ201110232858
公開日2012年3月21日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月15日
發(fā)明者萬春和, 傅光華, 施少華, 李敏, 梁昭平, 王斌, 王鑫, 程龍飛, 許芬芬, 陳紅梅, 黃瑜 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所