專利名稱：氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤指一種氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法。
技術(shù)背景
擬除蟲菊酯類農(nóng)藥應(yīng)用相當廣泛，而氰戊菊酯又是其中很主要的一種。目前，氰戊 菊酯類農(nóng)藥殘留檢測方法主要是色譜法和免疫法。
其中，色譜法的具體包括以下幾個步驟一、農(nóng)藥標準樣品的配制；二、樣品制備； 三、樣品提取與凈化，其中，提取過程如下稱取搗碎樣品25. 0g，加石油醚丙酮=1 1的 溶液IOOmL,置組織搗碎機中勻漿提取2min，真空抽濾，分別用25mL混合溶劑洗滌濾渣，過 濾好的溶液用等體積飽和硫酸鈉溶液加入分液漏斗萃取，劇烈振搖lmin，分出有機相，濃縮 至2mL上凈化柱。凈化過程如下在1. 5Cm(ID)X20Cm玻璃層析柱中，加入Icm高無水硫酸 鈉，再加入5g弗羅里硅土載體(5%蒸餾水脫活)，上層再加入Icm高無水硫酸鈉。加正己烷20 mL預(yù)洗層析柱，棄去淋洗液。從提取濾液中移取ImL人柱中，用100 mL (石油醚)V(乙酸 乙酯)-98 :2淋洗，濃縮至IOmL待測；四、色譜分析，色譜柱HP_5，30mX0. 25mmX0. 25 μ m ； 氣體流速氮氣；柱前壓15psi ；尾吹氣60mL / min ；溫度柱溫60°C保持aiiin，再以 300C / min升到至280°C，保持20min ；進樣口 250°C ；檢測器300°C。色譜法存在的缺點 主要有前處理過程復(fù)雜，儀器成本高，操作復(fù)雜，對所需的試劑要求高等。
免疫法的具體步驟如下1、半抗原的制備；2、制備蛋白質(zhì)-半抗原偶聯(lián)物；3、單克 隆和多克隆抗體的制備；4、抗原的固定；5、酶聯(lián)免疫法分析。免疫法存在的缺點主要有抗 原抗體的制備過程耗時長，成本高。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，以便能低成本、 快速地檢測出氰戊菊酯農(nóng)藥。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法， 使用預(yù)先制得的DNA電化學(xué)生物傳感器對待測物進行檢測，所述DNA電化學(xué)生物傳感器包 括作為基體的碳纖維電極，在所述碳纖維電極表面由內(nèi)至外依次層疊設(shè)置有過氧化聚吡咯 膜、納米金層以及DNA層；氰戊菊酯在DNA電化學(xué)生物傳感器上發(fā)生電化學(xué)行為，通過測定 氰戊菊酯的DPV峰電流值，進而根據(jù)預(yù)先確定的表征氰戊菊酯的DPV峰電流值與其濃度之 間關(guān)系的線性回歸方程得出氰戊菊酯的濃度。
進一步地，所述DNA電化學(xué)生物傳感器的制備包括如下步驟制備碳纖維電極步驟將碳纖維進行清洗、干燥后與電極引線銅絲用導(dǎo)電膠粘連，待導(dǎo) 電膠干后，將碳纖維的一端置于酒精燈外焰灼燒以進一步清除其表面的氧化物；拉制玻璃 毛細管的一端，形成內(nèi)徑較另一端要細的尖端，將碳纖維從玻璃毛細管另一端穿入，并自拉 細了的尖端露出廣2mm，再用粘膠將玻璃毛細管兩端封住，待粘膠固化后可得到碳纖維電 極；吡咯的聚合與過氧化步驟將碳纖維電極經(jīng)清洗后再進行如下預(yù)處理分別依次在 30wt%HN0s溶液、丙酮溶液、乙醇溶液中浸泡l(T20min、5 101^11、5 101^11，然后，將該碳纖維 電極在0. 5mol/L的H2SO4溶液中，-0. 2疒1. 2V范圍內(nèi)掃描10 20圈，掃描速率為100mV/s, 待循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定后，將碳纖維電極洗滌干凈、干燥后備用；將預(yù)處理好的碳纖維電極浸 入到0. 2mol/L吡咯溶液中，以50mV/s的掃描速度在_0. 35疒0. 85V范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描10 次；將聚合有吡咯膜的碳纖維電極清洗后晾干，再置于PH=7. 0的Tris-HCl緩沖溶液中，以 Ag/AgCl為參比電極在1. 5V下進行過氧化處理，得到Ppyox/CFE修飾電極；電沉積納米金步驟以Ag/AgCl作為參比電極，鉬片電極作為對電極，修飾有過氧化聚 吡咯膜的碳纖維電極作為工作電極，置入0. 5mmol/L的HAuC14溶液，該溶液中還含有含有 0. 05mol/L的KCl，采用循環(huán)伏安法，在0. 24V -0. 96V內(nèi)以50mV/s的掃描速率，掃描15 圈，得到nano-Au/Ppyox/CFE修飾電極；固定DNA步驟將制備好的nano-Au/Ppyox/CFE修飾電極沖洗后浸入到0. lmg/ml CTDNA溶液中，在1.5V (vs.Ag/AgCl)下富集30min，取出電極后沖洗除去電極上未穩(wěn)定吸 附的DNA，從而得到DNA/nano-Au/Ppyox /CFE修飾電極，亦即DNA電化學(xué)生物傳感器。
