固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測(cè)定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法
【專(zhuān)利摘要】一種固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測(cè)定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法，先利用純的花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)優(yōu)化不同極性配比的洗脫液洗脫條件，在同一根SPE小柱上實(shí)現(xiàn)混合物中TAG、DAG、MAG、FFA的有效分離，其特征在于它包括如下步驟：1)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離和脂肪酸組成分析；2)結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的分析。該方法具有操作簡(jiǎn)便、樣品需求量低、需要溶劑消耗量少、定性定量分析結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)限低、分析時(shí)間快的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸組成和結(jié)構(gòu)脂產(chǎn)品中TAG、DAG、MAG、FFA組成與含量的高通量檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測(cè)定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及 甘油酯組成的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)結(jié)構(gòu)脂的方法，具體涉及一種固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測(cè)定 結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 脂質(zhì)是人類(lèi)膳食的主要組成部分，在人體三大能量營(yíng)養(yǎng)素中占有重要的地位。隨 著人們生活水平的不斷提高，人類(lèi)對(duì)膳食中脂質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)提出了新的要求。吃好油、吃營(yíng)養(yǎng)健 康油，已成為我國(guó)消費(fèi)者關(guān)注自身健康、保證正常營(yíng)養(yǎng)攝取的新需求。
[0003] 研究表明，油脂中TAGS的含量高達(dá)95%以上。TAGS中脂肪酸的組成、碳鏈長(zhǎng)短、 雙鍵數(shù)目及位置是影響油脂物理化學(xué)性質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要因素，尤其是甘油骨架上脂肪 酸的位置分布對(duì)甘油酯在人體內(nèi)的吸收代謝及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要影響。甘油酯中脂肪酸 的位置可以分為兩大類(lèi)，S卩a (Sn-1，3)位和β (Sn-2)位。在人體的胃腸道內(nèi)，胰脂肪酶是 消化脂質(zhì)的最主要酶，具有較高的α位專(zhuān)一性。?；讦廖簧希舅嵋杂坞x的形式被吸 收，而?；讦挛粫r(shí)，則是以單甘酯的形式被吸收，且β位單甘酯更易被人體吸收利用。甘 油酯的這種"脂肪酸?；恢眯?yīng)"對(duì)于指導(dǎo)功能油脂產(chǎn)品的研發(fā)有著非常重要的意義。
[0004] 結(jié)構(gòu)脂質(zhì)（StructuredLipid，SLs)，通過(guò)改變?nèi)８视凸羌苌现舅峤M成及位置 分布，將具有特殊營(yíng)養(yǎng)或生理功能的脂肪酸結(jié)合到特定位置，從而充分發(fā)揮各種脂肪酸的 物理和營(yíng)養(yǎng)功能性質(zhì)。結(jié)構(gòu)脂作為一類(lèi)新型功能性油脂，其開(kāi)發(fā)與應(yīng)用程度越來(lái)越廣。在 合成SLs的過(guò)程中，常伴隨著TAG、DAG、MAG、FFA的產(chǎn)生。產(chǎn)物中TAG、DAG、MAG、FFA的分離 是優(yōu)化反應(yīng)條件、鑒定反應(yīng)產(chǎn)物的前提。