專利名稱：以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈dna抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測被測樣品中的抗雙鏈DNA抗體的方法，尤其涉及一種 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測被測樣品中的抗雙鏈DNA抗體的方法。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是臨床上較為常見的一種自身免疫性疾病，患者突 出表現(xiàn)是存在多種自身抗體，其中最重要的是抗雙鏈DNA抗體。這是一種能夠 與天然DNA結(jié)合的自身抗體，幾乎僅在SLE患者中可檢測到該抗體?？闺p鏈DNA 抗體滴度的消長與SLE患者的病情變化相關(guān)，隨著疾病活動(dòng)的控制，抗雙鏈DNA 抗體的滴度可以下降或消失。早期的間接血凝、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和對流免疫電泳等方法因靈敏度和特異性 差而被淘汰，現(xiàn)在應(yīng)用較廣泛的檢測方法大致有如下幾種免疫熒光法(IFT)、 免疫印跡法(Immunoblot assay)、放射免疫法(RIA)、斑點(diǎn)免疫金滲濾法(DIGFA)、 膠體金層析法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。免疫熒光法(IFA)是將已稀釋血清與實(shí)驗(yàn)基質(zhì)進(jìn)行溫育，令特異性抗體與 實(shí)驗(yàn)基質(zhì)中相應(yīng)抗原結(jié)合，然后再與熒光標(biāo)記的第二抗體溫育，最后在熒光顯 微鏡下觀察相應(yīng)部位的特異性熒光模式。IFA法只能作為臨床診斷的參考，不能 作為確診的重要依據(jù)。另外這種方法還需要一臺質(zhì)量較好的熒光顯微鏡，對操 作人員要較高，操作復(fù)雜耗時(shí)長且存在其他干擾物質(zhì)，易出現(xiàn)假陽性。免疫印跡法(I腿unoblot assay)是將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白及多 肽與免疫反應(yīng)的高特異性相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)，但其制備方法繁瑣、成本相對較 高。放射免疫法(RIA)是以同位素標(biāo)記的雙鏈DNA與檢測樣品中的抗雙鏈DNA 抗體結(jié)合，易產(chǎn)生放射性污染，且有其他干擾物質(zhì)易產(chǎn)生假陽性；檢測需要特 殊的儀器設(shè)備，檢測時(shí)間長；不能實(shí)現(xiàn)單項(xiàng)檢測。 膠體金免疫層析法是將包被抗原、膠體金標(biāo)記抗體固相化，與樣本吸附材 料等組合在一起制備為免疫層析診斷試紙條。該方法只能進(jìn)行定性檢測。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化 作用相結(jié)合發(fā)展建立的一種非放射性標(biāo)記免疫分析方法。該法是將純化的DNA 抗原包被在固相載體上，與一定稀釋度的待測血清反應(yīng)，然后與HRP標(biāo)記的二 抗(抗人IgG， IgA, IgM或抗人IgG.A.M的混合物)反應(yīng)，HRP可于顯色液發(fā)生 顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上采用雙波段(450nm、 630nm)測定其吸光度。由于ELISA 具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、酶免疫試劑的性質(zhì)比較穩(wěn)定，操作方法簡便快速、 無放射性污染以及應(yīng)用范圍廣等很多優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的一項(xiàng)免疫學(xué) 實(shí)驗(yàn)。由于純化的或重組的抗原生產(chǎn)技術(shù)的成熟，商品化用于抗雙鏈DNA抗體 檢測的高質(zhì)量ELISA試劑盒已日漸增多。由于該檢測方法的靈敏度高、特異性 強(qiáng)、可量化且排除了人為的主觀判斷，費(fèi)用低廉，是目前國外大多數(shù)自身免疫 診斷檢測實(shí)驗(yàn)室的首選檢測方法。但是國外一些公司生產(chǎn)的試劑盒價(jià)格昂貴， 無法推廣和大量使用。目前國內(nèi)還沒有自行生產(chǎn)的應(yīng)用間接ELISA法檢測抗雙 鏈DNA抗體的試劑盒面市。