進一步地，制備碳纖維電極步驟中，所述碳纖維是依次用丙酮、乙醇和二次蒸餾水 超聲清洗;Γ5 min0
進一步地，制備碳纖維電極步驟中所用引線銅絲直徑0. 2mm,長度10cm。
進一步地，制備碳纖維電極步驟中所用粘膠由環(huán)氧樹脂與乙二胺體積比5 1混合 均勻制得。
進一步地，吡咯的聚合與過氧化步驟中，預(yù)處理前的碳纖維電極以及聚合有吡咯 膜的碳纖維電極均是用二次蒸餾水超聲清洗3 5min。
進一步地，吡咯的聚合與過氧化步驟中，所述吡咯溶液的支持電解質(zhì)為l.Omol/ LKCl。
進一步地，固定DNA步驟中，nano-Au/Ppyox/CFE修飾電極在浸入到CTDNA溶液之 前以及浸泡完成自該溶液中取出后均用二次蒸餾水進行沖洗。
進一步地，氰戊菊酯的DPV峰電流與其濃度之間的關(guān)系，在 9. 5X10_8 9. 5X10_6mol/L濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為 J(nA>=2.013奸0.3206C(jjmol/L),相關(guān)系數(shù)為 0. 9924，檢出下限為 3. OX 10_8 mol/L。
本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明使用DNA電化學(xué)生物傳感器檢測氰戊菊酯農(nóng)藥， 利用的是電化學(xué)檢測方式，可免去眾多復(fù)雜的前處理工作，儀器簡單，成本低，可以實現(xiàn)現(xiàn) 場檢測；而且使用的是一次性的碳纖維修飾電極，DNA電化學(xué)生物傳感器制備步驟也簡單 易行，電極可事先修飾好，實現(xiàn)批量檢測，節(jié)省時間。


圖1是本發(fā)明氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法的檢測曲線圖。
具體實施方式
本發(fā)明首先提供一種氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其具體是應(yīng)用DNA電化學(xué)生物傳感 器來實現(xiàn)的。
在具體應(yīng)用時，氰戊菊酯在DNA電化學(xué)生物傳感器上會發(fā)生電化學(xué)行為，如圖1所 示，氰戊菊酯的DPV峰電流與其濃度之間的關(guān)系，在9.5X10_8 9.5X10_6 mol/L濃度范圍 內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為Ζ(ηΑ>=2.013 Κ).3206σ(μιηο1Λ),根據(jù)測得的氰戊菊酯的DPV峰電流，即可進而確定氰戊菊酯的濃度。需要說明的是，以上的線性回歸方程是采用所 制得的DNA電化學(xué)生物傳感器通過預(yù)先實驗測定多組電流與濃度數(shù)據(jù)后再歸納得出的。線 性回歸方程受到DNA電化學(xué)生物傳感器制備過程中的諸多因素的影響，例如采用的各種 試劑的濃度、處理時間、采用的電壓等參數(shù)，制備過程采用的每一組參數(shù)均可對應(yīng)測定出一 個線性回歸方程，因此線性回歸方程并不是唯一確定的，以上給出的線性回歸方程是根據(jù) 下述的DNA電化學(xué)生物傳感器制備步驟制得的DNA電化學(xué)生物傳感器來預(yù)先測定歸納得出 的，經(jīng)后期實際應(yīng)用過程中的檢測，DPV峰電流與濃度的相關(guān)性系數(shù)可達0. 9擬4，檢出下限 為 3· 0Χ1(Γ8 mol/L。
本發(fā)明所使用的DNA電化學(xué)生物傳感器的制備步驟如下 A、制備碳纖維電極步驟將碳纖維依次用丙酮、乙醇和二次蒸餾水超聲清洗3、min，所述碳纖維的尺寸通常為 直徑7μπι，長度大約15 mm;待干燥后將清洗過的碳纖維與電極引線銅絲用導(dǎo)電膠粘連，所 述引線銅絲一般采用直徑0. 2mm，長度約IOcm的銅絲制得，待導(dǎo)電膠干后，將碳纖維的一端 置于酒精燈外焰1秒鐘，碳纖維在高溫灼燒下表面的氧化物得到進一步的清除；拉制玻璃 毛細管的一端，使得尖端內(nèi)徑約為20 μ m，將碳纖維從玻璃毛細管另一端穿入，并自拉細了 的尖端露出約廣2mm，再用粘膠將玻璃毛細管兩端封住，所述粘膠可由環(huán)氧樹脂與乙二胺體 積比5 1混合均勻制得，可以理解地，其他類型的粘膠同樣也可以達到相同的功效，待粘膠 固化后可得到碳纖維電極。
