專(zhuān)利名稱(chēng)：一種奶牛宮頸粘液中抗精子抗體的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種奶牛宮頸粘液中抗精子抗體的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
抗精子抗體(antisperm antibody,AsAb)能與精子結(jié)合產(chǎn)生免疫反應(yīng)而影響生殖能力。精子對(duì)雄性具有抗原性，而精子對(duì)雌性而言是同種異體免疫抗原，每一次交配都相當(dāng)于一次免疫接種。生殖道局部和血清抗精子抗體是機(jī)體對(duì)精子抗原產(chǎn)生自身或同種異體免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，是引起免疫性不孕的主要原因。奶牛生產(chǎn)環(huán)節(jié)的核心是繁殖，防治不孕是要解決的首要問(wèn)題?？咕涌贵w對(duì)不育的影響，在奶牛的群體當(dāng)中普遍存在，而相當(dāng)一部分抗精子免疫不孕牛可以通過(guò)適當(dāng)?shù)尼槍?duì)性技術(shù)措施加以防治。奶牛免疫不孕可能并沒(méi)有明顯的征兆，周期正常、卵泡發(fā)育與排卵均正常，與明顯的其他不孕類(lèi)型相比更加隱蔽，對(duì)生產(chǎn)影響更為嚴(yán)重。早發(fā)現(xiàn)并采取必要防治措施非常重要?？咕涌贵w的檢測(cè)方法還有間接免疫珠試驗(yàn)、間接混合抗球蛋白反應(yīng)試驗(yàn)、精子制動(dòng)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫膠體金滲濾斑點(diǎn)試驗(yàn)，等。間接免疫珠試驗(yàn)(I-BT)和間接混合抗球蛋白反應(yīng)試驗(yàn)(I-MAR)試驗(yàn)方法和原理與IBT和MAR相同。唯一區(qū)別在于使用正常供體新鮮精液代替不育癥患者精液，以去精漿供體精子與待測(cè)體液標(biāo)本共同培養(yǎng)，使供體精子與標(biāo)本中可能存在的AsAb結(jié)合，檢測(cè)是否通過(guò)培養(yǎng)使供體精子獲得了結(jié)合免疫珠的能力，或與MAR標(biāo)記顆粒發(fā)生混合凝集的能力， 判斷標(biāo)本中AsAb的存在。I-IBT也是WHO推薦用于體液AsAb檢測(cè)的方法。與I-MAR相比， 其優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)IgA類(lèi)AsAb。還可以識(shí)別AsAb在精子表面的定位。精子制動(dòng)試驗(yàn)(SIT)設(shè)計(jì)原理為抗體依賴(lài)的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)，主要用于體液標(biāo)本中精子制動(dòng)抗體的檢測(cè)。將補(bǔ)體加熱滅活后的患者血清和供者健康精子混合后， 加入外源補(bǔ)體，若患者體液中含精子制動(dòng)抗體，則出現(xiàn)精子運(yùn)動(dòng)力降低或死亡。由于只有 IgG類(lèi)型的AsAb才能被補(bǔ)體固定，而對(duì)于體液中占多數(shù)的IgA類(lèi)AsAb則不能被檢測(cè)；另外， 有些結(jié)合于精子頭部、而不引起精子制動(dòng)作用的IgG類(lèi)AsAb，也不能被檢測(cè)；同時(shí)，本試驗(yàn)檢測(cè)主觀(guān)性較強(qiáng)，檢測(cè)程序的數(shù)字化有助于避免主觀(guān)判斷的誤差。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)常用的方法為使用全精子或精子提取物包被多孔塑料板，由于全精子包被過(guò)程所導(dǎo)致的一些精子特異性抗原的變性和精子非特異性?xún)?nèi)部抗原的暴露，以及精子膜提取物包被可能缺失一些生育相關(guān)的關(guān)鍵抗原，其檢測(cè)特異性不高。同時(shí)，由于這類(lèi)方法幾乎一概存在高背景噪音，實(shí)際靈敏度也不高。使用純化精子特異性抗原作為ELISA的包被抗原，有望克服以上的缺點(diǎn)，從而使ELISA法最終成為一種真正實(shí)用的特異性AsAb檢測(cè)方法。免疫膠體金滲濾斑點(diǎn)試驗(yàn)(DIGFA)以紅色膠體金代替酶作為標(biāo)記物進(jìn)行斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)(DIBA)。