專利名稱：一種膠體金屬定量檢測技術及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種膠體金屬定量檢測技術及其用途。
背景技術：
柱層析技術是利用層析柱對生物分子進行分離和檢測的技術，其中層析柱是其常用的主體結(jié)構(gòu)。層析技術按層析的機理分為吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析、疏水層析等。吸附層析是利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析是利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。離子交換層析是利用不同組分對離子交換劑親和力的不同，使之分離。凝膠層析是利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同，使之分離。親和層析是在一對有專一的相互作用的物質(zhì)中，把其中之一聯(lián)結(jié)在支持物上，用于純化相對的另一物質(zhì)，常見 的親和對有酶和抑制劑、抗原和抗體、配體和受體等。柱層析技術是一中分離效率很高的分析分離手段與方法，它能夠?qū)⒏鞣N性質(zhì)極極其類似的物質(zhì)分離開，它既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定，又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。目前這種技術已廣泛應用于科學研究與工業(yè)生產(chǎn)的多個領域，在石油、化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學、環(huán)境科學、農(nóng)業(yè)科學等領域都發(fā)揮著十分重要的作用。膠體金屬，尤其是膠體金是一種常用的標記技術，是以膠體金作為示蹤標記物應用于免疫檢測，有其獨特的優(yōu)點，尤其是以簡單、快速和無污染為著稱。常用的免疫膠體金檢測技術有免疫膠體金光鏡染色法、免疫膠體金電鏡染色法、斑點免疫金滲濾法、膠體金免疫紙層析法，其中以膠體金免疫紙層析法，又稱試紙條法，最為常用，即將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑吸附在結(jié)合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。但這些方法只能進行定性和半定量分析，無法進行全定量分析。因此，開發(fā)一種采用全定量分析檢測技術，不僅使用方便，同時也可顯著提高工作效率，在檢測和分析、分離的諸多領域具有重要的實用意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種膠體金屬定量檢測技術及其用途，特別是以膠體金屬標記物作為檢測相的柱層析結(jié)構(gòu)的膠體金屬定量檢測技術。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案?！N膠體金屬定量檢測技術，以膠體金屬標記物作為檢測相的柱層析結(jié)構(gòu)，由層析柱、捕獲相、待檢物樣品、檢測相和檢測器組成。所述的檢測技術，具有如下特征1)用待檢物特異性結(jié)合物偶聯(lián)捕獲載體，制成捕獲相；2)捕獲相裝載于層析柱內(nèi)使用；3)檢測相由膠體金屬標記待檢物特異性結(jié)合物而制成；4)用檢測器檢測被捕獲的檢測相的量進而計算待檢物的含量和/或用檢測器檢測未被捕獲而流出的檢測相的量進而計算待檢物的含量。待檢物特異性結(jié)合物常用的有酶和抑制劑、抗原和抗體、配體和受體等。常用的捕獲載體有凝膠顆粒和磁微粒，凝膠顆粒有葡聚糖凝膠系列的凝膠過濾填料和瓊脂糖凝膠系列的凝膠過濾填料、葡聚糖凝膠系列的離子交換填料和瓊脂糖凝膠系列的離子交換填料、疏水層析填料、親和層析填料、纖維素類填料等，其中親和層析填料在本發(fā)明技術中最為常用，有溴化氰活化瓊脂糖凝膠介質(zhì)(CNBr Sepharose FF)、NHS活化瓊脂糖凝膠介質(zhì)等。