專利名稱：一種麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物種子油體蛋白質(zhì)分離方法，更特別的涉及一種 麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法。
二背景技術(shù)：
隨著石化能源的日趨枯竭和生態(tài)環(huán)境的日漸惡化，可再生且清潔的 生物能源的研究開發(fā)已成為近年來的熱點課題，以植物油為主要原料的 生物柴油作為一種可再生的替代能源，以其良好的環(huán)境效應(yīng)已引起廣泛 關(guān)注。植物油主要作為營養(yǎng)貯存物質(zhì)積累于種子中，因而篩選和種植優(yōu) 質(zhì)的油料作物作為制備生物柴油的原料，已成為解決能源危機的重要途
徑。麻瘋樹(/a"o/ 力a cwrcas L.)是大戟科麻瘋樹屬多年生亞喬木。 對麻瘋樹種子油脂成分，理化性質(zhì)，十六烷值等研究表明麻瘋樹種子油 是制備生物柴油的理想材料。目前國內(nèi)內(nèi)非常重視利用麻瘋樹種子生產(chǎn) 生物柴油產(chǎn)業(yè)，云南、四川等地已投巨資建成麻瘋樹種植基地。
油分是以油體的形式存在于細胞中。油體外部被一層磷脂和蛋白質(zhì) 鑲嵌而成的半單位膜，脂肪酸以三酰甘油的形式儲存其內(nèi)。油體膜及膜 上附著的蛋白占油體重量的1% -4%,參與油體的結(jié)構(gòu)建成，并在油體 的形成、穩(wěn)定及油脂代謝利用過程中發(fā)揮關(guān)鍵:作用，對油體發(fā)揮其生物 功能十分關(guān)鍵。分離麻瘋樹種子的貯油細胞器-油體及油體蛋白，有利 于了解生物柴油的重要植物儲藏庫，為運用生物技術(shù)手段進一步改良品 種，提高種子的油脂含量打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法。 本發(fā)明的這些以及其它目的將通過在下面的詳細描述來進一步體現(xiàn) 和說明。
本發(fā)明的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，采用蛋白質(zhì)雙向聚丙烯 酰胺凝膠電泳技術(shù)進行分離，包括第一向等電聚焦電泳步驟、膠條平衡
步驟和第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟。
在本發(fā)明的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法中，所述的第一向等電 聚焦電泳步驟為采用IPG預(yù)制膠條(購于Amersham Biosciences ， Uppsala， Sweden),分為兩段拼接，中酸性端pH4-7，長度9-12cm,中堿性端 pH6 - 11，長度9 - 12cm，將預(yù)制膠條浸泡在180 - 250微升含有0. 5 - 1. 0 毫克蛋白質(zhì)樣品中，12小時后取出進行電泳，電泳儀為Multiphor II electrophoresis unit (購于 Amersham Biosciences , Uppsala, Sweden),電泳條件為20℃恒溫，先分別在300V、 600V和1000V電壓 下電泳0. 6 - 1. 5小時，再在8000V電壓下電泳5 - 7小時。
進一步的，在本發(fā)明的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法中，所述的 第一向等電聚焦電泳步驟為采用IPG預(yù)制膠條(購于Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden),分為兩段拼接，中酸性端pH4-7， 長度11cm,中堿性端pH6-ll，長度11cm,將預(yù)制膠條浸泡在200微 升含有0.5-1.0毫克蛋白質(zhì)樣品中，12小時后取出進行電泳，電泳儀 為Multiphor II electrophoresis unit (購于Amersham Biosciences， Uppsala, Sweden)，電泳條件為20'C恒溫，先分別在300V、 600V和1000V 電壓下電泳1. 0小時，再在8000V電壓下電泳6小時。
在本發(fā)明的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法中，所述的膠條平衡步
驟為等電聚焦完成后，取出膠條，在含l. 0%二硫蘇糖醇(DTT) 、 6. 0M 尿素、30 % w/v甘油、2. 5 % w/v十二烷基辟u酸鈉(SDS ) 、 5OmM Tr is-HC1 和余量去離子水，pH8. 6的平衡緩沖液中平衡15分鐘后，再轉(zhuǎn)入2. 5% 碘乙酰胺上述平衡緩沖液中平衡15分鐘。
在本發(fā)明的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法中，所述的第二向SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟為配制聚丙烯酰胺分別為15-20%分離膠和3 -6%濃縮膠的垂直板膠，將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移到垂直板膠的上端，用 1%的瓊脂糖密封，置于電泳槽上，加滿含0. 2-0. 5%Tris-HCl、 1.00 -1. 6%甘氨酸、0. 05 - 0. 1 %SDS的電極緩沖液，在電流為30mA的條 件下電泳2. 5 - 4小時。