目前，現(xiàn)有的檢測抗雙鏈DNA抗體的方法存在以下不足1、 檢測步驟繁瑣，檢測時(shí)間長，如RIA法及IFA法。2、 檢測試劑需要冷藏，如RIA法、IFA法、免疫印跡法和斑點(diǎn)免疫金滲濾法。3、 檢測需要特殊的儀器設(shè)備，如IFA法需熒光電鏡檢測，RIA法需Y-計(jì)數(shù) 儀或Y-閃爍計(jì)數(shù)儀檢測。4、 檢測時(shí)存在放射性污染，如RIA法。5、 只能進(jìn)行定性而不能進(jìn)行定量檢測，如膠體金免疫層析法，RIA法、IFA 法和斑點(diǎn)免疫金濾法。6、 檢測方法本身存在很強(qiáng)的主觀性，如IFA法、膠體金免疫層析法均需人 工讀圖，存在很強(qiáng)的主觀判斷因素。7、 目前國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對抗雙鏈DNA抗體的傳統(tǒng)ELISA檢測方法還處于 定性階段。雖然抗雙鏈DNA抗體的傳統(tǒng)ELISA檢測方法快速簡便，較為準(zhǔn)確， 但是作為臨床診斷還存在不足的方面，如檢出的靈敏度差。因?yàn)閭鹘y(tǒng)ELISA法
的載體為聚苯乙烯板，反應(yīng)只在微孔表面進(jìn)行，從而限制了該方法的檢測靈敏度。故目前國內(nèi)主要采用膠體金標(biāo)記和快速膜斑點(diǎn)滲濾法定性的檢測抗雙鏈DNA抗體。組裝型磁性復(fù)合微粒和核/殼型超順磁性復(fù)合微粒的制備方法以及結(jié)構(gòu)組 成己經(jīng)在中國專利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分別進(jìn)行了公開，但其應(yīng) 用中主要包括分子固定以及相關(guān)檢測的內(nèi)容，未涉及到抗雙鏈DNA抗體檢測方 面的內(nèi)容。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種檢測抗雙鏈DNA抗體的方法，其解決了現(xiàn)有檢測抗 雙鏈DNA抗體的靈敏度差的缺點(diǎn)。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈DNA抗體的方法，包括以下步驟l]DNA在金磁微粒表面的固定取金磁微粒加入離心管中，磁性分離棄上清 后，用偶聯(lián)緩沖液洗滌金磁微粒，磁性分離棄上清后加入純化的天然雙鏈DNA 或者質(zhì)粒DNA及偶聯(lián)緩沖液于金磁微粒中，在20 40。C條件下充分反應(yīng)20 40min，形成金磁微粒-DNA復(fù)合物；或者將全血、唾液、精液或質(zhì)粒制成溶液體 系，用金磁微粒從中提取DNA并使其固定在金磁微粒表面；2]金磁微粒的封閉將金磁微粒磁性分離棄上清后，加入封閉劑于離心管 中，在20 40。C條件下充分反應(yīng)1 2h，取出，4""C過夜；3]金磁微粒的清洗用清洗緩沖液清洗封閉后的金磁微粒；4]金磁微粒的保存將清洗完畢的金磁微粒加入保存緩沖液，4'C保存，備用；5]抗雙鏈DNA抗體的檢測以清洗后的金磁微粒表面的DNA為抗原，運(yùn)用 間接ELISA法、免疫熒光法或化學(xué)發(fā)光法檢測抗雙鏈DNA抗體。上述加入的金磁微粒質(zhì)量為0. 5 5mg;上述加入的DNA質(zhì)量為5 25 u g。 上述偶聯(lián)緩沖液為0. 5X 10X的pH=5. 0 8.0的PBS，或者5mM 10M的 pH二9. 0 11. 0的CBS，或者5mM 10M的pH=7. 0 9. 0的Tris-HCl緩沖液，或 者5mM 10M的pH=3. 6 5. 6的醋酸鹽緩沖液，或者5mM 10M的pH=3. 0 7. 0
的檸檬酸鹽緩沖液，或者5mM 10M的pH=7. 0 9. 0的TBS緩沖液，或者為10 25之間的聚乙二醇(PEG) 6000 10000加入0. 5 5. OM的鹽，所述鹽可以是氯 化鈉、氯化鋰、氯化鋇、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化銫等；所述封閉劑為 無關(guān)蛋白和上述偶聯(lián)緩沖液的混合溶液，所述無關(guān)蛋白為1% 10%的牛血清白蛋 白、1% 10%賴氨酸、1% 10%脫脂奶粉、1% 10%乙醇胺或1% 10%動(dòng)物血清中 的一種或多種；所述清洗緩沖液為偶聯(lián)緩沖液或者含有0. 02% 0. 2%吐溫的偶聯(lián) 緩沖液；所述保存緩沖液為偶聯(lián)緩沖液或者加入防腐劑和保護(hù)劑的偶聯(lián)緩沖液， 所述防腐劑為0. 01% 0. 1%的疊氮納或者0. 01% 0. 1%的硫柳汞，所述保護(hù)劑為 0. 05% 1%的BSA、 0. 