所述的層析柱的結(jié)構(gòu)包括下列一種或一種以上的特性1)剛性管道結(jié)構(gòu)；2)非剛性管道結(jié)構(gòu)；3)為預裝柱；4)為使用前裝載的柱狀結(jié)構(gòu)；5)為加有開關控制裝置的管道結(jié)構(gòu)；6)為出樣端易于去除過濾截留出口而使柱內(nèi)固相填料易于轉(zhuǎn)離柱層析結(jié)構(gòu)進行下一級分析的柱狀結(jié)構(gòu)。剛性管道結(jié)構(gòu)常見為實驗室常用的兩端接有接口或不接有接口的玻璃、有機玻璃、不銹鋼等材質(zhì)的層析柱，也包括為某些分析特制的硬質(zhì)材料的柱狀結(jié)構(gòu)。非剛性管道結(jié)構(gòu)多指塑料、橡膠、硅膠等材料制成的可以隨意圈曲的管道結(jié)構(gòu)，兩端接有接口或不接有接口。本發(fā)明技術所采用的層析柱包括預裝柱和使用前進行裝載的層析柱，考慮使用的方便程度預裝柱將作為優(yōu)選，同時在預裝柱上加建出樣端過濾截留出口易于被去除而使柱內(nèi)固相填料易于轉(zhuǎn)離柱層析結(jié)構(gòu)。本發(fā)明技術所采用的層析柱其管道結(jié)構(gòu)也是優(yōu)選對象，在檢測時層析填料被固定在管道的特定部位進行，分析完成后被排出管道，再進行新的 分析檢測。所述的捕獲相中的捕獲載體包括包括但不限于1)凝膠顆粒；2)磁微粒。其中凝膠顆粒為多種柱層析填料，常用親和層析填料，磁微粒為適用于待檢物特異性結(jié)合物，如抗體、抗原等，進行標記的磁性微粒。所述的待檢物樣品為來源于人體和動物體可進行疾病診斷和健康檢測的樣品以及用于環(huán)境、藥物分析、食品和工業(yè)分析的樣品。所述的膠體金屬包括常用的膠體金以及其它膠體金屬顯色劑，如膠體硒、膠體銀、膠體銅、膠體鐵。所述的檢測器所用的檢測方法包括但不限于1)被檢測的檢測相為液相時，直接用比色法測定待檢測液相顏色的深度進行檢測；2)被檢測的檢測相為液相時，通過紙層析技術將待檢液相中膠體金屬吸附到紙質(zhì)材料上，形成顯色帶，用密度法測定待檢測液相所形成的顯色帶的深度進行檢測。所述的檢測技術包括下列一種或一種以上的步驟1)用待檢物特異性結(jié)合物偶聯(lián)捕獲載體，制成捕獲相；2)將捕獲相裝載于柱層析結(jié)構(gòu)內(nèi)；3)用膠體金屬標記待檢物特異性結(jié)合物，制成檢測相；4)將含有待檢物的待檢樣品加載至柱層析結(jié)構(gòu)上，然后流經(jīng)捕獲相，待檢物被捕獲；5)用清洗液清洗層析柱內(nèi)的捕獲相上未被結(jié)合而殘留的待檢物及其待檢樣品；6)將檢測相加載至柱層析結(jié)構(gòu)上，然后流經(jīng)捕獲相，檢測相與被捕獲的待檢物特異性結(jié)合，形成捕獲相-待檢物-檢測相復合物，進而捕獲檢測相；7)直接檢測未被捕獲而流出的檢測相的量進而計算待檢物的含量；8)用洗脫液洗脫被捕獲的檢測相和檢測相復合物，檢測檢測相和檢測相復合物的量進而計算待檢物的含量。所述的檢測技術，其特征在于聯(lián)合使用多種膠體金屬顯色信號放大技術提高檢測靈敏度，包括免疫金銀染色放大技術、生物素-親合素放大技術、生物素一鏈霉親合素放大技術、第二抗體結(jié)合放大技術。所述的檢測技術在多種檢測產(chǎn)品開發(fā)中的應用。有環(huán)境、臨床、藥物分析、食品和工業(yè)分析等多領域的檢測產(chǎn)品。
[有益效果]
I)本發(fā)明創(chuàng)造性地將柱層析分析技術與膠體金技術進行了有機結(jié)合，設計了柱層析膠體金檢測技術，明顯提高了膠體金技術檢測的準確性，實現(xiàn)膠體金全定量檢測的目的。2)本發(fā)明將待檢樣品的吸附分離過程全部控制在層析柱上，簡化了操作程序，方便了使用，降低了檢測成本。3)本發(fā)明采用柱層析吸附分離技術，大大簡化了在儀器配制設計制作中的復雜程 度，降低儀器的設計和生產(chǎn)成本。因此，本發(fā)明技術對改善現(xiàn)有化學發(fā)光檢測技術具有重要的意義和良好的應用前
旦
-5^ O具體實施方式
]
