專利名稱：一種鹽酸克倫特羅磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及食品安全相關(guān)的免疫檢測(cè)分析技術(shù)，特 別提供了一種快速檢測(cè)鹽酸克倫特羅(Clenbuterol，CLB)的磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方 法，適用于尿液、肝臟、肉類和其他組織中的鹽酸克倫特羅的定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(Clenbuterol，CLB)是一種平喘藥。該藥物既不是獸藥，也不是飼 料添加劑，而是腎上腺類神經(jīng)興奮劑。瘦肉精是一種β 2-受體激動(dòng)劑，20世紀(jì)80年代初， 美國(guó)一家公司開始將其添加到飼料中，增加瘦肉率，但如果作為飼料添加劑，使用劑量是人 用藥劑量的10倍以上，才能達(dá)到提高瘦肉率的效果。它用量大、使用時(shí)間長(zhǎng)、代謝慢，所以 在屠宰前到上市，在豬體內(nèi)的殘留量都很大。這個(gè)殘留量通過食物進(jìn)入人體，就使人體漸漸 地積蓄中毒。如果一次攝入量過大，就會(huì)產(chǎn)生異常生理反應(yīng)的中毒現(xiàn)象，因此而被禁用。國(guó) 內(nèi)養(yǎng)豬戶不顧農(nóng)業(yè)部的規(guī)定，為了使豬肉不長(zhǎng)肥膘，在飼料中摻入鹽酸克倫特羅。豬食用后 在代謝過程中促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，加速脂肪的轉(zhuǎn)化和分解，提高了豬肉的瘦肉率，因此稱為瘦 肉精。鹽酸克倫特羅在胃腸道吸收快，15-20分鐘即起作用，2-3小時(shí)血漿濃度達(dá)峰值， 一般健康人食用20 μ g藥效會(huì)有所表現(xiàn)，5-10倍的攝入量則會(huì)導(dǎo)致中毒，癥狀為心率加 速、臉色潮紅、胸悶、心悸、頭痛、發(fā)熱、寒戰(zhàn)。鹽酸克倫特羅刺激人體骨骼肌β 2-受體后，引 起人體四肢、面、頸部骨骼肌振顫。長(zhǎng)時(shí)間亞治療劑量攝入，激素殘留逐漸蓄積引起慢性毒 性作用可使人體產(chǎn)生低敏感現(xiàn)象，即支氣管擴(kuò)張作用明顯減弱，作用持續(xù)時(shí)間縮短，使得哮 喘發(fā)生率和發(fā)病程度增高，同時(shí)還可引起內(nèi)分泌紊亂，導(dǎo)致血液中乳酸、丙酮酸濃度升高， 糖尿病人可能因此酸中毒。食品和飼料中瘦肉精殘留量的檢測(cè)具有重要意義。磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒 分離技術(shù)與酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合而建立的一種新型免疫檢測(cè)方法。傳統(tǒng)ELISA方法， 抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)是在固相(ELISA板反應(yīng)孔)表面進(jìn)行的，而磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢 測(cè)方法，抗原、抗體的結(jié)合反應(yīng)也在近似液相的條件下進(jìn)行，因而反應(yīng)快速、徹底。與傳統(tǒng) ELISA相比具有靈敏度高，檢測(cè)用時(shí)少的優(yōu)點(diǎn)?！案?jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)法”是一種多用于檢測(cè)小分子半抗原的方法，其檢測(cè)原理是待測(cè) 抗原與酶標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合少量的固相抗體，通過洗滌去除未結(jié)合的抗原，最后加入生 物酶催化的顯色或發(fā)光底物顯色。在一定濃度范圍內(nèi)，顯色或發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)抗原含量呈 反比。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有靈敏度高、特異性好、適用性廣、操作簡(jiǎn)便和節(jié)省 檢測(cè)時(shí)間的檢測(cè)CLB的磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。