此外，建立一種高通量的快速有效測(cè)定SLs中α、 β位置脂肪酸組成的方法，在SLs研究工作中有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0005] -直以來(lái)，分離TAG、DAG、MAG、FFA的方法主要是TLC法和正相高效液相色譜法 (NP-HPLC)。TLC法的制板、平衡、分離、提取等操作比較復(fù)雜，被測(cè)樣品經(jīng)過(guò)點(diǎn)樣后暴露在 空氣中，增加了脂肪酸的氧化幾率，尤其是對(duì)于一些長(zhǎng)碳鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFAs)影 響較大。另外，由于TLC法難于定量，且存在用時(shí)長(zhǎng)、受操作者操作水平的影響較大等缺點(diǎn)， 因此，只能作為定性分析的一種輔助手段，從而限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用。而NP-HPLC儀器昂 貴，且需要先記錄相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，在進(jìn)行樣品分析時(shí)，需要按照各個(gè)組分的保留時(shí) 間分別收集各個(gè)組分，經(jīng)GC進(jìn)行脂肪酸檢測(cè)，因此存在有機(jī)溶劑消耗大、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)。相對(duì) 于傳統(tǒng)的TLC法和HPLC法，固相萃取技術(shù)具有有機(jī)溶劑消耗少、富集倍數(shù)高，能有效對(duì)SLs 合成產(chǎn)物中TAG、DAG、MAG、FFA快速有效分離等特點(diǎn)，結(jié)合GC法，能實(shí)現(xiàn)測(cè)定結(jié)構(gòu)脂α、β 位置脂肪酸及甘油酯的組成分析。本發(fā)明對(duì)固相萃取小柱分離TAG、DAG、MAG及FFA的洗脫 條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了采用商品化的固相萃取小柱完成了 SLs合成過(guò)程中產(chǎn)生的TAG、DAG、 MAG、FFA的快速有效分離，結(jié)合GC法，實(shí)現(xiàn)了 SLs中α、β位置脂肪酸及甘油酯的組成分 析，該方法操作簡(jiǎn)便，快速有效，便于批量處理樣品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測(cè)定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂 肪酸及甘油酯組成的方法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、樣品需求量低、需要溶劑消耗量少、定性 定量分析結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)限低、分析時(shí)間快的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測(cè) 定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法，先利用純的花生四烯酸-甘油三酯 (ARA-TAG)、二十二碳六烯酸-甘油二酯（DHA-DAG)、亞麻酸-甘油一酯（Ln-MAG)、油酸-游 離脂肪酸（0-FFA)標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)優(yōu)化不同極性配比的洗脫液洗脫條件，在同一根SPE小柱上 實(shí)現(xiàn)混合物中TAG、DAG、MAG、FFA的有效分離，其特征在于它包括如下步驟：
[0008] 1)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離和脂肪酸組成分析
[0009] (1)樣品制備：分別稱(chēng)取花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻 酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，按花生四烯酸-甘油三酯：二十二碳六烯酸-甘油 二酯：亞麻酸-甘油一酯：油酸-游離脂肪酸的質(zhì)量比為5-50mg:5-50mg:5-50mg:5-50mg， 混合，用正己燒溶解，質(zhì)量濃度控制在5mg/mL?50mg/mL之間，得到樣品，并置于-20°C冰箱 保存；
[0010] (2)柱子活化：將固相萃取小柱置于固相萃取裝置上，用5-10倍固相萃取小柱內(nèi) 的填料體積的正己烷對(duì)柱子進(jìn)行平衡活化（為常規(guī)方法；正己烷為填料體積的5-10倍）； 固相萃取小柱內(nèi)填料為弗羅里硅土；
