專利名稱：檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥注射液檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法。
背景技術(shù)：
高分子物質(zhì)研究是本探索性研究的主要內(nèi)容，清開靈注射液中的不良反應(yīng)較多， 文獻(xiàn)報道的焦點多數(shù)是有關(guān)高分子量等大分子物質(zhì)。由于方法的限制，這類高分子量的測定一直沒有開展。含有高分子量物質(zhì)的清開靈注射液產(chǎn)品，從安全性角度考慮，患者在應(yīng)用時需要進(jìn)行皮試試驗。但是皮試試驗僅能對速發(fā)型I型變態(tài)反應(yīng)有預(yù)測作用，且陽性符合度僅30%，即使皮試試驗呈陰性也不能說明以后不發(fā)生過敏反應(yīng)，臨床可能出現(xiàn)的變態(tài)反應(yīng)還有II、III、IV型變態(tài)反應(yīng)，這是皮試試驗無法預(yù)測的。因此，為了確保臨床用藥的安全有效，對清開靈注射液產(chǎn)品中高分子量物質(zhì)的含量進(jìn)行檢測，對可能帶入的高分子量物質(zhì)進(jìn)行有效地監(jiān)控，從源頭上控制臨床過敏反應(yīng)的發(fā)生，既可以節(jié)約寶貴的臨床急救時間，同時也增加了臨床醫(yī)護(hù)人員與患者的便利性，減輕了患者的用藥痛苦，具有非常重要的意義。故有必要設(shè)計一款新的凝膠色譜測定方法來彌補(bǔ)這些缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種簡便易行、耗費(fèi)少、 時間短、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性都很好的檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜檢測方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法，該方法包括下列步驟a、對照溶液的制備取核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺素 α、人生長激素釋放抑制因子對照品溶液各1ml，置25ml量瓶中，加水稀釋并定容至刻度， 即得對照品溶液I ；再取對照溶液I 2. 5ml，定容至25ml，即得對照溶液II ；b、供試品溶液的制備取供試品溶液10ml，至20ml的超濾離心管中，在10000轉(zhuǎn)/min離心15分鐘，取殘留物加水定容至1ml，即得；C、測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ 1，注入液相色譜儀，以各對照品的分子量(MW)的對數(shù)與其相應(yīng)保留時間(tR)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程IogMW = a+b tR，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計算分子量為10000,5000及 1000物質(zhì)的保留時間，以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值；d、測量最低檢出限取對照溶液II分別依次進(jìn)樣25μ 1、20μ 1、15μ 1、10μ 1、5μ 1，可發(fā)現(xiàn)在進(jìn)樣10μ 1核糖核酸酶A的峰高與基線噪音的比例約為3 1，即得最低檢出限；e、檢測樣品基質(zhì)干擾的影響分別取對照品溶液II 2ml,3ml,4ml置于5ml量瓶中，用清開靈注射液分別稀釋至刻度，依次進(jìn)樣25 μ 1測試，檢測樣品基質(zhì)對檢測靈敏度的干擾；f、模擬試驗?zāi)M水牛角粉、 珍珠母粉的提取工藝，分別在水解2、4、6、8小時取樣，檢測水解過程中特異蛋白的存在；g、 樣品的測定采用供試品溶液的制備方法對10批樣品進(jìn)行檢測，注射液的生產(chǎn)工藝控制截取保留相對分子量6000以下的有效物質(zhì)。
上述步驟中高效液相色譜的條件為色譜柱為凝膠色譜柱TSK G2000 Sffxl柱；流動相為乙腈-0. 83%三氟乙酸溶液；檢測波長為214士 Inm ；流速0. 70 0. 75ml/min。所述供試品溶液色譜圖中，選用體積排除色譜先于分子量5800的保留時間的峰作為高分子量物質(zhì)的峰，按面積歸一化法計算，含高分子量物質(zhì)的量< 1. 0%。測定過程中所述三氟乙酸溶液作為分析純，所述乙腈作為色譜純。葡聚糖凝膠法測定蛋白質(zhì)分子量的原理，主要是依據(jù)凝膠具有分子篩作用，一定型號的凝膠具有大體上一定大小的孔徑。當(dāng)樣品流經(jīng)凝膠柱時，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝膠內(nèi)部，很快流出，體積小于孔隙的大分子，則將通過凝膠流出，因此流出較慢。假定蛋白質(zhì)分子近于球形，同時沒有顯著的水合作用，則不同大小分子量的蛋白質(zhì)，進(jìn)入凝膠篩孔的程度不同，其洗脫體積決定于分子大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)在葡聚糖凝膠柱上層析的洗脫體積和分子量的對數(shù)呈直線關(guān)系。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法的靈敏度可達(dá)到ppm級，能有效鑒別水牛角及珍珠母中不能完全水解的高分子物質(zhì)或高分子量，是一種準(zhǔn)確、可靠的高分子檢查方法。