05% 1%的動(dòng)物血清或者0. 05% 1%的蛋白酶抑制劑。上述偶聯(lián)緩沖液優(yōu)選10%的PEG 8000和2. 5 M的氯化鈉的混合溶液；封閉 劑優(yōu)選0. 1M的pH=7. 0的PBS緩沖液、2%的BSA、 5%的小牛血清的混合溶液；清 洗緩沖液優(yōu)選0. 1M的pH=7. 0的PBS緩沖液、0. 5%的吐溫-20的混合溶液；保存 緩沖液優(yōu)選0. 1M的pH=7. 0的PBS緩沖液。上述抗雙鏈DNA抗體的檢測可運(yùn)用間接ELISA法，包括以下步驟l]編號將試管置于磁性分離器上，分別設(shè)待檢樣品試管孔2孔，陽性對 照試管孔2孔，陰性對照試管孔3孔，空白對照l孔；2]加抗原每孔各加入30" L的已固定DNA的金磁微粒；3]加樣分別在待檢樣品試管孔中加入待測樣品50uL，陽性對照孔、陰性 對照孔各加入陰、陽對照50 100"L搖勻；4]溫育覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;5]洗滌:磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗原抗體反應(yīng)的物 質(zhì)都洗掉；6]加酶分別在陽性對照試管孔、陰性對照試管孔和待檢樣品試管孔中各 加入50 100 ii L酶標(biāo)的抗人IgG;7]抗體反應(yīng)覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;8]洗滌磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗體反應(yīng)的抗人IgG 都洗掉-,9]顯色反應(yīng)每個(gè)試管孔各加顯色液A、 B各50 100uL，輕搖混勻后置生 化培養(yǎng)箱中顯色5 15min;IO]結(jié)果判定每個(gè)試管孔各加終止液100 200uL，輕搖混勻，磁性分離 2分鐘后，從每個(gè)試管孔中各取100uL上清液轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)條中，在酶標(biāo)儀上采 用450nm和630nm雙波段測定各試管孔0D值。上述抗雙鏈DNA抗體的檢測還可采用免疫熒光法，包括以下步驟l]編號將試管置于磁性分離器上，分別設(shè)待檢樣品試管孔2孔，陽性對 照試管孔2孔，陰性對照試管孔3孔，空白對照l孔；2]加抗原每孔各加入30u L的己固定DNA的金磁微粒；3]加樣分別在待檢樣品試管孔中加入待測樣品50uL，陽性對照孔、陰性 對照孔各加入陰、陽對照50 100pL搖勻；4]溫育覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;5]洗滌磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗原抗體反應(yīng)的物 質(zhì)都洗掉；6]加熒光標(biāo)記的抗人IgG:分別在陽性對照試管孔、陰性對照試管孔和待檢 樣品試管孔中各加入50 100 u L FITC標(biāo)記的抗人IgG;7]抗體反應(yīng)覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;8]洗滌:磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 u L 0. 01M PBST, 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗體反應(yīng)的抗人IgG 都洗掉；9]結(jié)果判定將獲得的特異免疫熒光復(fù)合物置于顯微鏡下觀察判定結(jié)果。上述抗雙鏈DNA抗體的檢測還可釆用化學(xué)發(fā)光法，包括以下步驟l]編號將試管置于磁性分離器上，分別設(shè)待檢樣品試管孔2孔，陽性對 照試管孔2孔，陰性對照試管孔3孔，空白對照1孑L;2]加抗原每孔各加入30ii L的己固定DNA的金磁微粒； 3]加樣分別在待檢樣品試管孔中加入待測樣品50uL、陽性對照孔、陰性 對照孔各加入陰、陽對照50 100uL搖勻；4]溫育覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;5]洗滌磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 y L 0. OIM PBST, 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗原抗體反應(yīng)的物 質(zhì)都洗掉；6]加酶分別在陽性對照試管孔、陰性對照試管孔和待檢樣品試管孔中各 加入50 100 u L HRP標(biāo)記的抗人IgG;7]抗體反應(yīng)覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;8]洗滌:磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 " L 0. 