B、吡咯的聚合與過氧化步驟碳纖維電極上聚合聚吡咯之前，先用二次蒸餾水超聲清洗;Γ5 min，然后分別依次在30 wt%HN03溶液中浸泡1(T20 min，在丙酮、乙醇溶液中各浸泡5 10 min進行預(yù)處理；為提高 電極在溶液中的電化學(xué)活性，將該碳纖維電極在0.5mol/L WH2SO4溶液中，-0.2 V^l. 2 V 范圍內(nèi)掃描1(Γ20圈，掃描速率為100 mV/s。待循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定后，電極用二次蒸餾水洗 滌干凈，于紅外燈下干燥后備用；將預(yù)處理好的碳纖維電極浸入到0. 2mol/L吡咯溶液中， 所述吡咯溶液的支持電解質(zhì)為1. Omol/LKCl,以50mV/s的掃描速度在_0. 35V 0. 85V范 圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描10次；將聚合有吡咯膜的碳纖維電極用二次蒸餾水清洗后晾干，再置于 pH=7. 0的iTris-HCl緩沖溶液中于1. 5V (vs. Ag/AgCl)下過氧化處理300s，得到Ppyox/CFE 修飾電極。
C、電沉積納米金步驟電沉積納米金的過程使用標準的三電極系統(tǒng)，以Ag/AgCl作為參比電極，鉬片電極作 為對電極，修飾有過氧化聚吡咯膜的碳纖維電極作為工作電極。在0. 5mmol/L的HAuC14(含 0. 05mol/L的KCl)溶液中，采用循環(huán)伏安法，在0. 24V -0. 96V內(nèi)以50mV/s的掃描速率， 掃描15圈，得到nano-Au/Ppyox/CFE修飾電極。
D、固定DNA步驟將制備好的nano-Au/Ppyox/CFE修飾電極用二次蒸餾水沖洗后浸入到0. lmg/ml CTDNA溶液中，在1.5V (vs.Ag/AgCl)下富集30min，取出電極后用二次蒸餾水沖洗，除去電極上未穩(wěn)定吸附的DNA，從而得到DNA/nano-Au/Ppyox /CFE修飾電極，即為修飾好的碳纖 維電極，亦即DNA電化學(xué)生物傳感器。
當然，可以理解地，上述DNA電化學(xué)生物傳感器采用其他現(xiàn)有的常規(guī)制備技術(shù)來 制備也是可行的，只需確保所制得的DNA電化學(xué)生物傳感器具備以下的特征其包括作為 基體的碳纖維電極，在所述碳纖維電極表面由內(nèi)至外依次層疊設(shè)置有過氧化聚吡咯膜、納 米金層以及DNA層。
由于本發(fā)明采用電化學(xué)檢測方式，可免去很多復(fù)雜的前處理工作，儀器簡單，成本 低，可以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，另外使用的是一次性的碳纖維修飾電極，電極可事先修飾好，實現(xiàn) 批量檢測，節(jié)省時間。
權(quán)利要求
1.一種氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其特征在于使用預(yù)先制得的DNA電化學(xué)生物傳感器 對待測物進行檢測，所述DNA電化學(xué)生物傳感器包括作為基體的碳纖維電極，在所述碳纖 維電極表面由內(nèi)至外依次層疊設(shè)置有過氧化聚吡咯膜、納米金層以及DNA層；氰戊菊酯在 DNA電化學(xué)生物傳感器上發(fā)生電化學(xué)行為，通過測定氰戊菊酯的DPV峰電流值，進而根據(jù)預(yù) 先確定的表征氰戊菊酯的DPV峰電流值與其濃度之間關(guān)系的線性回歸方程得出氰戊菊酯 的濃度。
2.如要求1所述的氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其特征在于，所述DNA電化學(xué)生物傳感器的 制備包括如下步驟制備碳纖維電極步驟將碳纖維進行清洗、干燥后與電極引線銅絲用導(dǎo)電膠粘連，待導(dǎo) 電膠干后，將碳纖維的一端置于酒精燈外焰灼燒以進一步清除其表面的氧化物；拉制玻璃 毛細管的一端，形成內(nèi)徑較另一端要細的尖端，將碳纖維從玻璃毛細管另一端穿入，并自拉 細了的尖端露出廣2mm，再用粘膠將玻璃毛細管兩端封住，待粘膠固化后可得到碳纖維電 極；吡咯的聚合與過氧化步驟將碳纖維電極經(jīng)清洗后再進行如下預(yù)處理分別依次在 30wt%HN0s溶液、丙酮溶液、乙醇溶液中浸泡l(T20min、5 101^11、5 101^11，然后，將該碳纖維 電極在0. 5mol/L的H2SO4溶液中，-0. 2疒1. 2V范圍內(nèi)掃描10 20圈，掃描速率為100mV/s, 待循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定后，將碳纖維電極洗滌干凈、干燥后備用；將預(yù)處理好的碳纖維電極浸 入到0. 2mol/L吡咯溶液中，以50mV/s的掃描速度在_0. 35疒0. 