利用所建立的方法對6個企業(yè)的18批樣品進(jìn)行了排查，結(jié)果樣品中可測出分子量在5800以上的成分。本發(fā)明簡便易行、耗費(fèi)少、時間短、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性都很好，可以確保臨床用藥的安全有效，對清開靈注射液產(chǎn)品中高分子量物質(zhì)的含量進(jìn)行檢測，對可能帶入的高分子量物質(zhì)進(jìn)行有效地監(jiān)控，從源頭上控制臨床過敏反應(yīng)的發(fā)生，既可以節(jié)約寶貴的臨床急救時間，同時也增加了臨床醫(yī)護(hù)人員與患者的便利性，減輕了患者的用藥痛苦，具有非常重要的意義。本發(fā)明采用TSK G2000 SWxl型凝膠柱對清開靈注射液中的高分子物質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果在進(jìn)樣體積 20 μ 1，檢出限為0. 08 μ g下能檢出大分子物質(zhì)，說明本發(fā)明建立了一套完整的高分子物質(zhì)檢測方法。


附圖1為本發(fā)明對照溶液與樣品混合色譜圖；附圖2為本發(fā)明最低檢出限色譜圖；附圖3為本發(fā)明分子量對數(shù)IgM-出峰時間曲線；附圖4為本發(fā)明珍珠母提取液的光譜圖；附圖5為本發(fā)明水牛角提取液的光譜圖。
具體實施例方式下面結(jié)合說明書附圖，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。優(yōu)選的，一種檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法，該方法包括下列步驟a、對照溶液的制備如圖1所示，取核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺素α、人生長激素釋放抑制因子對照品溶液各1ml，置25ml量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，即得對照品溶液I ；再取對照溶液I 2. 5ml，定容至25ml，即得對照溶液II ；b、供試品溶液的制備取供試品溶液10ml，至20ml的超濾離心管中，本發(fā)明采用Millipore超濾離心管，在10000轉(zhuǎn) /min離心15分鐘，取殘留物加水定容至1ml，即得供試品溶液；C、測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ 1，注入液相色譜儀，以各對照品的分子量(MW)的對數(shù)與其相應(yīng)保留時間(tR)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程IogMW = a+b tR，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計算分子量為10000,5000及1000物質(zhì)的保留時間，以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值；d、測量最低檢出限如圖2所示，取對照溶液II分別依次進(jìn)樣25μ 1、 20μ 1、15μ 1、10μ 1、5μ 1，可發(fā)現(xiàn)在進(jìn)樣10 μ 1核糖核酸酶A的峰高與基線噪音的比例約為3 1，即得最低檢出限為0.04 μ g;e、檢測樣品基質(zhì)干擾的影響分別取對照品溶液II 2ml,3ml,4ml置于5ml量瓶中，用清開靈注射液分別稀釋至刻度，依次進(jìn)樣25 μ 1測試，檢測樣品基質(zhì)對檢測靈敏度的干擾；f、模擬試驗如圖4和圖5所示，模擬水牛角粉、珍珠母粉的提取工藝，分別在水解2、4、6、8小時取樣，檢測水解過程中特異蛋白的存在；g、樣品的測定采用供試品溶液的制備方法對10批樣品進(jìn)行檢測，注射液的生產(chǎn)工藝控制截取保留相對分子量6000以下的有效物質(zhì)。上述步驟中高效液相色譜的條件為色譜柱為凝膠色譜柱TSK G2000 Sffxl柱；流動相為乙腈-0.83%三氟乙酸溶液GO 60)；檢測波長為214士 Inm;流速0.70 0.75ml/ min0所述供試品溶液色譜圖中，選用體積排除色譜先于分子量5800的保留時間的峰作為高分子量物質(zhì)的峰；測定過程中所述三氟乙酸溶液作為分析純，所述乙腈作為色譜純。本發(fā)明實施例的具體操作步驟為1、最低檢出限取對照品溶液II分別依次進(jìn)樣 25μ 1、20μ 1、15μ 1、10μ 1、5μ 1，可發(fā)現(xiàn)在進(jìn)樣10 μ 1核糖核酸酶A的峰高與基線噪音的比例約為3 1，即得最低檢出限為0.08yg。2、樣品基質(zhì)干擾的影響分別取對照品溶液 II 2ml,3ml,4ml置5ml量瓶中，用清開靈注射液分別稀釋至刻度，依次進(jìn)樣25 μ 1，依法測試，結(jié)果此時能檢出的限度為0. 16 μ g。這說明由于樣品基質(zhì)的干擾使檢測靈敏度降低一半。3、分子量對數(shù)與出峰時間曲線由最低檢出限中的各對照出峰時間及其分子量(見表 1)，可繪制分子量對數(shù)-出峰時間曲線，見圖3。以各對照品的分子量(MW)的對數(shù)與其相應(yīng)保留時間(tR)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程IogMW = M. 71-3. 412 tR，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算分子量為10000、5000及1000物質(zhì)的保留時間分別為11. 06minU2. 09min及 14. 