通過以下具體實施實例，可以進一步了解本發(fā)明，但以下實例不是對本發(fā)明的限定。實施例I、本發(fā)明技術與現(xiàn)行化學發(fā)光檢測技術檢測結(jié)果的比較
實驗材料裝有抗人血紅蛋白多克隆抗體標記的NHS活化瓊脂糖凝膠介質(zhì)50ul的預裝層析柱、抗人血紅蛋白多克隆抗體標記的NHS活化瓊脂糖凝膠介質(zhì)、辣根過氧化物酶標記抗人血紅蛋白單克隆抗體、膠體金標記抗人血紅蛋白單克隆抗體、魯米諾、對碘苯酹、過氧化脲、化學發(fā)光檢測儀、分光光度儀、人血紅蛋白溶液。實驗方法取已知濃度的人血紅蛋白溶液，用PBS溶液稀釋配置100ng、300 ng、700 ng、lug、3ug、7ug 人血紅蛋白溶液和 10ng、30 ng、70 ng、100ng、300ng、700ng 人血紅蛋白溶液。另取健康人全血，加入等量的去離子水溶血釋放血紅蛋白，再用PBS進行1000倍稀釋用于本發(fā)明技術測定，再用PBS進行10000倍稀釋用于化學發(fā)光技術測定。本發(fā)明技術測定100ng、300 ng、700 ng、lug、3ug、7ug人血紅蛋白溶液并繪制標準曲線,然后測定健康人血紅蛋白，并計算血紅蛋白濃度。化學發(fā)光技術測定10ng、30 ng、70 ng、100ng、300ng、700ng人血紅蛋白溶液并繪制標準曲線，然后測定健康人血紅蛋白，并計算血紅蛋白濃度。取42個試管，分為本發(fā)明技術組和現(xiàn)行化學發(fā)光檢測技術組。每個樣品做3個平行管。現(xiàn)行化學發(fā)光檢測技術組，每管加入抗人血紅蛋白多克隆抗體標記的NHS活化瓊脂糖凝膠介質(zhì)50ul，再分別加入已知濃度的人血紅蛋白溶液和待測健康人血紅蛋白溶液各50ul, 37°C震搖溫育30分鐘(之前實驗證實37°C震搖溫育30分鐘為最佳反應時間)，3000轉(zhuǎn)、分離心3分鐘，棄上清，加入PBS 300ul,混勻，3000轉(zhuǎn)、分離心3分鐘，棄上清，加入辣根過氧化物酶標記抗人血紅蛋白單克隆抗體50ul，37°C震搖溫育30分鐘(之前實驗證實37°C震搖溫育30分鐘為最佳反應時間)，3000轉(zhuǎn)、分離心3分鐘，棄上清，加入PBS 300ul,混勻，3000轉(zhuǎn)、分離心3分鐘,棄上清,轉(zhuǎn)移凝膠介質(zhì)至發(fā)光杯,加入IOOul魯米諾、對碘苯酹和過氧化脲等配置的發(fā)光底物工作液，反應進行2分鐘時，記錄發(fā)光量6秒鐘，計算樣品含量。本發(fā)明技術組，取裝有抗人血紅蛋白多克隆抗體標記的NHS活化瓊脂糖凝膠介質(zhì)50ul的預裝層析柱，分別加入已知濃度的人血紅蛋白溶液和待測健康人血紅蛋白溶液各50ul,收集流出液，加入PBS緩沖液IOOul，收集并合并流出液，合并流出液重新上樣兩次，共約2分鐘，再加入PBS緩沖液300ul清洗，棄流出液，加入膠體金標記抗人血紅蛋白單克隆抗體50ul，收集流出液，加入PBS緩沖液IOOul，收集并合并流出液，合并流出液重新上樣兩次，共約2分鐘，收集合并流出液，轉(zhuǎn)移合并流出液至比色杯，用分光光度儀進行比色，記錄520nm處的吸光值(OD)，計算樣品含量。預裝層析柱再用300ul PBS緩沖液清洗，然后用150ul親和洗脫液分三次進行洗脫，并收集洗脫液，轉(zhuǎn)移洗脫液至比色杯，用分光光度儀進行比色，記錄520nm處的吸光值(OD)，計算樣品含量。實驗結(jié)果現(xiàn)行技術完成實驗時間80分鐘，測定結(jié)果3. llug/50ul，本發(fā)明流出 液檢測技術完成實驗時間15分鐘，測定結(jié)果3. 09ug/50ul，洗脫液檢測技術完成時間為18分鐘，測定結(jié)果3. 26ug/50ul，兩種實驗方法所得結(jié)果基本一致，但本發(fā)明的完成實驗時間明顯短于現(xiàn)行技術。
權(quán)利要求