01M PBST， 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗體反應(yīng)的抗人IgG 都洗掉；9]顯色反應(yīng)將金磁微粒從試管內(nèi)轉(zhuǎn)入酶標(biāo)孔中，每個(gè)酶標(biāo)孔各加入發(fā)光 物質(zhì)100 200u L;10]結(jié)果判定將酶標(biāo)孔置于化學(xué)發(fā)光檢測儀中測樣品、陽性對照、陰性對照及空白孔的信號值。與現(xiàn)有的抗雙鏈DNA抗體檢測方法相比較，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)是1、 包被效率高。本發(fā)明在金磁微粒表面包被天然DNA或質(zhì)粒DNA或運(yùn)用金 磁微粒從人全血、唾液、精液或質(zhì)粒中提取DNA作為抗原。因金磁微粒具有較 大的比表面積，因此具有更大的固定容量，單位質(zhì)量的金磁微粒能夠包被較大 量的DNA。比如對抗體的包被，lmg的金磁微粒能夠固定0.3mg以上的抗體。由 于此種金磁微粒對生物分子的固定化容量的強(qiáng)大，可高效率的吸附溶液中的DNA 抗原。2、 檢測的靈敏度和特異性高。本發(fā)明以金磁微粒作為檢測抗雙鏈DNA抗體 的載體基質(zhì)。金磁微粒兼具超順磁性，磁粒在磁場的作用下易于分離和金、銀 表面極易與巰基化生物活性物質(zhì)結(jié)合而易被修飾的優(yōu)點(diǎn)使得該磁粒具有極強(qiáng)的 對外加磁場的響應(yīng)性和較大的對生物活性分子的固定容量，且整個(gè)檢測過程中 金磁微粒懸浮于液相中，其較大的比表面積使得在實(shí)驗(yàn)過程中可最大限度的檢 測到抗雙鏈DNA抗體。而傳統(tǒng)ELISA法的載體為聚苯乙烯板，反應(yīng)只在微孔表 面進(jìn)行，從而降低了該方法的檢測靈敏度。本發(fā)明方法的整個(gè)檢測過程在液相 中進(jìn)行，金磁微粒整個(gè)球面上的DNA抗原均參與反應(yīng)，因此與傳統(tǒng)方法相比， 本方法的靈敏度和特異性均有很大提高。3、 可量化且排除了人為的主觀判斷。根據(jù)酶標(biāo)儀的檢測結(jié)果及臨界值的比 較，依據(jù)具體數(shù)據(jù)判斷檢測結(jié)果的陰性或陽性而排除了現(xiàn)在國內(nèi)醫(yī)院常用的膠 體金免疫層析法、間接免疫熒光法、免疫印跡法等根據(jù)肉眼觀察試驗(yàn)結(jié)果的人 為主觀判斷。4、 酶免疫試劑的性質(zhì)比較穩(wěn)定。免疫熒光法(IFA)是將已稀釋血清與實(shí) 驗(yàn)基質(zhì)進(jìn)行溫育，令特異性抗體與實(shí)驗(yàn)基質(zhì)中相應(yīng)抗原結(jié)合，然后再與熒光標(biāo) 記的第二抗體溫育，最后在熒光顯微鏡下觀察相應(yīng)部位的特異性熒光模式。其 中實(shí)驗(yàn)基質(zhì)現(xiàn)在較常用的是H印-2細(xì)胞，無法長期保存。放射免疫法(RIA)是 以同位素標(biāo)記的雙鏈DNA與檢測樣品中的抗雙鏈DNA抗體結(jié)合，因同位素的具 半衰期，所以該試劑無法長期保存。5、 對被檢測樣品的影響小。本發(fā)明方法所用的各種緩沖液的pH值接近中 性，與傳統(tǒng)的ELISA檢測方法所用的堿性緩沖液相比，對被測樣品的影響減小。


圖1是金磁微粒吸附DNA前后溶液的對比UV圖；其中虛線表示包被前DNA 紫外測定結(jié)果，實(shí)線表示包被后DNA紫外測定結(jié)果。圖2是金磁微粒為載體運(yùn)用間接ELISA法檢測含有抗雙鏈DNA抗體的血液 樣品與陰性對照和空白0D值的比較。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、在金磁微粒表面包被雙鏈DNA檢測抗雙鏈DNA抗體 l]雙鏈DNA固定在金磁微粒表面及金磁微粒的封閉和保存取lmg的金磁 微粒于2mL離心管中，磁性分離，棄上清。用偶聯(lián)緩沖液(20%的PEG 8000和 2. 5 M的氯化鈉的混合溶液)洗滌金磁微粒直至金磁微粒的保存環(huán)境達(dá)到偶聯(lián)緩 沖液的pH或鹽濃度，每次偶聯(lián)緩沖液洗漆用量為400 "L。磁性分離棄上清后 加入14 u g的雙鏈DNA及200 u L上述偶聯(lián)緩沖液于金磁微粒中，37°C, 180rpm 反應(yīng)30min。