其測(cè)定原理是利用微孔膜的可濾性，在其反應(yīng)膜上固定有精子抗原提取物，膜下裝有吸水墊料，依次加入待測(cè)血清和膠體金標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白(SPA)，若血清中含有AsAb，即可在膜上顯色。該法敏感、快速、簡(jiǎn)便，是目前國(guó)內(nèi)臨床上較為常用的 AsAb檢測(cè)方法，并有成品試劑盒出售。但同樣不能定量，也不能排除生育無(wú)關(guān)AsAb引起的假陽(yáng)性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)奶?？咕涌贵w的方法，該檢測(cè)方法能夠簡(jiǎn)易、快速檢出奶牛群抗精子免疫不孕牛的方法。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的技術(shù)方案是一種奶牛宮頸粘液中抗精子抗體的檢測(cè)方法，包括下列步驟1)取奶牛發(fā)情盛期的宮頸粘液在-20°C進(jìn)行冷凍備用；2)取0.25ml活率彡0.40、密度彡IO8精子/ml的公牛細(xì)管凍精，38°C水浴解凍， 700g離心Smin后棄上清液，加入EBSS Iml懸浮，將懸浮液鋪在預(yù)先放有2ml含10%胎牛血清的EBSS的試管底部，傾斜45°在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45min，取上層清液；3)將500 μ 1濃度為60 μ g/ml 160 μ g/ml的菠蘿蛋白酶液加入500 μ 1室溫下化凍宮頸粘液中，37°C溫育30minJ600g離心15min ；4)將步驟 3)的上清液用 EBSS 液作 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 共8個(gè)梯度稀釋至15 μ L，再加入15 μ L步驟幻制備的上層清液混勻，覆以20 μ L石蠟油， 5% C02、37°C孵育30min，凝集精子數(shù)計(jì)N，精子總數(shù)計(jì)阪，以N/阪彡10%判定為抗精子抗體陽(yáng)性，< 10%為抗精子抗體陰性。本發(fā)明檢測(cè)奶牛抗精子抗體的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明的檢測(cè)方法能夠簡(jiǎn)易、快速檢出奶牛群體中抗精子抗體免疫不孕牛的方法，不需要許多價(jià)值昂貴的實(shí)驗(yàn)室儀器，在普通光學(xué)顯微鏡下即能觀(guān)察到精子凝集現(xiàn)象，能夠廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中。2)本發(fā)明的檢測(cè)材料是奶牛發(fā)情盛期時(shí)的宮頸粘液，而宮頸粘液中的抗精子抗體檢測(cè)陽(yáng)性率明顯高于血清中的抗精子抗體，因而具有更高的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)發(fā)明人給出的試驗(yàn)例和具體實(shí)施方式
來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1材料和方法材料正常生殖能力3頭公牛的細(xì)管凍精(活率彡0. 40，密度彡IO8精子/ml)。根據(jù)配種記錄和直腸檢查結(jié)果確定23頭屢配不孕奶牛作實(shí)驗(yàn)牛和20頭正常牛用作對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)， 在直檢后刺激其宮頸待其流出發(fā)情盛期宮頸粘液后，用注射器吸取注入事先高壓處理過(guò)的青霉素小瓶中，進(jìn)行密封，-20°C進(jìn)行冷凍備用。主要試劑和儀器主要試劑PBS磷酸緩沖液，1 %胎牛血清的Earle’ s平衡鹽液(EBSQ，液氮罐，水浴鍋，超凈工作臺(tái)，生物顯微鏡，血球計(jì)數(shù)板，微量加樣器，高速冷凍離心機(jī)(Sigma;3K30型， 德國(guó))，菠蘿蛋白酶(BIO BASIC)，液體石蠟。
主要儀器96孔聚苯乙烯微量測(cè)定板(Biochemical，加拿大)，熒光高級(jí)研究倒置顯微鏡(TE2000E,日本)，CO2培養(yǎng)箱(MC0-15A,日本)。方法精子懸液優(yōu)化兩組各分別取三頭公牛6管0. 25ml凍精O管/頭)，38 °C水浴解凍，裝入兩個(gè)2ml 離心管中，700 X g離心Smin后棄上清液，分別加入EBSS (處理組)和PBS (對(duì)照組)Iml懸浮，將懸浮液分別小心地用注射器鋪在另兩個(gè)預(yù)先放有2ml含10%胎牛血清的EBSS和PBS 的試管底部，傾斜45°在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45min，分別取上層清液^il,血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)密度與活力，對(duì)活率彡0. 