[0011] (3)上樣：將步驟（1)中配制的樣品轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱中，樣品上樣體積為固相 萃取小柱內(nèi)的填料體積的1-2倍，控制流速<5mL/min ;
[0012] (4)洗脫：用不同極性配比的洗脫液正己烷：無(wú)水乙醚=85 :15、70 :30、25 :75(v/ v)(即三種正己烷與無(wú)水乙醚的配比，前三組洗脫液為三組不同配比的正己烷和無(wú)水乙醚 的混合物），無(wú)水乙醚：冰醋酸=95 :5(v/v)(第四組洗脫液為無(wú)水乙醚和冰醋酸的混合 物）分別淋洗柱子，分別收集洗脫液，氮吹儀下吹干洗脫液，得洗脫物；
[0013] (5) TLC檢測(cè)：向步驟（4)收集的洗脫物中加入正己烷，質(zhì)量濃度控制在5mg/mL? 50mg/mL之間，渦旋混勻，得洗脫樣品；取洗脫樣品點(diǎn)樣于硅膠板（10cmX2〇 Cm)，置于層析 缸中進(jìn)行薄層層析（按常規(guī)方法進(jìn)行層析），所用展層劑為正己烷：無(wú)水乙醚：冰醋酸= 50 :50 :1 (v/v/v)(展層劑為正己烷、無(wú)水乙醚和冰醋酸的混合物），自然晾干后，置于碘蒸 汽中顯色至斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)，觀察花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻 酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸是否實(shí)現(xiàn)分離，并確定各洗脫物的類(lèi)型；
[0014] (6)GC檢測(cè)：將步驟（4)收集的洗脫物進(jìn)行甲酯化衍生化處理（按常規(guī)方法進(jìn) 行），根據(jù)步驟（5)的結(jié)果判斷洗脫物的種類(lèi)，對(duì)于脂肪酸的甲酯化反應(yīng)采用濃H 2S04/甲 醇加熱法進(jìn)行，對(duì)于甘油酯的甲酯化反應(yīng)采用Κ0Η/甲醇法進(jìn)行（按常規(guī)方法進(jìn)行）；取步 驟（5)洗脫樣品50yL，溶于2mL石油醚，振蕩l-2s，加入lmL5% (v/v)的濃H2S04/甲醇 溶液（濃H2S04濃度為98% )或者lmLO. 4mol/L(摩爾濃度）Κ0Η/甲醇溶液，渦旋5min， 然后加入2mL0. 9% (w/v)的氯化鈉水溶液，輕微振蕩5-10秒，5000rpm離心5min，最后取 上清液進(jìn)行GC分析；GC分析儀器為：Agilent7890A型氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器；色譜柱 ： HP-FFAP(30mX0. 25mmX0. 5 μ m);進(jìn)樣量1 μ L ;分流比30 :1 ;程序升溫：初溫2KTC，保持 8min，20°C /min升溫至240°C，并保持7min，得GC色譜圖，數(shù)據(jù)分析，計(jì)算各脂肪酸的百分 含量；
[0015] (7)根據(jù)步驟￠)中脂肪酸組成（各脂肪酸的百分含量），結(jié)合步驟（5)中各洗脫 物的類(lèi)型，得到甘油三脂、甘油二酯、甘油一酯和游離脂肪酸的脂肪酸組成；
[0016] 2)結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的分析
[0017] (1)對(duì)于結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸組成的分析，稱(chēng)取300mg結(jié)構(gòu)脂于30mL玻璃試 管中，加20mg豬胰脂酶，2mLTris-HCl緩沖液（pH = 8, 2mol/L)，搖勻后，加0. 5mL膽酸鈉溶 液（lg/L)，0. 2mLCaCl2溶液（220g/L)，渦旋混勻后，于40°C水浴鍋中震蕩反應(yīng)5min后，加入 lmL無(wú)水乙醚，lmLHCl溶液（6mol/L)，震蕩均勻后，5000r/min離心2min，取上層，氮吹吹干 得樣品；
[0018] (2)將步驟（1)中的樣品按步驟1)中（2)-(6)進(jìn)行，根據(jù)豬胰脂酶對(duì)α位置脂肪 酸水解的專(zhuān)一性，得到甘油一酯和游離脂肪酸的組成，確定結(jié)構(gòu)脂α、β位置的脂肪酸組 成；
[0019] (3)對(duì)于結(jié)構(gòu)脂甘油酯組成的分析，其樣品按步驟1)中（2)-(7)進(jìn)行，確定甘油酯 的組成。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是：