磁性分離棄上清后，加入lmL的封閉劑(0. 01M的pH=7. 4的PBS 緩沖液和10%的小牛血清的混合溶液)于離心管中，37-C，180rpm反應(yīng)lh，取出， 4'C過夜后用lmL的清洗緩沖液(0. 01M的pH=7. 4的PBS緩沖液、0. 05%的吐溫-20的混合溶液)清洗封閉的金磁微粒。清洗完畢后，加入lmL的保存緩沖液 (0.01M的p^7.4的PBS緩沖液)保存包被完畢的金磁微粒，4"C保存，備用。2]抗雙鏈DNA抗體的檢測:分別取30 ii L已包被的金磁微粒放入試管孔，搖 勻；分別取50uL的待檢樣品放入待檢樣品試管孔，搖勻；在陽性對照試管孔 中加入50uL陽性對照血清，搖勻；在陰性對照試管孔中加入50uL陰性對照 血清，搖勻；空白孔暫不加任何液體；37°C， 180rpm反應(yīng)30min后取出，磁性 分離2min，棄上清后，每支試管中各加入500uL 0.01M PBST,充分搖勻，磁性 分離2min，棄上清。重復(fù)此步驟4遍后，分別在陽性對照試管孔、陰性對照試 管孔和待檢樣品試管孔中各加入50uL酶標(biāo)的抗人IgG; 37°C，180rpm反應(yīng) 30min后取出，磁性分離2min，棄上清，在每支試管孔中各加入500y L 0. 01M PBST，充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟4遍直至不參與抗體反 應(yīng)的抗人IgG都洗掉；每支試管孔中各加入50 u L顯色液A和50 u L顯色液B， 輕搖混勻后置生化培養(yǎng)箱中37"C顯色5min，每試管孔各加2M H2S(^ 100 u L，輕 搖混勻，磁性分離2分鐘后，從試管中各取100uL上清液轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)條中，在 酶標(biāo)儀上采用雙波段(450nm、 630nm)測定各管OD值。檢測完畢后，運(yùn)用洗脫 緩沖液(1X的pH-7.2的TE緩沖液)洗脫包被在金磁微粒表面的DNA，并在金 磁微粒加入保存緩沖液(0.01M的pH二7.4的PBS緩沖液)中保存。由圖1可看出，應(yīng)用金磁微粒在適當(dāng)?shù)娜芤后w系中可以從全血、唾液、精 液、組織等樣品中純化DNA并且吸附在金磁微粒表面作為包被抗原使用時(shí)，金 磁微粒吸附DNA前后溶液的存在很明顯的對比UV圖，說明金磁微粒可以從全血、 唾液、精液、組織等樣品中大量的純化DNA。由圖2可看出，應(yīng)用本發(fā)明測定的 陽性血樣與陰性血樣及空白的檢測結(jié)果之間存在明顯的差別。金磁微粒表面包被的經(jīng)純化的天然雙鏈DNA或質(zhì)粒DNA抗原為自行制備或 購自商品化的產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)過程中所用二抗為商品化產(chǎn)品。本發(fā)明原理1.抗雙鏈DNA抗體是一種能夠與天然DNA結(jié)合的自身抗體，幾乎僅在SLE 患者中可檢測到該抗體(Ruffatti A， Calligaro A， Ross D et al. Anti-double stranded DNA antibodies in the healthy elderly: prevalence and characteristics. J Clin Immunol. 1990; 10:300—303; Kadlubowski M， Jackson M, Yap PL and Neil G. Lack of specificity for antibodies to double stranded DNA found in four commercial kits. J Clin Path. 1991; 44: 248-250)。 抗雙鏈DNA抗體滴度的消長與SLE患者的病情變化相關(guān)(BorgEJ, Horst G, Hum EJ et al. Measurement of increases in anti-double stranded DNA antibody level as a predictor of disease exacerbation in systemic lupus erythematosus: a long term, prospective study. Arth Rhe亂 1990; 33:634-643)，本發(fā)明所述的以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈DNA抗體的方法，是 在金磁微粒表面包被上天然雙鏈DNA或質(zhì)粒DNA抗原后應(yīng)用ELISA方法、化學(xué) 發(fā)光法或免疫熒光法檢測待測血清，或者運(yùn)用金磁微粒從人全血、唾液、精液 或質(zhì)粒中提取DNA，然后在體系中加入被檢血清直接檢測。