進一步的，在本發(fā)明的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，所述的第 二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟為配制聚丙烯酰胺分別為17%分離 膠和4%濃縮膠的垂直板膠，將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移到垂直板膠的上端， 用1%的瓊脂糖密封，置于電泳槽上，加滿含0. 3%Tris-HCl、 1.44% 甘氨酸、0. 1%SDS的電極緩沖液，在電流為30mA的條件下電泳約3小 時。
電泳完成后，取下凝膠，置于染色盒中加入100ml含40。/。乙醇10% 冰乙酸的固定液中，在60次/分鐘的搖床上搖動l小時；換上100ml含0. 116 y?？捡R斯亮藍R- 250、 25%乙醇、8%水乙酸的染色液，在60次/分鐘的 搖床上搖動l小時；倒出染色液，加入100ml含25。/。乙醇、8%冰乙酸的 脫色液，在60次/分鐘的搖床上搖動30分鐘，重復(fù)3次，得到蛋白點鮮明 凝月交電泳圖譜。
考馬斯亮藍染色后的凝膠用麗AX掃描儀在參數(shù)為256階灰度、 600dpi條件下透射掃描，所得圖像用ImageMaster 2D Platinum軟件 (Amersham Bioscience )進4亍分4斤，結(jié)果表明，采用乂又向電〉永的方法 從麻瘋樹種子油體中分離到74個酸性蛋白(圖1)和67個堿性蛋白(圖 2)，共141個蛋白點，等電點分布在5至10之間，酸性和堿性蛋白種 類相當(dāng)，但堿性蛋白表達量更豐富；油體蛋白質(zhì)以低分子量蛋白為主， 蛋白點集中在35KDa以下(圖1、 2)。
本發(fā)明建立了兩段式寬幅IPG蛋白質(zhì)雙向電泳方法，可以大量、快 速、高分辨率、高效地分離蛋白質(zhì)混合樣品。特別是第l向等電聚焦采 用固定pH梯度膠條(IPG)代替?zhèn)鹘y(tǒng)自作管膠，操作簡便、穩(wěn)定性好、重 復(fù)率高。同時，應(yīng)用三維立體數(shù)字化圖像解析軟件，對蛋白質(zhì)膠進行多 項圖像分析和數(shù)據(jù)處理，更加真實可靠，獲得了高敏感、高分辨的雙向 膠圖像，并能準確定量二維表達譜上每個蛋白質(zhì)的分子量、等電點和表 達量，這是其他蛋白質(zhì)分離手段無法比擬的地方。
四

圖1是麻瘋樹種子油體蛋白雙向電泳圖譜(PH4 - 7預(yù)制膠條分離)
圖2是麻瘋樹種子油體蛋白雙向電泳圖譜(PH6 - 11預(yù)制膠條分離)
在本發(fā)明中使用的所有原材料等均是常規(guī)使用的，可以從市場購 得。在本發(fā)明中，如非特指，所有的量、百分比均為重量單位。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行具體的描述，由技術(shù)常識可知，本發(fā) 明可以通過其他的不脫離其精神實質(zhì)或必要特征的實施方案來實現(xiàn)。因 此，下列實施方案，就各方面而言，都只是舉例說明，并不是僅有的。 所有在本發(fā)明范圍內(nèi)或等同本發(fā)明的范圍內(nèi)的改變均被本發(fā)明包含。
五具體實施例方式
實施例1:按以下步驟進行
1、 第一向等電聚焦電泳采用IPG預(yù)制膠條(購于Amersham Biosciences, U卯sala， Sweden),分為兩段拼接，中酸性端pH4-7， 長度llcm,中堿性端pH6-11,長度llcm，將預(yù)制膠條浸泡在200微升含 有O. 5 - 1. O毫克蛋白質(zhì)樣品中，12小時后取出進行電泳，電泳儀為 Multiphor II electrophoresis unit (購于Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden),電泳條件為20。C恒溫，先分別在300V、 600V和1000V 電壓下電泳l. O小時，再在8000V電壓下電泳6小時。
2、 膠條平衡等電聚焦完成后，取出膠條，在含1.0%二硫蘇糖 醇(DTT)、 6. OM尿素、30。/。w/v甘油、2. 5 % w/v十二烷基碌u酸鈉(SDS )、 50mMTris-HCl和余量去離子水，pH8. 6的平衡緩沖液中平衡15分鐘后， 再轉(zhuǎn)入2. 5 %碘乙酰胺上述平衡緩沖液中平衡15分鐘。
3、 第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳配制聚丙烯酰胺分別為17% 分離膠和4%濃縮膠的垂直板膠，將平衡好的膠條轉(zhuǎn)移到垂直板膠的上 端，用1%的瓊脂糖密封，置于電泳槽上，加滿含O. 3%Tris-HCl、 1.44 %甘氨酸、0. 1%SDS的電極緩沖液，在電流為30mA的條件下電泳約3 小時。
4、 電泳凝膠染色電泳完成后，取下凝膠，置于染色盒中加入100ml 含40%乙醇10%冰乙酸的固定液中，在60次/分鐘的搖床上搖動l小時； 換上100ml含0. 116。/。考馬斯亮藍R- 250、 25%乙醇、8%冰乙酸的染色 液，在60次/分鐘的搖床上搖動l小時；倒出染色液，加入100ml含25。/。 乙醇、8%冰乙酸的脫色液，在60次/分鐘的搖床上搖動30分鐘，重復(fù)3 次，得到蛋白點鮮明凝膠電泳圖譜。