所述的CLB磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的試劑組成包括①磁分離試劑[結(jié)合 有抗異硫氰酸熒光素(FITC)抗體的磁微?；鞈乙篯；②抗試劑(FITC標(biāo)記的CLB抗體溶 液)；③酶標(biāo)抗原試劑(偶聯(lián)有生物酶的CLB溶液)；④清洗液；⑤CLB校準(zhǔn)品(含有一定 量CLB抗原的溶液)；⑥質(zhì)控品(含有一定量CLB抗原的溶液)；⑦底物溶液(顯色或發(fā)光 底物溶液)；⑧終止液。所述的CLB磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的檢測(cè)方法如下(1)樣本(食品、飼料等)處理尿液樣本可以直接用于檢測(cè)。(如果樣本很渾濁， 需要經(jīng)過離心或者過濾再進(jìn)行檢測(cè))；內(nèi)臟組織，肌肉等需粉碎均勻，加入一定比例的10% Na2C03,加入乙酸乙酯，混合，離心。取上層液留用，下層沉淀再洗一次，將兩次離心的上層 液合并，60°C氮?dú)獯蹈?，加入純化水?fù)溶，即可用于檢測(cè)。(2)加樣和免疫反應(yīng)在試管中加入20-200μ 1樣本，然后依次加入20-200μ 1酶 標(biāo)抗原試劑和20-200 μ 1抗試劑。混勻后，37°C溫育5-30分鐘；(3)加磁分離試劑在試管中加入20-100 μ 1,0. 1-lOmg/ml的磁分離試劑，混勻 后，37 °C溫育5-30分鐘；(4)洗滌使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去上清，加入100-500 μ 1清洗液，去除磁場(chǎng)，震 蕩30秒使磁微粒充分混懸，再次使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清液。如此重復(fù)洗滌2-4 次；(5)加底物溶液每管加入50-300 μ 1生物酶催化的顯色或發(fā)光底物?；靹蚝?， 37°C溫育5-30分鐘；(6)終止顯色每管加入100-300 μ 1終止液，并放在磁分離器上分離10分鐘(適 用于顯色法)；(7)讀值在分光光度計(jì)或發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)儀上讀取吸光度或發(fā)光強(qiáng)度值；所述的 CLB磁微粒分離酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的工作原理是首先，通過樣本處理過程，使樣本中的 CLB溶解在水溶液中用于后續(xù)分析。樣本提取液與酶標(biāo)CLB抗原試劑、FITC標(biāo)抗試劑混合 溫育后，樣品中的CLB與酶標(biāo)CLB競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合少量的FITC標(biāo)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物。加 入偶聯(lián)有羊抗FITC抗體的磁分離試劑后，磁分離試劑可將免疫復(fù)合物捕獲到磁微粒表面。 經(jīng)過洗滌，去除未結(jié)合的CLB、酶標(biāo)CLB和其他雜質(zhì)。最后加入酶催化的顯色或發(fā)光底物。 在一定濃度范圍內(nèi)，待測(cè)樣本中的CLB含量與顯色或發(fā)光程度呈反比，據(jù)此可以定量測(cè)定 樣本中CLB的含量。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下(1)磁分離試劑的制備將抗FITC抗體連接在磁微粒表面。所述的磁微粒直徑在 0. 1_5.0μπι之間，具有超順磁性，表面可含有氨基(ΝΗ2-)或羧基(C00H-)活性基團(tuán)。所述 的羊抗FITC抗體與磁微粒的連接可以通過化學(xué)交聯(lián)劑，如戊二醛、l-ethyl-3-[3-dimethy laminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)等以共價(jià)鍵的形式，也可以通過物理吸 附(靜電作用、離子鍵或疏水作用等)的形式。(2)酶標(biāo)抗原試劑的制備將CLB衍生物與牛血清白蛋白(BSA)共價(jià)連接， 之后再與生物酶共價(jià)連接。所述的生物酶可以是辣根過氧化物酶(HRP)，也可以是堿 性磷酸酶(ALP)。共價(jià)連接方法可以通過過碘酸鈉氧化法、戊二醛法或Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate(SMCC)、2_Iminothiolane *HC1 (2IT)
4交聯(lián)等多種方法。(3)抗試劑的制備將CLB抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)的共價(jià)連接物溶液。所 述CLB抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。(4)底物溶液所述的底物溶液可以是HRP催化的顯色底物甲基聯(lián)苯胺 (Tetrabenzidine，TMB)或發(fā)光底物魯米諾(Luminol)等，也可以是ALP催化的顯色底物單 磷酸酚酞(PMP)或發(fā)光底物AMPPD，CSPD和CSPD-Star等。(5) CLB校準(zhǔn)品和質(zhì)控品將高純度CLB抗原稱重后用水溶液溶解分裝制成。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)樣本處理方法簡(jiǎn)單。樣本經(jīng)粉碎、提取、吹干和復(fù)溶等簡(jiǎn)單處理后即可用于檢 測(cè)，不需過夜處理和過純化柱等復(fù)雜的過程。(2)該方法檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便和節(jié)省檢測(cè)時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。