85V范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描10 次；將聚合有吡咯膜的碳纖維電極清洗后晾干，再置于PH=7. 0的Tris-HCl緩沖溶液中，以 Ag/AgCl為參比電極在1. 5V下進行過氧化處理，得到Ppyox/CFE修飾電極；電沉積納米金步驟以Ag/AgCl作為參比電極，鉬片電極作為對電極，修飾有過氧化聚 吡咯膜的碳纖維電極作為工作電極，置入0. 5mmol/L的HAuC14溶液，該溶液中還含有含有 0. 05mol/L的KCl，采用循環(huán)伏安法，在0. 24V -0. 96V內(nèi)以50mV/s的掃描速率，掃描15 圈，得到nano-Au/Ppyox/CFE修飾電極；固定DNA步驟將制備好的nano-Au/Ppyox/CFE修飾電極沖洗后浸入到0. lmg/ml CTDNA溶液中，在1.5V (vs.Ag/AgCl)下富集30min，取出電極后沖洗除去電極上未穩(wěn)定吸 附的DNA，從而得到DNA/nano-Au/Ppyox /CFE修飾電極，亦即DNA電化學(xué)生物傳感器。
3.如權(quán)利要求2所述的氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其特征在于制備碳纖維電極步驟中， 所述碳纖維是依次用丙酮、乙醇和二次蒸餾水超聲清洗3、min。
4.如權(quán)利要求3所述的氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其特征在于制備碳纖維電極步驟中 所用引線銅絲直徑0. 2mm，長度10cm。
5.如權(quán)利要求2所述的氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其特征在于制備碳纖維電極步驟中 所用粘膠由環(huán)氧樹脂與乙二胺體積比5 1混合均勻制得。
6.如權(quán)利要求2所述的氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其特征在于吡咯的聚合與過氧化步 驟中，預(yù)處理前的碳纖維電極以及聚合有吡咯膜的碳纖維電極均是用二次蒸餾水超聲清洗 3 5min。
7.如權(quán)利要求2所述的氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其特征在于吡咯的聚合與過氧化步 驟中，所述吡咯溶液的支持電解質(zhì)為1. Omol/LKCl。
8.如權(quán)利要求2所述的氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其特征在于固定DNA步驟中，nano-Au/Ppyox/CFE修飾電極在浸入到CTDNA溶液之前以及浸泡完成自該溶液中取出后均 用二次蒸餾水進行沖洗。
9.如權(quán)利要求1、任一項所述的氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，其特 征在于氰戊菊酯的DPV峰電流與其濃度之間的關(guān)系，在9. 5X ΙΟ"8 9.5X10_6mol/L濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為 J(nA)=2.013S+0.3206C(ijmol/L),檢出下限為 3. OX 10_8 mol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氰戊菊酯農(nóng)藥檢測方法，使用預(yù)先制得的DNA電化學(xué)生物傳感器對待測物進行檢測，所述DNA電化學(xué)生物傳感器包括作為基體的碳纖維電極，在所述碳纖維電極表面由內(nèi)至外依次層疊設(shè)置有過氧化聚吡咯膜、納米金層以及DNA層；氰戊菊酯在DNA電化學(xué)生物傳感器上發(fā)生電化學(xué)行為，通過測定氰戊菊酯的DPV峰電流值，進而確定氰戊菊酯的濃度。本發(fā)明使用DNA電化學(xué)生物傳感器檢測氰戊菊酯農(nóng)藥，利用的是電化學(xué)檢測方式，可免去眾多復(fù)雜的前處理工作，儀器簡單，成本低，可以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測；而且使用的是一次性的碳纖維修飾電極，DNA電化學(xué)生物傳感器制備步驟也簡單易行，電極可事先修飾好，實現(xiàn)批量檢測，節(jié)省時間。
文檔編號G01N27/60GK102033085SQ201010538509
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者劉引, 吳朝陽, 欒崇林, 蔣曉華 申請人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院