[0021] 1)采用商品化的弗羅里硅土固相萃取小柱完成了 SLs產(chǎn)品中TAG、DAG、MAG、FFA 的快速有效分離，結(jié)合氣相色譜法實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸組成分析；
[0022] 2)本發(fā)明僅需要通過(guò)樣品制備、活化、上樣、洗脫等簡(jiǎn)單步驟，就能完成SLs產(chǎn)品 中TAG、DAG、MAG、FFA在同一根SPE小柱中實(shí)現(xiàn)分離；
[0023] 3)本發(fā)明采用的固相萃取技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)的TLC法，更加快速準(zhǔn)確；相對(duì)于HPLC 法，有機(jī)溶劑消耗少，無(wú)需昂貴的儀器處理，更加經(jīng)濟(jì)適用。
[0024] 4)可實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸組成和結(jié)構(gòu)脂產(chǎn)品中TAG、DAG、MAG、FFA組成 與含量的高通量檢測(cè)，適合各種結(jié)構(gòu)脂產(chǎn)品的分析。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1經(jīng)弗羅里硅土固相萃取小柱分離收集后的標(biāo)準(zhǔn)品混合物的TLC分析圖；
[0026] 圖 1 中：
[0027] 1-4為正己烷：無(wú)水乙醚=85 :15(v/v)的洗脫液淋洗的樣品收集液；
[0028] 5-8為正己烷：無(wú)水乙醚=70 :30(v/v)的洗脫液淋洗的樣品收集液；
[0029] 9-12為正己烷：無(wú)水乙醚=25 :75(v/v)的洗脫液淋洗的樣品收集液；
[0030] 13-16為無(wú)水乙醚：冰醋酸=95 :5(v/v)的洗脫液淋洗的樣品收集液。
[0031] 圖2用正己烷：無(wú)水乙醚=85 :15(v/v)洗脫液洗脫，經(jīng)弗羅里硅土固相萃取小柱 分離后收集的樣品的脂肪酸甲酯色譜圖。
[0032] 圖3用正己烷：無(wú)水乙醚=70 :30 (v/v)洗脫液洗脫，經(jīng)弗羅里硅土固相萃取小柱 分離后收集的樣品的脂肪酸甲酯色譜圖。
[0033] 圖4用正己烷：無(wú)水乙醚=25 :75 (v/v)洗脫液洗脫，經(jīng)弗羅里硅土固相萃取小柱 分離后收集的樣品的脂肪酸甲酯色譜圖。
[0034] 圖5用無(wú)水乙醚：冰醋酸=95 :5 (v/v)洗脫液洗脫，經(jīng)弗羅里硅土固相萃取小柱 分離后收集的樣品的脂肪酸甲酯色譜圖。
[0035] 圖6實(shí)施例1中豬油水解后用正己烷：無(wú)水乙醚=25 :75 (v/v)洗脫液洗脫，經(jīng)弗 羅里硅土固相萃取小柱分離后收集的樣品的脂肪酸甲酯色譜圖。
[0036] 圖7實(shí)施例2中經(jīng)弗羅里硅土固相萃取小柱分離后收集的合成的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)TLC分 析圖；
[0037] 圖 7 中：
[0038] 1-4為正己烷：無(wú)水乙醚=85 :15 (v/v)的洗脫液淋洗的樣品收集液；
[0039] 5-12為正己烷：無(wú)水乙醚=70 :30 (v/v)的洗脫液淋洗的樣品收集液；
[0040] 13-16為正己烷：無(wú)水乙醚=25 :75 (v/v)的洗脫液淋洗的樣品收集液；
[0041] 17-19為無(wú)水乙醚：冰醋酸=95 :5 (v/v)的洗脫液淋洗的樣品收集液。
[0042] 圖8實(shí)施例3中高芥酸菜籽油脂肪酸甲酯色譜圖。
[0043] 圖9實(shí)施例3中高芥酸菜籽油水解后用正己烷：無(wú)水乙醚=25 :75 (v/v)洗脫液洗 脫，經(jīng)弗羅里硅土固相萃取小柱分離后收集的樣品的脂肪酸甲酯色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0044] 為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
[0045] 一種固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測(cè)定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方 法，先利用純的花生四烯酸-甘油三酯（ARA-TAG)、二十二碳六烯酸-甘油二酯（DHA-DAG)、 亞麻酸-甘油一酯（Ln-MAG)、油酸-游離脂肪酸（0-FFA)標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)優(yōu)化不同極性配比的 洗脫液洗脫條件，在同一根SPE小柱上實(shí)現(xiàn)混合物中TAG、DAG、MAG、FFA的有效分離，它包 括如下步驟：