圖1磁微粒分離酶聯(lián)免疫法檢測(cè)CLB示意圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 抗FITC抗原與表面氨基(C00H-)磁微粒偶聯(lián)，制備磁分離試劑取IOOmg表面含羧基(C00H-)活性基團(tuán)的磁微粒用0. IM MES(2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid)，pH 4. 5-5溶液IOml洗滌3次。磁微粒用該溶液Iml重懸，加入2mg 抗FITC抗體，混合均勻。加入100 μ 1 10mg/ml EDC溶液，混合均勻后室溫反應(yīng)2小時(shí)。用 IOml含牛血清白蛋白(BSA)的0. OlM磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7. 4洗滌磁珠3次后，用該 溶液配制成2. 5mg/ml的磁分離試劑工作液。實(shí)施例2 =CLB-BSA連接堿性磷酸酶(ALP)，制備酶標(biāo)抗原試劑取5mg CLB-BSA抗原，濃縮至5mg/ml，加入13. 76mg/ml的活化劑 2-Iminothiolane -HCl (2IT)溶液10 μ 1，室溫放置30分鐘后加甘氨酸終止活化反應(yīng)，室溫 下放置5分鐘。使用Si^phadex G25柱子除鹽，收集蛋白洗脫峰。取 5mg ALP 溶液，力口 入 6. 69mg/ml 的 Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)溶液50 μ 1，室溫放置15分鐘，加入甘氨酸終止活化反 應(yīng)，室溫放置5分鐘。使用Si^phadex G25柱子除鹽，收集蛋白洗脫峰。將活化的CLB-BSA與活化的ALP混合，室溫放置10個(gè)小時(shí)，然后使用 Supperdex200凝膠層析柱分離純化，除去未連接的游離CLB-BSA和ALP，將連接物保存于 4°C。酶標(biāo)抗原試劑稀釋液配制方法為Tris 12. llg，氯化鈉8. 77g，疊氮鈉lg，加純化 水至600ml，校正pH值至7. 5。加Tween_20 2mL, BSA 10g，加純化水定容至1000ml。用 0.22 um過濾器過濾，于4°C保存。將上述CLB-BSA-ALP連接物用上述稀釋液稀釋到1_5 μ g/ml配制成酶標(biāo)抗原試劑 工作液。實(shí)施例3 抗CLB抗體連接FITC，制備抗試劑取5mg抗CLB抗體溶液對(duì)20mM pH9. 0碳酸緩沖液透析超過12h，透析后濃度要求
5大于lmg/ml。加入500 μ 1 0. 5mg/ml的FITC溶液(以20mM pH9. 0碳酸緩沖液配制)，混 勻后室溫反應(yīng)超過12h。使用S印hadex G25柱子除去未結(jié)合FITC，收集蛋白洗脫峰。
抗試劑稀釋液配制方法與酶標(biāo)抗原試劑稀釋液配制方法相同，將上述CLB抗體 FITC連接物用稀釋液稀釋到1-5 μ g/ml，配制成抗試劑工作液。實(shí)施例4 =CLB磁微粒分離酶免疫檢測(cè)法檢測(cè)豬肉樣本中CLB
材料與儀器
(1)磁分離試劑見上述磁分離試劑的制備；
⑵酶標(biāo)抗原試劑見上述酶標(biāo)抗原試劑的制備；
⑶抗試劑見上述抗試劑的制備；
⑷洗滌液500mL(北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；
(5)底物溶物(PMP溶液)300mL(北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；
(6)終止溶液600mL(北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；
(7)磁分離酶聯(lián)免疫測(cè)定儀北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；
⑶磁分離器北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；
(9)水浴箱(用于37°C溫浴)。
(1)檢測(cè)步驟如下
⑵樣本處理從大量均勻樣本中取5g，加入3ml 10% Na2C03，震蕩3分鐘；加入
15ml乙酸乙酯，混合5分鐘，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘；將上層液全部轉(zhuǎn)到一干凈器皿中， 下層沉淀再加入15ml乙酸乙酯，混合5分鐘，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘；將兩次離心的上 層液各取3ml合并(相當(dāng)于Ig樣本)；60°C氮?dú)獯蹈?，加入Iml純化水復(fù)溶；取60 μ 1用于 檢測(cè)。(3)加樣與免疫反應(yīng)在平底試管中加入60 μ L樣本溶液，然后分別依次加入 60 μ 1酶標(biāo)抗原試劑和60 μ 1抗試劑，混勻后37°C溫育15分鐘；(4)加磁分離試劑在試管中加入60 μ 1混勻后的磁分離試劑，混勻后37°C溫育5 分鐘；(5)洗滌將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，倒去上清液，每管加入清洗液 300 μ L，充分混勻后，再將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，棄去上清液。