中國發(fā)明專利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分別對組裝型磁性復(fù)合微 粒和核/殼結(jié)構(gòu)的Fe304/Au超順磁性復(fù)合微粒進(jìn)行了公開。以下把這兩種磁性微 粒稱為金磁微粒。金磁微粒由具有超順磁性的核心部分和外層部分構(gòu)成，核心 部分由Fe304、 Y_Fe203、 Fe、 Co、 Ni或Fe與其它金屬元素形成具有超順磁性 的正鐵酸鹽磁性微粒構(gòu)成，外殼部分由納米級貴金屬顆粒或單質(zhì)金、銀殼層構(gòu) 成，平均直徑為0.05 100 um。由于金、銀等金屬單質(zhì)可以高效吸附蛋白、核 酸等物質(zhì)的性質(zhì)，故可把天然雙鏈DNA或質(zhì)粒DNA包被在金磁微粒表面且運(yùn)用 金磁微?？蓮难?、精液、唾液、微生物及動(dòng)物組織等中高效提取雙鏈DNA。此 時(shí)DNA包被在金磁微粒表面可作為間接ELISA法、免疫熒光法或化學(xué)發(fā)光法檢 測抗雙鏈DNA抗體的抗原。2、 加入待檢血液樣品，通過37。C溫育，若樣品中含有抗雙鏈DNA抗體(一 抗)，抗原抗體之間可發(fā)生特異性結(jié)合，血液樣品中的抗體通過抗原也連接在了 金磁微粒表面，而未發(fā)生抗原抗體特異性反應(yīng)的其他蛋白和雜質(zhì)可通過洗滌過 程去除。3、 加入酶(HRP)標(biāo)記或熒光標(biāo)記的抗人IgG (二抗)，通過37。C溫育，一 抗和二抗發(fā)生特異性結(jié)合從而使二抗也連接在了金磁微粒表面，通過洗滌過程 去除未參與反應(yīng)的二抗。4、 加入顯色液或發(fā)光物質(zhì)后，HRP催化顯色液中的過氧化物(本實(shí)驗(yàn)所用 的過氧化物為四甲基聯(lián)苯胺)或發(fā)光物質(zhì)催化HRP發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生有色的產(chǎn)物， 在450nm處測間接ELISA法中的最高吸收峰或在化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測化學(xué)發(fā) 光法中的信號值。所測的OD值或信號值越大，表明金磁微粒上連有的HRP標(biāo)記 的二抗越多，從而表明了血液樣品中含有的一抗越多，也就表明了患者病情越 嚴(yán)重。免疫熒光法中在顯微鏡下觀察判定結(jié)果。5、選用純化的天然雙鏈DNA或者質(zhì)粒DNA的原則目前認(rèn)為雙鏈DNA的包被和與抗ds-DNA抗體的結(jié)合與雙鏈DNA的空間構(gòu)象發(fā)生重排有關(guān)，尤其與雙鏈 DNA分子的完整與否關(guān)系很大，再者雙鏈DM分子量越大結(jié)合力越強(qiáng)。有報(bào)道大 于60pb的DNA才能與DNA抗體牢固結(jié)合，而與種屬來源無關(guān)。金磁微粒是指以磁性納米粒子或磁性納米粒子的聚集體為核，在核表面包 覆單質(zhì)金、銀等貴金屬殼層形成的磁性復(fù)合微粒，也指以磁性納米粒子或磁性 納米粒子的聚集體為核，在核表面組裝納米金、銀等貴金屬粒子形成的磁性復(fù) 合微粒。所述磁性納米粒子包括Fe:A、 Y- FeA等鐵的氧化物粒子，單質(zhì)Fe、 Co、 Ni粒子，或由Fe與其它金屬元素形成的正鐵酸鹽粒子；磁性納米粒子的聚 集體是指經(jīng)修飾后形成的Fe:,O,、 Y- Fe必,等鐵的氧化物粒子聚集體，經(jīng)修飾后 形成的單質(zhì)Fe、 Co、 Ni粒子聚集體，或經(jīng)修飾后形成的Fe與其它金屬元素形 成的正鐵酸鹽粒子聚集體。
權(quán)利要求
1、一種以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈DNA抗體的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟1]DNA在金磁微粒表面的固定取金磁微粒加入離心管中，磁性分離棄上清后，用偶聯(lián)緩沖液洗滌金磁微粒，磁性分離棄上清后加入純化的天然雙鏈DNA或者質(zhì)粒DNA及偶聯(lián)緩沖液于金磁微粒中，在20～40℃條件下充分反應(yīng)20～40min，形成金磁微粒-DNA復(fù)合物；或者將全血、唾液、精液或質(zhì)粒制成溶液體系，用金磁微粒從中提取DNA并使其固定在金磁微粒表面；2]金磁微粒的封閉將金磁微粒磁性分離棄上清后，加入封閉劑于離心管中，在20～40℃條件下充分反應(yīng)1～2h，取出，4℃過夜；3]金磁微粒的清洗用清洗緩沖液清洗封閉后的金磁微粒；4]金磁微粒的保存將清洗完畢的金磁微粒加入保存緩沖液，4℃保存，備用；5]抗雙鏈DNA抗體的檢測以清洗后的金磁微粒表面的DNA為抗原，運(yùn)用間接ELISA法、免疫熒光法或化學(xué)發(fā)光法檢測抗雙鏈DNA抗體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈DNA抗體的方 法，其特征在于所述加入的金磁微粒質(zhì)量為0. 