1.一種膠體金屬定量檢測技術，其特征在于所述的檢測技術是以膠體金屬標記物作為檢測相的柱層析結(jié)構(gòu)，由層析柱、捕獲相、待檢物樣品、檢測相和檢測器組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的檢測技術，具有如下特征 1)用待檢物特異性結(jié)合物偶聯(lián)捕獲載體，制成捕獲相； 2)捕獲相裝載于層析柱內(nèi)使用； 3)檢測相由膠體金屬標記待檢物特異性結(jié)合物而制成； 4)用檢測器檢測被捕獲的檢測相的量進而計算待檢物的含量和/或用檢測器檢測未被捕獲而流出的檢測相的量進而計算待檢物的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求I-2任一所述的檢測技術，其特征在于所述的層析柱的結(jié)構(gòu)包括下列一種或一種以上的特性 1)剛性管道結(jié)構(gòu)； 2)非剛性管道結(jié)構(gòu)； 3)為預裝柱； 4)為使用前裝載的柱狀結(jié)構(gòu)； 5)為加有開關控制裝置的管道結(jié)構(gòu)； 6)為出樣端過濾截留出口易于被去除而使柱內(nèi)固相填料易于轉(zhuǎn)離柱層析結(jié)構(gòu)進行下一級分析的柱狀結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I-3任一所述的檢測技術，其特征在于所述的捕獲相中的捕獲載體包括包括但不限于 1)凝膠顆粒； 2)磁微粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求I-4任一所述的檢測技術，其特征在于所述的待檢物樣品為來源于人體和動物體可進行疾病診斷和健康檢測的樣品以及用于環(huán)境、藥物分析、食品和工業(yè)分析的樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求I-5任一所述的檢測技術，其特征在于所述的膠體金屬包括膠體金、膠體硒、膠體銀、膠體銅、膠體鐵。
7.根據(jù)權(quán)利要求I-6任一所述的檢測技術，其特征在于所述的檢測器所用的檢測方法包括但不限于 1)被檢測的檢測相為液相時，直接用比色法測定待檢測液相顏色的深度進行檢測； 2)被檢測的檢測相為液相時，通過紙層析技術將待檢液相中膠體金屬吸附到紙質(zhì)材料上，形成顯色帶，用密度法測定待檢測液相所形成的顯色帶的深度進行檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的檢測技術，其特征在于所述的檢測技術包括下列一種或一種以上的步驟 1)用待檢物特異性結(jié)合物偶聯(lián)捕獲載體，制成捕獲相； 2)將捕獲相裝載于柱層析結(jié)構(gòu)內(nèi)； 3)用膠體金屬標記待檢物特異性結(jié)合物，制成檢測相； 4)將含有待檢物的待檢樣品加載至柱層析結(jié)構(gòu)上，然后流經(jīng)捕獲相，待檢物被捕獲； 5)用清洗液清洗層析柱內(nèi)的捕獲相上未被結(jié)合而殘留的待檢物及其待檢樣品； 6)將檢測相加載至柱層析結(jié)構(gòu)上，然后流經(jīng)捕獲相，檢測相與被捕獲的待檢物特異性結(jié)合，形成捕獲相-待檢物-檢測相復合物，進而捕獲檢測相； 7)直接檢測未被捕獲而流出的檢測相的量進而計算待檢物的含量； 8)用洗脫液洗脫被捕獲的檢測相和檢測相復合物，檢測檢測相和檢測相復合物的量進而計算待檢物的含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的檢測技術，其特征在于聯(lián)合使用多種膠體金屬顯色信號放大技術提高檢測靈敏度，包括免疫金銀染色放大技術、生物素-親合素放大技術、生物素一鏈霉親合素放大技術、第二抗體結(jié)合放大技術。
10.權(quán)利要求I-9任一所述的檢測技術在多種檢測產(chǎn)品開發(fā)中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠體金屬定量檢測技術，由層析柱、捕獲相、待檢物樣品、檢測相和檢測器組成，可用于多種分析檢測技術產(chǎn)品的開發(fā)，具有良好的適用價值和市場前景。
文檔編號G01N30/50GK102680619SQ20111005513
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者劉鳳鳴 申請人:北京康華源醫(yī)藥信息咨詢有限公司