[0046] 1)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離和脂肪酸組成分析
[0047] (1)樣品制備：分別稱(chēng)取花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻 酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，按花生四烯酸-甘油三酯：二十二碳六烯酸-甘油 二酯：亞麻酸-甘油一酯：油酸-游離脂肪酸的質(zhì)量比為5-50mg:5-50mg:5-50mg:5-50mg， 混合，用正己燒溶解，質(zhì)量濃度控制在5mg/mL?50mg/mL之間，得到樣品，并置于-20°C冰箱 保存；
[0048] (2)柱子活化：將固相萃取小柱置于固相萃取裝置上，用5-10倍固相萃取小柱內(nèi) 的填料體積的正己烷對(duì)柱子進(jìn)行平衡活化（常規(guī)方法；正己烷為填料體積的5-10倍）；固 相萃取小柱內(nèi)填料為弗羅里硅土；
[0049] (3)上樣：將步驟（1)中配制的樣品轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱中，樣品上樣體積為固相 萃取小柱內(nèi)的填料體積的1-2倍，控制流速<5mL/min ;
[0050] (4)洗脫：用不同極性配比的洗脫液正己烷：無(wú)水乙醚=85 :15、70 :30、25 :75(v/ v)(即三種正己烷與無(wú)水乙醚的配比，前三組洗脫液為三組不同配比的正己烷和無(wú)水乙醚 的混合物），無(wú)水乙醚：冰醋酸=95 :5(v/v)(第四組洗脫液為無(wú)水乙醚和冰醋酸的混合 物）分別淋洗柱子，分別收集洗脫液，氮吹儀下吹干洗脫液，得洗脫物；
[0051] (5) TLC檢測(cè)：向步驟（4)收集的洗脫物中加入正己烷，質(zhì)量濃度控制在5mg/mL? 50mg/mL之間，渦旋混勻，得洗脫樣品；取洗脫樣品點(diǎn)樣于硅膠板（10cmX2〇 Cm)，置于層析 缸中進(jìn)行薄層層析（按常規(guī)方法進(jìn)行層析），所用展層劑為正己烷：無(wú)水乙醚：冰醋酸= 50 :50 :1 (v/v/v)(展層劑為正己烷、無(wú)水乙醚和冰醋酸的混合物），自然晾干后，置于碘蒸 汽中顯色至斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)，觀察花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻 酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸是否實(shí)現(xiàn)分離，并確定各洗脫物的類(lèi)型（見(jiàn)圖1)。
[0052] (6)GC檢測(cè)：將步驟（4)收集的洗脫物進(jìn)行甲酯化衍生化處理（按常規(guī)方法進(jìn) 行），根據(jù)步驟（5)的結(jié)果判斷洗脫物的種類(lèi)，對(duì)于脂肪酸的甲酯化反應(yīng)采用濃H 2S04/甲 醇加熱法進(jìn)行，對(duì)于甘油酯的甲酯化反應(yīng)采用Κ0Η/甲醇法進(jìn)行（按常規(guī)方法進(jìn)行）；取步 驟（5)洗脫樣品50yL，溶于2mL石油醚，振蕩l-2s，加入lmL5% (v/v)的濃H2S04/甲醇 溶液（濃H2S04濃度為98% )或者lmLO. 4mol/L(摩爾濃度）Κ0Η/甲醇溶液，渦旋5min， 然后加入2mL0. 9% (w/v)的氯化鈉水溶液，輕微振蕩5-10秒，5000rpm離心5min，最后取 上清液進(jìn)行GC分析；GC分析儀器為：Agilent7890A型氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器；色譜柱 ： HP-FFAP(30mX0. 25mmX0. 5μπι);進(jìn)樣量1μ L ;分流比30 :1 ;程序升溫：初溫2KTC，保持 8min，20°C /min升溫至240°C，并保持7min，得GC色譜圖（見(jiàn)圖2-5)，數(shù)據(jù)分析，計(jì)算各脂 肪酸的百分含量；
[0053] (7)根據(jù)步驟（6)中脂肪酸組成，結(jié)合步驟（5)中各洗脫物的類(lèi)型，得到甘油三脂、 甘油二酯、甘油一酯和游離脂肪酸的脂肪酸組成；
[0054] 2)結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的分析：見(jiàn)實(shí)施例1-3。
[0055] 實(shí)施例1 :一種快速檢測(cè)豬油中α、β位脂肪酸的方法，它包括如下步驟：