5 5mg;所述加入的DNA質(zhì)量 為5 25 p g。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈DNA抗體 的方法，其特征在于所述偶聯(lián)緩沖液為0.5X 10X的pH二5.0 8.0的PBS， 或者5raM 10M的pH二9. 0 11.0的CBS，或者5mM 10M的pH=7. 0 9. 0的 Tris-HC1緩沖液，或者5mM 10M的p^3.6 5.6的醋酸鹽緩沖液，或者5mM 10M的pH二3. 0 7. 0的檸檬酸鹽緩沖液，或者5mM 10M的pH=7. 0 9. 0的TBS 緩沖液，或者為10 25之間的聚乙二醇(PEG) 6000 10000加入0. 5 5.0M的 鹽，所述鹽可以是氯化鈉、氯化鋰、氯化鋇、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化 銫等；所述封閉劑為無關(guān)蛋白和上述偶聯(lián)緩沖液的混合溶液，所述無關(guān)蛋白為 1% 10%的牛血清白蛋白、1% 10%賴氨酸、1% 10%脫脂奶粉、1% 10%乙醇胺 或1% 10%動(dòng)物血清中的一種或多種；所述清洗緩沖液為偶聯(lián)緩沖液或者含有0. 02% 0. 2%吐溫的偶聯(lián)緩沖液；所述保存緩沖液為偶聯(lián)緩沖液或者加入防腐劑 和保護(hù)劑的偶聯(lián)緩沖液，所述防腐劑為0. 01% 0. 1%的疊氮納或者0. 01% 0. 1% 的硫柳汞，所述保護(hù)劑為0.059& iy。的BSA、 0.05% 1%的動(dòng)物血清或者0.05% 1%的蛋白酶抑制劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈DNA抗體的方 法，其特征在于所述偶聯(lián)緩沖液為10%的PEG 8000和2. 5 M的氯化鈉的混合 溶液；所述封閉劑為0. 1M的pH=7. 0的PBS緩沖液、2%的BSA、 5%的小牛血清的 混合溶液；所述清洗緩沖液為0. 1M的pH二7. 0的PBS緩沖液、0. 5%的吐溫-20的 混合溶液；所述保存緩沖液為0. 1M的pH二7. 0的PBS緩沖液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈DNA抗體的方 法，其特征在于所述抗雙鏈DNA抗體的檢測包括以下步驟l]編號將試管置于磁性分離器上，分別設(shè)待檢樣品試管孔2孔，陽性對 照試管孔2孔，陰性對照試管孔3孔，空白對照l孔；2]加抗原每孔各加入30u L的已固定DNA的金磁微粒；3]加樣分別在待檢樣品試管孔中加入待測樣品50uL，陽性對照孔、陰性 對照孔各加入陰、陽對照50 100uL搖勻；4]溫育覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;5]洗滌磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 " L 0. 01M PBST， 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗原抗體反應(yīng)的物 質(zhì)都洗掉；6]加酶分別在陽性對照試管孔、陰性對照試管孔和待檢樣品試管孔中各 加入50 100 u L酶標(biāo)的抗人IgG;7]抗體反應(yīng)覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;8]洗滌磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗體反應(yīng)的抗人IgG 都洗掉；9]顯色反應(yīng)每個(gè)試管孔各加顯色液A、 B各50 100uL，輕搖混勻后置生 化培養(yǎng)箱中顯色5 15min;IO]結(jié)果判定每個(gè)試管孔各加終止液100 200uL,輕搖混勻，磁性分離 2分鐘后，從每個(gè)試管孔中各取100uL上清液轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)條中，在酶標(biāo)儀上采 用450nm和630nm雙波段測定各試管孔OD值。