重復(fù)洗滌過 程2次；(6)加入底物溶液每管加入100 μ 1單磷酸酚酞(PMP)底物溶液，混勻后，37°C溫 育15分鐘；(7)終止顯色每管加入300 μ L終止液，并放在磁分離器上分離10分鐘；(8)讀取吸光度值用分光光度計(jì)或磁酶免測(cè)定儀讀取吸光度值，波長(zhǎng)為 492nm/550nmo檢測(cè)結(jié)果(1)測(cè)量范圍0 IOppb(2)準(zhǔn)確度回收率為85 士 15%。(3)重復(fù)性批內(nèi)變異系數(shù)CV彡10% ；批間變異系數(shù)CV彡15%(4)靈敏度靈敏度不高于0. lppb。(5)特異性與其他類似毒素的交叉反應(yīng)率見下表。
權(quán)利要求
一種鹽酸克倫特羅(CLB)磁微粒分離酶聯(lián)免疫方法，其特征在于檢測(cè)步驟為(1)加樣與免疫反應(yīng)在試管中加入20 200μl樣本溶液、CLB校準(zhǔn)品或CLB質(zhì)控品，然后加入20 200μl酶標(biāo)抗原試劑和20 200μl抗試劑?；靹蚝?，37℃溫育5 30分鐘；(2)加磁分離試劑在試管中加入20 100μl磁分離試劑，混勻后，37℃溫育5 30分鐘；(3)洗滌使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去上清，加入100 500μl清洗液，去除磁場(chǎng)，震蕩使磁微粒充分混懸30秒，然后再次使磁微粒在磁場(chǎng)中沉降，去除上清液。如此重復(fù)2 4次；(4)加底物溶液每管加入50 300μl生物酶催化的顯色或發(fā)光底物，混勻后，37℃溫育5 30分鐘；(5)終止顯色(僅適用于顯色法)每管加入100 300μl終止液，并放在磁分離器上分離10分鐘；(6)讀值在分光光度計(jì)或發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)儀上讀取吸光度或發(fā)光強(qiáng)度值；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗試劑其特征在于是抗CLB抗體與異硫氰酸熒光素(FITC) 的共價(jià)連接物溶液。所述抗CLB抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。其工作濃 度為 0. 2-10μ g/mL·
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶標(biāo)抗原試劑，其特征在于是鹽酸克倫特羅與牛血清白 蛋白(BSA)的共價(jià)連接物(CLB-BSA)進(jìn)一步共價(jià)連接生物酶形成的連接物溶液。所述的 生物酶可以是辣根過氧化物酶(HRP)，也可以是堿性磷酸酶(ALP)。生物酶與CLB-BSA的 連接方法可以通過過碘酸鈉氧化法，戊二醛法或Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交聯(lián)法等多種方法。其 工作濃度為0. 5-5yg/mL·
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鹽酸克倫特羅(CLB)磁微粒分離酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法，屬于食品安全免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用競(jìng)爭(zhēng)法的免疫檢測(cè)原理，將CLB與生物酶連接制成酶標(biāo)抗原試劑，將抗異硫氰酸熒光素(FITC)抗體吸附在磁微粒表面制成磁分離試劑，將FITC與抗CLB抗體連接制成抗試劑。樣本中CLB與酶標(biāo)CLB競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合少量的FITC標(biāo)抗CLB抗體，形成抗原抗體復(fù)合物。加入磁分離試劑后，磁微粒表面連接的抗FITC抗體將復(fù)合物捕獲到磁微粒表面。洗滌，最后加入底物并檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于①以磁微粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)酶標(biāo)板作為固相載體，使免疫反應(yīng)接近液相條件下進(jìn)行，反應(yīng)更充分和迅速，與傳統(tǒng)ELISA方法比較，具有特異性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)；②采用一步競(jìng)爭(zhēng)法原理，檢測(cè)用時(shí)短。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101907627SQ20101024589
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者仝文斌, 郭健夫, 韓子華, 韓學(xué)棟 申請(qǐng)人:北京倍愛康生物技術(shù)有限公司