6、密度彡3 X IO7精子/ml的優(yōu)化精子懸液調(diào)密度至3 X IO7 精子/ml備用。菠蘿蛋白酶液的濃度優(yōu)化三蒸水配制濃度分別為10μ g/ml、20y g/ml、40y g/ml、80y g/ml、160y g/ml 菠蘿蛋白酶液，分別以不同濃度500 μ 1菠蘿蛋白酶液加入500 μ 1化凍宮頸粘液中，37°C溫育 30min,解粘液有拉絲現(xiàn)象標(biāo)記為“ + ”，無(wú)拉絲現(xiàn)象為“_”。解粘液^OOX g離心15min取 15ul加入96孔培養(yǎng)板并在各孔再加入15ul精子懸液混勻，倒置鏡下觀(guān)察判斷，精子不能游動(dòng)標(biāo)為“一-a”，可作轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)等小幅度運(yùn)動(dòng)標(biāo)為“一a”，速度明顯較慢標(biāo)為“_a”，速度正常，與在精子稀釋液中運(yùn)動(dòng)狀態(tài)一樣時(shí)標(biāo)為“a”。篩選“a”結(jié)果的菠蘿蛋白酶液的優(yōu)化濃度。淺盤(pán)凝集法檢測(cè)宮頸粘液AsAb將宮頸粘液放入平皿自然攤薄，蓋蓋后水平放入_20°C冰箱凍結(jié)，手術(shù)刀片劃取約 500 μ L放入1. 5ml離心管中，融化后每管中分別加等量的新鮮配制的優(yōu)化濃度菠蘿蛋白酶液，37°C溫育30min, 2600 X g離心15min,在96孔板中，上清液用EBSS液作1/2、1/4、1/8、 1/16、1/32、1/64、1/128,1/256共8個(gè)梯度稀釋至15 μ L，分別加入15 μ L精子懸液混勻，覆以20μ L石蠟油，同時(shí)設(shè)精子懸液作對(duì)照，5% C02、37°C孵育30min，倒置顯微鏡下計(jì)算凝集精子比例(觀(guān)察不重復(fù)視野的精子總數(shù)大于200個(gè)，取兩人重復(fù)計(jì)算均值)，凝集精子數(shù)計(jì) N，精子總數(shù)計(jì)Nz，以N/Nz彡10%判定為陽(yáng)性，標(biāo)為“ + ”，< 10%為陰性，標(biāo)為“-”。正常牛宮頸粘液，1/2稀釋倍數(shù)時(shí)AsAb陽(yáng)性率為80 %，但平均精子凝集率為 10. 8%, 1/4稀釋倍數(shù)時(shí)均不能達(dá)到10%的凝集率，全部呈陰性，1/4稀釋比可作為正常牛判斷界限；全部不孕牛到1/64稀釋倍數(shù)的凝集率均> 10%，全為陽(yáng)性，在1/128時(shí)AsAb陽(yáng)性率為20%，精子凝集率為7.5%，不孕?？捎?/64稀釋比作為判定標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例11)根據(jù)配種記錄和直腸檢查結(jié)果確定屢配不孕奶牛，在直檢后刺激其宮頸待奶牛發(fā)情盛期的宮頸粘液在-20°C進(jìn)行冷凍備用；2)取0. 25ml活率彡0. 40、密度彡IO8精子/ml的公牛細(xì)管凍精，38°C水浴解凍， 700g離心Smin后棄上清液，加入EBSS Iml懸浮，將懸浮液鋪在預(yù)先放有2ml含10%胎牛血清的EBSS的試管底部，傾斜45°在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45min，取上層清液；3)將500 μ 1濃度為80 μ g/ml的菠蘿蛋白酶液加入500 μ 1室溫下化凍宮頸粘液中，37°C溫育 30min，2600g 離心 15min ；4)將步驟 3)的上清液用 EBSS 液作 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256共8個(gè)梯度稀釋至15 μ L，再加入15 μ L步驟幻制備的上層清液混勻，覆以20 μ L石蠟油， 5% C02、37°C孵育30min，倒置顯微鏡下計(jì)算凝集精子比例。在1/64稀釋倍數(shù)時(shí)，凝集精子數(shù)N為37個(gè)，精子總數(shù)阪為223個(gè)，精子凝集率N/^zl6. 6%，N/Nz彡10%判定結(jié)果為抗精子抗體陽(yáng)性，與實(shí)際生產(chǎn)結(jié)果一致。實(shí)施例21)根據(jù)配種記錄和直腸檢查結(jié)果確定屢配不孕奶牛，在直檢后刺激其宮頸待奶牛發(fā)情盛期的宮頸粘液在-20°C進(jìn)行冷凍備用；2)取0. 25ml活率彡0. 