49min,以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值。4、準(zhǔn)確度和重復(fù)性試驗取同一批參芪扶正注射液IOmL于20ml的超濾離心管中，共6份，再加入ImL對照品溶液I， 在10000轉(zhuǎn)/min離心15-20分鐘，取殘留物加水定容至1ml，即得供試品溶液。取上述供試品溶液和對照品溶液I各20μ 1，進(jìn)樣測定。根據(jù)供試品溶液與對照品溶液中核糖核酸酶A 與人胰島素的峰面積比值，計算回收率。結(jié)果表明核糖核酸酶A的平均回收率約為90%， RSD (n = 6)為4. 33% ；人胰島素的平均回收率約為72%，RSD (n = 6)為5. 86%，說明該方法對以上兩種成分測定的準(zhǔn)確度和重復(fù)性良好。由于本超濾離心管的截流分子量為10000， 人胰島素分子量為5800，這可能是回收率偏低的原因。由于胸腺素α和人生長激素釋放抑制因子分子量較小且樣品基質(zhì)干擾明顯，故未能計算兩者的回收率。表1為由最低檢出限中的各對照出峰時間及其分子量，可繪制分子量對數(shù)-出峰時間曲線，如圖3所示。表1 各對照品分子量及出峰時間
權(quán)利要求
1.檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法，其特征在于該方法包括下列步驟a、對照溶液的制備取核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺素α、人生長激素釋放抑制因子對照品溶液各1ml，置 25ml量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，即得對照品溶液I ；再取對照溶液I 2. 5ml，定容至 25ml，即得對照溶液II ；b、供試品溶液的制備取供試品溶液10ml，至20ml的超濾離心管中，在10000轉(zhuǎn)/min離心15分鐘，取殘留物加水定容至1ml，即得；C、測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μ 1，注入液相色譜儀，以各對照品的分子量(MW)的對數(shù)與其相應(yīng)保留時間(tR)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程IogMW = a+b tR，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計算分子量為10000，5000及1000物質(zhì)的保留時間，以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值；d、測量最低檢出限取對照溶液II分別依次進(jìn)樣25μ 1、20μ 1、15μ 1、10μ 1、5μ 1，可發(fā)現(xiàn)在進(jìn)樣10μ 1核糖核酸酶A的峰高與基線噪音的比例約為3 1，即得最低檢出限；e、檢測樣品基質(zhì)干擾的影響分別取對照品溶液II 2ml,3ml,4ml置于5ml量瓶中，用清開靈注射液分別稀釋至刻度，依次進(jìn)樣25 μ 1測試，檢測樣品基質(zhì)對檢測靈敏度的干擾；f、模擬試驗?zāi)M水牛角粉、珍珠母粉的提取工藝，分別在水解2、4、6、8小時取樣，檢測水解過程中特異蛋白的存在；g、樣品的測定采用供試品溶液的制備方法對10批樣品進(jìn)行檢測，注射液的生產(chǎn)工藝控制截取保留相對分子量6000以下的有效物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法，其特征在于所述高效液相色譜的條件為色譜柱為凝膠色譜柱TSK G2000SWxl柱；流動相為乙腈-0.83%三氟乙酸溶液GO 60)；檢測波長為214士 Inm;流速0. 70 0. 75ml/min。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法，其特征在于所述供試品溶液色譜圖中，選用體積排除色譜先于分子量5800的保留時間的峰作為高分子量物質(zhì)的峰。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項中所述的檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法，其特征在于測定過程中所述三氟乙酸溶液作為分析純，所述乙腈作為色譜純。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測清開靈注射液中高分子量物質(zhì)的凝膠色譜測定方法，該方法包括下列步驟a、對照溶液的制備；b、供試品溶液的制備；c、測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，以各對照品的分子量的對數(shù)與其相應(yīng)保留時間制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別計算分子量為10000，5000及1000物質(zhì)的保留時間，以此為限即可計算供試品在各段的累計峰面積值；d、測量最低檢出限；e、檢測樣品基質(zhì)干擾的影響；f、模擬試驗；g、樣品的測定。本發(fā)明的方法對清開靈注射液產(chǎn)品中的高分子量物質(zhì)進(jìn)行檢測，對可能帶入的高分子量物質(zhì)進(jìn)行有效地監(jiān)控，具有非常重要的意義。
文檔編號G01N30/02GK102175779SQ20101059515
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者劉瀟瀟, 李泳雪, 楊立偉, 肖樹雄, 胡珂 申請人:廣東省藥品檢驗所