使用蛋白a親和色譜法分離和純化抗-il-13抗體的制作方法
【專利說明】使用蛋白A親和色譜法分離和純化抗-IL-13抗體
[0001] 本申請是國際申請日為2010年10月20日、國際申請?zhí)枮镻CT/US2010/053388、進(jìn) 入國家階段的申請?zhí)枮?01080057917. 5、發(fā)明名稱為"使用蛋白A親和色譜法分離和純化 抗-IL-13抗體"的PCT申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求2009年10月20日提交的美國臨時(shí)申請系列號61/253, 411的權(quán)益，該申 請通過引用整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 人IL-13是從活化的T細(xì)胞克隆出的一種17-kDa糖蛋白，并由Th2譜系的活化 T細(xì)胞、ThO和ThI⑶4+ T細(xì)胞、⑶8+ T細(xì)胞和幾種非-T細(xì)胞群體(諸如肥大細(xì)胞）生成 (Zurawski 和 de Vries, 1994 Tmmunol Today, 15，19-26)。IL-13 會促進(jìn)人 B 細(xì)胞中的 免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換成 IgE (Punnonen, Aversa 等人 1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3730-4)，并抑制人和小鼠中的炎癥性細(xì)胞因子生產(chǎn)（de Waal Malefyt等人，1993，J Immunol, 151，6370- 81; Doherty 等人，1993，JImmunol, 151，7151-60)。IL-13 會 結(jié)合它的細(xì)胞表面受體IL_13Ral和IL-13Ra2。IL_13Ral以低親和力（KD ~ IOnM)與 IL-13相互作用，隨后被IL-4R募集，以形成高親和力（KD ~ 0.4 nM)信號傳遞異源二聚受 體復(fù)合物（Aman 等人，1996，JBiol Chem, 271，29265-70; Hilton 等人，1996，Proc Natl Acad Sci USA, 93，497-501)。所述 IL-4R/IL-13Ral 復(fù)合物在諸如 B 細(xì)胞、單核 細(xì)胞/巨細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、氣道上 皮細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞等許多細(xì)胞類型上表達(dá)（Graber等人，1998，Eur J Immunol, 28，4286-98; Murata 等人，1998，Int Immunol, 10，1103-10; Akaiwa 等人，2001， Cytokine, 13，75-84)。IL-13Ral/IL-4R受體復(fù)合物的連接會導(dǎo)致多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的 活化，包括信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子（ST AT6)和胰島素受體底物-2 (IRS-2)途徑（Wang 等人，1995，Blood, 864218-27; Takeda 等人，1996，J Immunol, 157，3220-2)。單 獨(dú)的IL-13Ra2鏈對IL-13具有高親和力（KD ~ 0. 25-0. 4 nM)，并起下述兩種作用：負(fù)調(diào) 節(jié) IL-13 結(jié)合的誘傅受體（Donaldson 等人，1998，J Immunol, 161，2317-24)，和在巨 噬細(xì)胞和可能的其它細(xì)胞類型中通過AP-I途徑誘導(dǎo)TGF-β合成和纖維化的信號傳遞受體 (Fichtner-Feigl, Strober 等人 2〇〇6 Nat Med I2 99_1〇6)〇
[0004] 在哮喘的臨床前動物模型中進(jìn)行的幾項(xiàng)研宄指示，IL-13在哮喘中起重要作用。 這些數(shù)據(jù)包括：IL-13敲除的小鼠對哮喘的抗性，以及IL-13拮抗劑(可溶性的IL-13受體、 抗-IL-13 mAb等）在不同的小鼠模型中對哮喘表型的抑制（Wills- Karp和Chiaramonte, 2003, Curr Opin Pulm Med, 9 21-7; Wills-Karp, 2004, Tmmunol Rev, 202 175-90)。 多項(xiàng)研宄已經(jīng)證實(shí)，重組IL-13向小鼠以及豚鼠的肺的藥理學(xué)施用會誘導(dǎo)氣道粘液分泌 過多、嗜酸粒細(xì)胞增多和氣道高反應(yīng)性("AHR"； Grunig等人，1998，Science, 282， 2261-3; Wills-Karp 等人，1998，Science, 282，2258-61; Kibe 等人，2003，AmJ Respir Crit Care Med, 167， 50-6; Vargaftig 和 Singer, 2003， Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 284，L260-9; Vargaftig 和 Singer, 2003，Am J Respir Cell Mol Biol, 28，410-9)。