5、凝膠掃描及圖像分析考馬斯亮藍染色后的凝膠用UMAX掃描儀在 參數(shù)為256階灰度、600dpi條件下透射掃描，所得圖像用ImageMaster 2D Platinum軟件(Amersham Bioscience)進行分析，結(jié)果表明，采用雙 向電泳的方法從麻瘋樹種子油體中分離到74個酸性蛋白(圖l)和67個 堿性蛋白(圖2)，共141個蛋白點，等電點分布在5至10之間，酸性和堿 性蛋白種類相當(dāng)，但堿性蛋白表達量更豐富；油體蛋白質(zhì)以低分子量蛋 白為主，蛋白點集中在35KDa以下(圖l、 2)。
權(quán)利要求
1、種麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，其特征在于采用蛋白質(zhì)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進行分離。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，其特征在 于包括第一向等電聚焦電泳步驟、膠條平衡步驟和第二向SDS聚丙 烯酰胺凝膠電泳步驟。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，其特 征在于所述的第一向等電聚焦電泳步驟為采用IPG預(yù)制膠條，分為 兩段拼接，中酸性端pH4-7，長度9-12cm，中堿性端pH6-11， 長度9 - 12cm,將預(yù)制膠條浸泡在180 - 250微升含有0. 5 - 1. 0毫 克蛋白質(zhì)樣品中，12小時后取出進行電泳，電泳條件為2(TC恒溫， 先分別在300V、600V和1000V電壓下電泳0. 6 - 1. 5小時，再在8000V 電壓下電〉永5 - 7小時。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，其特 征在于所述的第一向等電聚焦電泳步驟為采用IPG預(yù)制膠條，分為 兩段拼接，中酸性端pH4-7，長度llcm，中堿性端pH6-11，長度 llcm,將預(yù)制膠條浸泡在200微升含有0. 5 - 1. 0毫克蛋白質(zhì)樣品中， 12小時后取出進行電泳，電泳條件為2(TC恒溫，先分別在300V、 600V 和1000V電壓下電泳1. 0小時，再在8000V電壓下電泳6小時。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，其特 征在于所述的膠條平衡步驟為等電聚焦完成后，取出膠條，在含l.O %二硫蘇糖醇、6.謹尿素、30。/。w/v甘油、2. 5%w/v十二烷基硫酸 鈉、50mM Tris-HC1和余量去離子水，pH8. 6的平衡緩沖液中平衡15 分鐘后，再轉(zhuǎn)入2. 5 %碘乙酰胺上述平衡緩沖液中平衡15分鐘。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，其特 征在于所述的第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟為配制聚丙烯酰 胺分別為15-20%分離膠和3-6%濃縮膠的垂直板膠，將平衡好的 膠條轉(zhuǎn)移到垂直板膠的上端，用1%的瓊脂糖密封，置于電泳槽上， 加滿含0. 2 - 0. 5%Tris、 1. 00 - 1. 6 %甘氨酸、0.05-0.1% SDS的 電極緩沖液，在電流為30mA的條件下電泳2. 5 - 4小時。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，其特 征在于所述的第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟為配制聚丙烯酰 胺分別為17%分離膠和4%濃縮膠的垂直板膠，將平衡好的膠條轉(zhuǎn) 移到垂直板膠的上端，用1%的瓊脂糖密封，置于電泳槽上，加滿 含0.3%Tris、 1.44%甘氨酸、0. 1 % SDS的電極緩沖液，在電流為 30mA的條件下電泳約3小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種麻瘋樹種子油體蛋白質(zhì)分離方法，采用蛋白質(zhì)雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進行分離，包括第一向等電聚焦電泳步驟、膠條平衡步驟和第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟。本發(fā)明的方法分離麻瘋樹種子的貯油細胞器-油體及油體蛋白，有利于了解生物柴油的重要植物儲藏庫，為運用生物技術(shù)手段進一步改良品種，提高種子的油脂含量打下基礎(chǔ)。
文檔編號C07K1/26GK101343312SQ20071019500
公開日2009年1月14日 申請日期2007年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月10日
發(fā)明者劉玉君, 沈世華, 平 茍 申請人:云南神宇新能源有限公司