[0056] 1)樣品制備：稱(chēng)取300mg豬油于30mL玻璃試管中，加 20mg豬胰脂酶，2mLTris-HCl 緩沖液（pH = 8,2mol/L)，搖勻后，加 0.5mL 膽酸鈉溶液（lg/L)，0.2mLCaCl2 溶液（220g/L)， 渦旋混勻后，于40°C水浴鍋中震蕩反應(yīng)5min后，加入lmL無(wú)水乙醚，lmLHCl溶液（6mol/L)， 震蕩均勻后，5000r/min離心2min，取上層，氮吹吹干得樣品；
[0057] 2)柱子活化：取固相萃取小柱（柱內(nèi)填料為2g弗羅里硅土），置于固相萃取裝置 上，加20mL正己烷對(duì)柱子進(jìn)行平衡活化；
[0058] 3)上樣：將步驟1)中所得樣品，加8mL正己燒溶解，潤(rùn)旋混勻。取2mL樣品溶液 轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱中，控制流速<5mL/min ;
[0059] 4)洗脫：分別用12mL正己烷：無(wú)水乙醚=85 :15、70 :30、25 :75(v/v)的洗脫液和 12mL無(wú)水乙醚：冰醋酸=95 :5 (v/v)淋洗柱子，分別收集淋洗液，每3mL -管，各洗脫液分 別收集4管，氮吹儀下吹干，得洗脫物；
[0060] 5)TLC檢測(cè)：向步驟4)收集的洗脫物中加入正己烷，質(zhì)量濃度控制在5mg/mL? 50mg/mL之間，渦旋混勻，得洗脫樣品；取洗脫樣品點(diǎn)樣于硅膠板（10cmX2〇 Cm)，置于層析 缸中進(jìn)行薄層層析，所用展層劑為正己烷：無(wú)水乙醚：冰醋酸=50 :50 :1 (v/v/v)，自然晾干 后，置于碘蒸汽中顯色至斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)，觀察甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和游離脂肪酸 是否實(shí)現(xiàn)分離，并確定各洗脫物的類(lèi)型，相同類(lèi)型的洗脫物合并；
[0061] 6)GC檢測(cè)：將步驟4)收集的洗脫物進(jìn)行甲酯化衍生化處理，根據(jù)步驟5)的結(jié)果 判斷洗脫物的種類(lèi)，對(duì)于脂肪酸的甲酯化反應(yīng)采用濃H 2so4/甲醇加熱法進(jìn)行，對(duì)于甘油酯 的甲酯化反應(yīng)采用Κ0Η/甲醇法進(jìn)行；取步驟4)洗脫樣品50 μ L，溶于2mL石油醚，振蕩 l-2s，加入lmL5% (v/v)的濃H2S04/甲醇溶液（濃H2S04濃度為98% )或者lmL0.4mol/ L (摩爾濃度）Κ0Η/甲醇溶液，渦旋5min，然后加入2mL0. 9 % (w/v)的氯化鈉水溶液，輕微振 蕩5-10秒，5000rpm離心5min，最后取上清液進(jìn)行GC分析；GC分析儀器為：Agilent7890A 型氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器；色譜柱：HP-FFAP(30mX0. 25mmX0. 5 μ m);進(jìn)樣量1 μ L ;分流 比30 :1 ;程序升溫：初溫2KTC，保持8min，20°C /min升溫至240°C，并保持7min，得GC色 譜圖（見(jiàn)圖6)，數(shù)據(jù)分析，計(jì)算各脂肪酸的百分含量；
[0062] 7)根據(jù)步驟6)中脂肪酸組成，結(jié)合步驟5)中各洗脫物的類(lèi)型，得到甘油一酯和游 離脂肪酸的脂肪酸組成，即豬油中α、β位脂肪酸的組成。
[0063] 實(shí)施例2 : -種利用固相萃取小柱快速分離酶法合成的1，3-花生四烯酸-甘油二 酯（1，3-ARA-DAG)結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中甘油酯組成的方法，它包括如下步驟：
[0064] 1)樣品制備：稱(chēng)取l.OOg花生四烯酸（ARA)和0. 15g甘油，加入0. 12g固定化脂 肪酶LipozymRMM(占底物質(zhì)量的10% )，50°C恒溫水浴磁力攪拌下反應(yīng)3h，得SLs反應(yīng)混 合物；
[0065] 2)柱子活化：取固相萃取小柱（柱內(nèi)填料為2g弗羅里硅土），置于固相萃取裝置 上，加10mL正己烷對(duì)柱子進(jìn)行平衡活化；
[0066] 3)上樣：稱(chēng)取50mg步驟1)所合成的SLs反應(yīng)產(chǎn)物于試管中，加入5mL正己烷，渦 旋混勻。將混勻后的樣品轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱中，控制流速<5mL/min ;