在組成性地或誘導(dǎo)性地表達(dá)IL-13的轉(zhuǎn)基因小鼠系統(tǒng)中，再現(xiàn)了 IL-13 的這些效應(yīng)（Zhu 等人，1999，JClin Invest, 103，779-88; Zhu 等人，2001， Am J Respir Crit Care Med, 164，S67- 70; Lanone 等人，2002，J Clin Invest, 110463-74)。IL-13的慢性轉(zhuǎn)基因過表達(dá)也會誘導(dǎo)上皮下纖維化和肺氣腫。具有IL-13 (和IL-4)信號傳遞分子STAT6缺陷的小鼠不會形成變應(yīng)原誘導(dǎo)的AHR和粘液過度生 成（Kuperman等人，2002，NatMed, 8，885-9)。使用可溶性的IL-13受體融合蛋白 (sIL_13Ra 2Fc)的研宄已經(jīng)證實(shí)了該細(xì)胞因子在實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)原卵白蛋白（OVA)誘導(dǎo)的氣 道疾病中的關(guān)鍵作用（Grunig 等人，1998，Science, 282，2261-3; Wills-Karp 等人， 1998，Science, 282，2258-61; Taube 等人，2002，J Immunol, 169，6482-9)。還在鼠 哮喘的慢性模型中，證實(shí)了抗-IL-13治療的效力。除了表現(xiàn)出粘液分泌過多和AHR的特征 以外，該慢性哮喘模型表現(xiàn)出人疾病的幾種標(biāo)志，所述標(biāo)志在更急性模型中不存在。這些標(biāo) 志包括：位于上皮之間的間隙中的肺組織的嗜酸粒細(xì)胞增多以及通過膠原沉積的增加測得 的平滑肌纖維化。通過含有OVA的氣霧劑的重復(fù)激發(fā)(每周1次，持續(xù)共4周），在OVA-敏 化的小鼠中誘導(dǎo)慢性哮喘模型。為最后2周的OVA激發(fā)(從第36天開始，在研宄的第53天 評估效力讀出）施用的抗-IL-13抗體顯著抑制了 AHR、肺炎、杯形細(xì)胞增生、粘液分泌過多 和氣道纖維化（Yang 等人，2005，J Pharmacol Exp Ther, 313，8-15)。IL-13 涉入人哮 喘的發(fā)病機(jī)制中，因?yàn)樵谙颊叩姆沃幸呀?jīng)檢測到高水平的IL-13 mRNA和蛋白，這與該 疾病的嚴(yán)重性相關(guān)聯(lián)（Huang等人，1995，J Immunol, 155，2688-94)。另外，已經(jīng)鑒別 了人IL-3遺傳多態(tài)性(它們導(dǎo)致升高的IL-13水平)，并與哮喘和特應(yīng)性相關(guān)聯(lián)（Heinzmann 等人，2000，Hum Mol Genet, 9，549-59; Hoerauf 等人，2002，Microbes Infect, 4， 37-42; Vercelli, 2002, Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2, 389-93; Heinzmann 等 人，2003，J Allergy Clin Immunol, 112，735-9; Chen 等人，2004，J Allergy Clin Immunol, 114，553-60; Vladich 等人，2005，J Clin Invest, 115，747-54)，并且已 經(jīng)在哮喘患者的肺中檢測到升高的IL-13水平（Huang等人，1995，J Immunol，155， 2688-94; Arima 等人，2002，J Allergy Clin Immunol, 109，980-7; Berry 等人， 2004，J Allergy Clin Immunol, 114，1106-9)。還已經(jīng)證實(shí)了 IL-13 和哮喘之間的遺傳 聯(lián)系，因?yàn)榫哂蠭L-13基因的多態(tài)性(這造成更高的血漿IL-13水平）的個體具有增加的特 應(yīng)性和哮喘的風(fēng)險(xiǎn)（Wills-Karp, 2000，Respir Res, 1，19-23)。
[0005] 由于人IL-13在多種人病癥中的作用，已設(shè)計(jì)治療策略以抑制或抵消IL-13活性。 具體地，已尋求與IL-13結(jié)合且中和IL-13的抗體作為抑制IL-13活性的方法。但是，本領(lǐng) 域需要改良的用于生產(chǎn)和純化這種用于藥用的抗體的方法。本發(fā)明解決了這個需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與IL-13結(jié)合的純化、分離的抗體和抗體片段，以 及包括這樣的抗體和片段的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與人IL-13結(jié)合 的分離的抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明的分離的抗-IL-13抗體可以用于臨床情況以及 研宄和開發(fā)中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括在圖1中鑒定的重鏈和輕鏈序列的 抗-IL-13抗體。