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈DNA抗體的方 法，其特征在于所述抗雙鏈DNA抗體的檢測包括以下步驟l]編號將試管置于磁性分離器上，分別設(shè)待檢樣品試管孔2 L，陽性對照試管孔2孔，陰性對照試管孔3孔，空白對照l孔；2]加抗原每孔各加入30y L的已固定DNA的金磁微粒；3]加樣分別在待檢樣品試管孔中加入待測樣品50uL，陽性對照孔、陰性 對照孔各加入陰、陽對照50 100yL搖勻；4]溫育覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;5]洗滌磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗原抗體反應(yīng)的物 質(zhì)都洗掉；6]加熒光標(biāo)記的抗人IgG:分別在陽性對照試管孔、陰性對照試管孔和待檢 樣品試管孔中各加入50 100u L FITC標(biāo)記的抗人IgG;7]抗體反應(yīng)覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;8]洗滌磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 U L 0. 01M PBST, 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗體反應(yīng)的抗人IgG 都洗掉；9]結(jié)果判定將獲得的特異免疫熒光復(fù)合物置于顯微鏡下觀察判定結(jié)果。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以金磁微粒為載體檢測抗雙鏈DNA抗體的方 法，其特征在于所述抗雙鏈DNA抗體的檢測包括以下步驟l]編號將試管置于磁性分離器上，分別設(shè)待檢樣品試管孔2孔，陽性對 照試管孔2孔，陰性對照試管孔3孔，空白對照l孔；2]加抗原每孔各加入30u L的已固定DNA的金磁微粒； 3]加樣分別在待檢樣品試管孔中加入待測樣品50ixL、陽性對照孔、陰性 對照孔各加入陰、陽對照50 100uL搖勻；4]溫育覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min; 5]洗滌磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗原抗體反應(yīng)的物 質(zhì)都洗掉；6]加酶分別在陽性對照試管孔、陰性對照試管孔和待檢樣品試管孔中各 加入50 100uL HRP標(biāo)記的抗人IgG;7]抗體反應(yīng)覆蓋所有的試管孔，放入生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)至少15min;8]洗滌磁性分離2min，棄上清，在每支試管中各加入500 u L 0. 01M PBST， 充分搖勻，磁性分離2min，棄上清；重復(fù)此步驟直至不參與抗體反應(yīng)的抗人IgG 都洗掉；9]顯色反應(yīng)將金磁微粒從試管內(nèi)轉(zhuǎn)入酶標(biāo)孔中，每個(gè)酶標(biāo)孔各加入發(fā)光 物質(zhì)100 200uL;10]結(jié)果判定將酶標(biāo)孔置于化學(xué)發(fā)光檢測儀中測樣品、陽性對照、陰性對 照及空白孔的信號值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以金磁微粒為載體，運(yùn)用間接ELISA法、免疫熒光法或化學(xué)發(fā)光法檢測抗雙鏈DNA抗體的方法。本方法包括以下步驟(1)將金磁微粒與雙鏈DNA相混合，在一定條件下雙鏈DNA固定在金磁微粒表面或運(yùn)用金磁微粒從人全血、唾液、精液或質(zhì)粒中提取DNA并固定在金磁微粒表面；其中金磁微粒由具有超順磁性的核心部分和組裝層部分構(gòu)成，核心部分為磁性微粒，組裝層部分為納米級貴金屬顆粒；(2)運(yùn)用間接ELISA法、免疫熒光法或化學(xué)發(fā)光法檢測待測樣品中存在的抗雙鏈DNA抗體。本發(fā)明檢測方法具有高度特異性、靈敏度高、費(fèi)用低廉、操作簡便快速、以及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N33/551GK101165491SQ200610104758
公開日2008年4月23日 申請日期2006年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月19日
發(fā)明者崔亞麗, 芳 李, 超 陳 申請人:陜西西大北美基因股份有限公司