[0067] 4)洗脫：分別用12mL正己烷：無(wú)水乙醚=85 :15、70 :30、25 :75(v/v)和12mL無(wú) 水乙醚：冰醋酸=95 :5(v/v)洗脫液淋洗柱子，分別收集淋洗液，每3mL收集一管，每種洗 脫液收集4管，氮吹儀下吹干，得洗脫物；
[0068] 5)TLC檢測(cè)：向步驟4)收集的洗脫物中加入10mL正己烷，渦旋混勻。點(diǎn)樣于硅膠 板（10 CmX20cm)，置于層析缸中進(jìn)行薄層層析，所用展層劑為正己烷：無(wú)水乙醚：冰醋酸= 50 :50 :l(v/v/v)，自然晾干后，置于碘蒸汽中顯色至斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)；根據(jù)甘油三酯、甘油二 酯、甘油一酯和游離脂肪酸的顯色點(diǎn)確定洗脫物的類(lèi)型，相同類(lèi)型的洗脫物合并，得SLs反 應(yīng)物的不同組分（見(jiàn)圖7)。
[0069] 實(shí)施例3 : -種快速檢測(cè)高芥酸菜籽油中α、β位脂肪酸的方法，它包括如下步 驟：
[0070] 1)樣品制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取50mg菜籽油于30mL玻璃試管中，加20mg豬胰脂酶， 2mLTris-HCl 緩沖液（pH = 8,2mol/L)，搖勻后，加 0· 5mL 膽酸鈉溶液（lg/L)，0. 2mLCaC12 溶液（220g/L)，渦旋混勻后，于40°C水浴鍋中震蕩反應(yīng)5min后，加入lmL無(wú)水乙醚，lmLHCl 溶液（6mol/L)，震蕩均勻后，5000r/min離心2min，取上層，氮吹吹干得樣品；
[0071] 2)柱子活化：取固相萃取小柱（柱內(nèi)填料為2g弗羅里硅土），置于固相萃取裝置 上，加20mL正己烷對(duì)柱子進(jìn)行平衡活化；
[0072] 3)上樣：將步驟1)中所得樣品，加4mL正己烷溶解，渦旋混勻。取2mL樣品溶液 轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱中，控制流速<5mL/min ;
[0073] 4)洗脫：分別用12mL正己烷：無(wú)水乙醚=85 :15、70 :30、25 :75(v/v)和12mL無(wú) 水乙醚：冰醋酸=95 :5 (v/v)洗脫液淋洗柱子，分別收集淋洗液，每3mL -管，每種洗脫液 收集4管，并將淋洗液在氮吹儀下吹干，得洗脫物；
[0074] 5)GC檢測(cè)：向步驟4)收集的洗脫物中加入lmL正己烷，渦旋混勻，得洗脫樣品； 并分別對(duì)原菜籽油樣品和洗脫樣品進(jìn)行甲酯化衍生化處理，甲酯化反應(yīng)采用Κ0Η/甲醇法 進(jìn)行；向洗脫樣品中加入lmLO. 4mol/L(摩爾濃度）Κ0Η/甲醇溶液，渦旋lOmin，然后加入 2mL0. 9% (w/v)的氯化鈉水溶液和lmL正己燒，輕微振蕩5-10秒，5000rpm離心5min，最后 取上清液進(jìn)行GC分析；GC分析儀器為：Agilent7890A型氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器；色譜柱： HP-FFAP(30mX0. 25mmX0. 5μπι);進(jìn)樣量1 μ L ;分流比30 :1 ;程序升溫：初溫2KTC，保持 6min，20°C /min升溫至240°C，并保持4min，得GC色譜圖（圖8、9)，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，計(jì)算各脂 肪酸的百分含量；
[0075] 7)結(jié)合步驟6)的脂肪酸組成，確定高芥酸菜籽油中α、β位脂肪酸的組成，根據(jù) 豬胰脂酶對(duì)α位置脂肪酸水解的專(zhuān)一性，得到高芥酸菜籽油中芥酸和花生一烯酸主要分 布在甘油酯的α位。
【權(quán)利要求】
1. 一種固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測(cè)定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的方法， 其特征在于它包括如下步驟 ： 1) 混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離和脂肪酸組成分析 (1) 樣品制備：分別稱(chēng)取花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻 酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，按花生四烯酸-甘油三酯：二十二碳六烯酸-甘油 二酯：亞麻酸-甘油一酯：油酸-游離脂肪酸的質(zhì)量比為5-50mg:5-50mg:5-50mg:5-50mg， 混合，用正己燒溶解，質(zhì)量濃度控制在5mg/mL?50mg/mL之間，得到樣品，并置于-20°C冰箱 