[0007] 本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及從樣品基質(zhì)中純化抗-IL-13抗體或其抗原結(jié)合部 分、以使所述抗體基本上不含有宿主細(xì)胞蛋白（"HCP"）和漏掉的蛋白A的方法。在某些方 面，樣品基質(zhì)（或簡稱"樣品"）包括用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗-IL-13抗體的細(xì)胞系。在具體方 面，樣品包括用于生產(chǎn)人抗-IL-13抗體的細(xì)胞系。
[0008] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純化IL-13抗體的方法，其包括初步回收步驟， 以尤其去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。在上述方法的某些實(shí)施方案中，初步回收步驟包括一個或多 個離心或深度過濾（depth filtration)步驟。例如，并且非限制性地，這樣的離心步驟可 以以約7000 X g至約11，000 X g執(zhí)行。此外，上述方法的某些實(shí)施方案將包括深度過濾 步驟，例如去脂質(zhì)（delipid)深度過濾步驟。
[0009] 在某些實(shí)施方案中，對初步回收的樣品實(shí)施親和色譜步驟。所述親和色譜步 驟包括：將初步回收的樣品上柱，所述柱包括合適的親和色譜載體（chromatographic support)。這樣的色譜載體的非限制性實(shí)例包括，但不限于：蛋白A樹脂、蛋白G樹脂、包括 產(chǎn)生的目標(biāo)抗體所針對的抗原的親和載體以及包括Fc結(jié)合蛋白的親和載體。蛋白A樹脂 可用于抗體（IgG)的親和純化和分離。在一個方面，在樣品加載之前，用合適的緩沖液平衡 蛋白A柱。合適的緩沖液的一個實(shí)例是Tris/NaCl緩沖液（pH約7. 2)。在該平衡以后，可 以將樣品加載到柱上。在加載柱以后，可以使用例如平衡緩沖液，洗滌柱一次或多次。在洗 脫柱之前，可以使用其它洗滌，包括采用不同緩沖液的洗滌。然后可以使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_ 液，洗脫蛋白A柱。合適的洗脫緩沖液的一個實(shí)例是醋酸/NaCl緩沖液（pH約3. 5)。使用 本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，可以監(jiān)測洗脫液。例如，可以跟蹤在OD28tl的吸光度。然 后可以制備洗脫的目標(biāo)級分，用于進(jìn)一步處理。
[0010] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在蛋白A親和色譜法之后進(jìn)行低pH調(diào)節(jié)步驟。在這 樣的實(shí)施方案中，對包含假定的抗-IL-13抗體或其抗原結(jié)合部分的蛋白A洗脫液進(jìn)行pH 調(diào)節(jié)，達(dá)到約3至約4的pH。在某些方面，將pH調(diào)節(jié)至約3.5。除了別的以外，所述低pH 會促進(jìn)可能污染樣品的pH-敏感的病毒的減少和/或滅活。在合適的時(shí)間段以后，將pH調(diào) 節(jié)至約4. 5至約6. 0之間，包括、但不限于約5. 0,并對樣品進(jìn)行其它純化步驟。
[0011] 在某些實(shí)施方案中，在蛋白A親和色譜法或低pH調(diào)節(jié)步驟以后，進(jìn)行離子交換步 驟。該離子交換步驟可以是陽離子或陰離子交換或兩者的序貫組合。該步驟可以是單個離 子交換操作，或可以包括多個離子交換步驟，例如陽離子交換步驟之后為陰離子交換步驟， 或反之亦然。在一個方面，離子交換步驟涉及單步操作。在另一個方面，離子交換步驟涉及 兩步離子交換過程。合適的陽離子交換柱是其固定相包括陰離子基團(tuán)的柱。這樣的柱的一 個實(shí)例是Fractogel ? SO3'該離子交換捕獲色譜步驟會促進(jìn)從樣品中分離抗體。合適的 陰離子交換柱是其固定相包括陽離子基團(tuán)的柱。這樣的柱的一個實(shí)例是Q Sepharose?柱。 一個替代方案是Pall Mustang Q膜筒。一個或多個離子交換步驟通過減少雜質(zhì)進(jìn)一步分 離抗體，所述雜質(zhì)如宿主細(xì)胞蛋白和DNA以及在可適用時(shí)的親和基質(zhì)蛋白。該陰離子交換 操作是色譜的流通（flow through)模式，其中目標(biāo)抗體不與陰離子交換樹脂(或固相)相互 作用或結(jié)合。然而，許多雜質(zhì)的確與陰離子交換樹脂相互作用且結(jié)合。在一個具體方面，所 述離子交換步驟是陰離子交換色譜法。
[0012] 通過調(diào)節(jié)樣品緩沖液的pH和離子強(qiáng)度，為離子交換色譜法制備親和色譜洗脫液。 例如，可以在I M Tris緩沖液中調(diào)節(jié)親和洗脫液至約4. 5至約8. 5的pH。在將樣品（親和 洗脫液)加載上離子交換柱之前，可以使用合適的緩沖液平衡該柱。合適的緩沖液的一個實(shí) 例是Tris/NaCl緩沖液