40、密度彡IO8精子/ml的公牛細(xì)管凍精，38°C水浴解凍， 700g離心Smin后棄上清液，加入EBSS Iml懸浮，將懸浮液鋪在預(yù)先放有2ml含10%胎牛血清的EBSS的試管底部，傾斜45°在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45min，取上層清液；3)將500 μ 1濃度為120 μ g/ml的菠蘿蛋白酶液加入500 μ 1室溫下化凍宮頸粘液中，37°C溫育 30min，2600g 離心 15min ；4)將步驟 3)的上清液用 EBSS 液作 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 共8個(gè)梯度稀釋至15 μ L，再加入15 μ L步驟幻制備的上層清液混勻，覆以20 μ L石蠟油， 5% C02、37°C孵育30min，倒置顯微鏡下計(jì)算凝集精子比例，在1/64稀釋倍數(shù)時(shí)，凝集精子數(shù)N為29，精子總數(shù)阪為M0，精子凝集率N/阪為12. 1%，N/Nz彡10%判定結(jié)果為抗精子抗體陽(yáng)性，與實(shí)際生產(chǎn)結(jié)果一致。實(shí)施例31)取奶牛發(fā)情盛期的宮頸粘液在-20°C進(jìn)行冷凍備用；2)取0. 25ml活率彡0. 40、密度彡IO8精子/ml的公牛細(xì)管凍精，38°C水浴解凍， 700g離心Smin后棄上清液，加入EBSS Iml懸浮，將懸浮液鋪在預(yù)先放有2ml含10%胎牛血清的EBSS的試管底部，傾斜45°在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45min，取上層清液；3)將500 μ 1濃度為160 μ g/ml的菠蘿蛋白酶液加入500 μ 1室溫下化凍宮頸粘液中，37°C溫育 30min，2600g 離心 15min ；4)將步驟 3)的上清液用 EBSS 液作 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 共8個(gè)梯度稀釋至15 μ L，再加入15 μ L步驟幻制備的上層清液混勻，覆以20 μ L石蠟油， 5% C02、37°C孵育30min，倒置顯微鏡下計(jì)算凝集精子比例，在1/4稀釋倍數(shù)時(shí)，凝集精子數(shù) N為7，精子總數(shù)阪為203，精子凝集率N/阪為3.4%，N/Nz < 10%為抗精子抗體陰性，可以判定該牛為可孕牛。
權(quán)利要求
1. 一種奶牛宮頸粘液中抗精子抗體的檢測(cè)方法，其特征在于，包括下列步驟1)取奶牛發(fā)情盛期的宮頸粘液在-20°C進(jìn)行冷凍備用；2)取0.25ml活率彡0. 40、密度彡IO8精子/ml的公牛細(xì)管凍精，38°C水浴解凍，700g 離心Smin后棄上清液，加入EBSS Iml懸浮，將懸浮液鋪在預(yù)先放有2ml含10%胎牛血清的 EBSS的試管底部，傾斜45°在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45min，取上層清液；3)將500μ 1濃度為60 μ g/ml 160 μ g/ml的菠蘿蛋白酶液加入500 μ 1室溫下化凍宮頸粘液中，37°C溫育30min,2600g離心15min ；4)將步驟3)的上清液用 EBSS 液作 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 共 8 個(gè)梯度稀釋至15 μ L，再加入15 μ L步驟幻制備的上層清液混勻，覆以20 μ L石蠟油，5% C02、37°C孵育30min，凝集精子數(shù)計(jì)N，精子總數(shù)計(jì)阪，以N/阪彡10%判定為抗精子抗體陽(yáng)性，< 10%為抗精子抗體陰性。
全文摘要
本發(fā)明分開(kāi)了一種奶牛宮頸粘液中抗精子抗體的檢測(cè)方法，包括1)取奶牛發(fā)情盛期的宮頸粘液備用；2)取公牛細(xì)管凍精、離心棄上清液，加入EBSS懸浮，將懸浮液鋪在預(yù)先放有含10％胎牛血清的EBSS的試管底部，培養(yǎng)箱中孵育45min，取上層清液；3)將菠蘿蛋白酶液加入室溫下化凍宮頸粘液中離心；4)將步驟3)的上清液用EBSS液稀釋后加入15μL步驟2)制備的上層清液混勻，覆以20μL石蠟油，孵育30min，凝集精子數(shù)計(jì)N，精子總數(shù)計(jì)Nz，以N/Nz≥10％判定為抗精子抗體陽(yáng)性，＜10％為抗精子抗體陰性。該檢測(cè)方法能夠簡(jiǎn)易、快速檢出奶牛群抗精子免疫不孕牛的方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102253203SQ20111005499
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者韓春梅, 馬瑛, 高慶華 申請(qǐng)人:塔里木大學(xué)