保存； (2) 柱子活化：將固相萃取小柱置于固相萃取裝置上，用5-10倍固相萃取小柱內(nèi)的填 料體積的正己烷對(duì)柱子進(jìn)行平衡活化；固相萃取小柱內(nèi)填料為弗羅里硅土； (3) 上樣：將步驟（1)中配制的樣品轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱中，樣品上樣體積為固相萃取 小柱內(nèi)的填料體積的1-2倍，控制流速<5mL/min ; (4) 洗脫：用不同極性配比的洗脫液正己烷：無(wú)水乙醚=85 :15、70 :30、25 :75(v/v)， 無(wú)水乙醚：冰醋酸=95 :5(v/v)分別淋洗柱子，分別收集洗脫液，氮吹儀下吹干洗脫液，得 洗脫物； (5) TLC檢測(cè)：向步驟（4)收集的洗脫物中加入正己烷，質(zhì)量濃度控制在5mg/mL? 50mg/mL之間，渦旋混勻，得洗脫樣品；取洗脫樣品點(diǎn)樣于硅膠板，置于層析缸中進(jìn)行薄層 層析，所用展層劑為正己烷：無(wú)水乙醚：冰醋酸=50 :50 :l(v/v/v)，自然晾干后，置于碘蒸 汽中顯色至斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)，觀察花生四烯酸-甘油三酯、二十二碳六烯酸-甘油二酯、亞麻 酸-甘油一酯、油酸-游離脂肪酸是否實(shí)現(xiàn)分離，并確定各洗脫物的類(lèi)型； (6) GC檢測(cè)：將步驟（4)收集的洗脫物進(jìn)行甲酯化衍生化處理，根據(jù)步驟（5)的結(jié)果判 斷洗脫物的種類(lèi)，對(duì)于脂肪酸的甲酯化反應(yīng)采用濃H 2S04/甲醇加熱法進(jìn)行，對(duì)于甘油酯的 甲酯化反應(yīng)采用KOH/甲醇法進(jìn)行；取步驟（5)洗脫樣品50 μ L，溶于2mL石油醚，振蕩l-2s， 加入lmL5% (v/v)的濃H2S04/甲醇溶液或者lmLO. 4mol/LK0H/甲醇溶液，渦旋5min，然后 加入2mL0. 9% (w/v)的氯化鈉水溶液，輕微振蕩5-10秒，5000rpm離心5min，最后取上清液 進(jìn)行GC分析；得GC色譜圖，數(shù)據(jù)分析，計(jì)算各脂肪酸的百分含量； (7) 根據(jù)步驟（6)中脂肪酸組成，結(jié)合步驟（5)中各洗脫物的類(lèi)型，得到甘油三脂、甘油 二酯、甘油一酯和游離脂肪酸的脂肪酸組成； 2) 結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸及甘油酯組成的分析 (1) 對(duì)于結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪酸組成的分析，稱(chēng)取300mg結(jié)構(gòu)脂于30mL玻璃試管中， 加20mg豬胰脂酶，2mLTris-HCl緩沖液，搖勻后，加0. 5mL膽酸鈉溶液，0. 2mLCaCl2溶液，渦 旋混勻后，于40°C水浴鍋中震蕩反應(yīng)5min后，加入lmL無(wú)水乙醚，lmLHCl溶液，震蕩均勻 后，5000r/min離心2min，取上層，氮吹吹干得樣品； (2) 將步驟（1)中的樣品按步驟1)中（2)-(6)進(jìn)行，根據(jù)豬胰脂酶對(duì)α位置脂肪酸水 解的專(zhuān)一性，得到甘油一酯和游離脂肪酸的組成，確定結(jié)構(gòu)脂α、β位置的脂肪酸組成； (3) 對(duì)于結(jié)構(gòu)脂甘油酯組成的分析，其樣品按步驟1)中（2)-(7)進(jìn)行，確定甘油酯的組 成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相萃取和氣相色譜聯(lián)用測(cè)定結(jié)構(gòu)脂α、β位置脂肪 酸及甘油酯組成的方法，其特征在于：取上清液進(jìn)行GC分析，GC分析儀器為：Agilent7890A 型氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器；色譜柱：HP-FFAP(30mX0. 25mmX0. 5 μ m);進(jìn)樣量1 μ L ;分流 比30 :1 ;程序升溫：初溫2KTC，保持8min，20°C /min升溫至240°C，并保持7min。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK104049057SQ201410235634
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】董緒燕, 劉四磊, 吳 琳, 陳洪, 魏芳, 呂昕, 鐘娟 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所