專利名稱：：一種新的復(fù)方頭孢曲松鈉舒巴坦鈉的檢測(cè)方法一種新的復(fù)方頭孢曲松鈉舒巴坦鈉的檢測(cè)方法
背景技術(shù)：
：頭孢曲松鈉(CeftriaxoneSodium)是1978年研制成功的第三代半合成頭孢菌素類抗生素，已經(jīng)被英、美、德、日以及我國(guó)藥典收載。其抗菌譜與青霉素鈉和頭孢噻吩銨鈉相似。對(duì)腸桿菌科細(xì)菌有強(qiáng)大的活性，對(duì)流感桿菌、淋球菌和腦膜炎球菌的抗菌活性在第三代頭孢菌素中最強(qiáng)。該產(chǎn)品上市多年，在全世界多個(gè)國(guó)家與地區(qū)使用，受到廣泛好評(píng)，至今仍是臨床一線用藥。由于大量和廣泛的臨床應(yīng)用，甚至近年來(lái)濫用的出現(xiàn)，臨床上產(chǎn)生了耐頭孢曲松的耐藥菌。這類耐藥菌大多數(shù)是通過(guò)產(chǎn)e-內(nèi)酰胺酶降解頭孢曲松起作用的，這樣降低了頭孢曲松鈉的抗菌活性。針對(duì)這種情況開(kāi)發(fā)的3-內(nèi)酰胺酶抑制劑與抗生素合用后可有效抑制細(xì)菌的耐藥性，恢復(fù)抗生素的活性，因此，采用"抗生素+e-內(nèi)酰胺酶抑制劑"的復(fù)方組合能有效地抑制產(chǎn)酶菌的耐藥問(wèn)題。由這種思路開(kāi)發(fā)的復(fù)方制劑如"阿莫西林克拉維酸"、"頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉"、"哌拉西林鈉舒巴坦鈉"等在臨床上獲得了很大的成功。另外湘北威爾曼制藥有限公司生產(chǎn)的注射用頭孢曲松鈉與注射用舒巴坦鈉的組合包裝在臨床上已應(yīng)用多年，其作用早已得到臨床醫(yī)師的廣泛認(rèn)可。但從制劑的角度來(lái)看，因?yàn)轭^孢曲松鈉含有一定水分，而舒巴坦鈉遇水降解，不穩(wěn)定，如果簡(jiǎn)單的將兩者混合到一起，則無(wú)法解決產(chǎn)品的穩(wěn)定性問(wèn)題，須在制劑工藝上解決產(chǎn)品的穩(wěn)定性問(wèn)題。同時(shí)由于之前沒(méi)有復(fù)方制劑，均是單一成分做檢測(cè)，兩者混合后的復(fù)方檢驗(yàn)需要建立新的檢測(cè)方法，這樣的檢測(cè)方法能夠檢測(cè)出復(fù)方中單一成分的含量和有關(guān)雜質(zhì)，同時(shí)，這一檢測(cè)方法對(duì)單一成分的測(cè)定還不能受到另一成分的影響，而且能夠達(dá)到專屬靈敏、簡(jiǎn)便操作等要求，并能夠在制劑工廠以及各地檢測(cè)機(jī)構(gòu)或醫(yī)院對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行檢查，針對(duì)這樣的要求我們建立了一個(gè)新的檢測(cè)復(fù)方頭孢曲松鈉舒巴坦鈉的方法。
發(fā)明內(nèi)容我們采用在工廠、藥品檢驗(yàn)所、醫(yī)院等常見(jiàn)的高效液相色譜法(HPLC)通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等指標(biāo)，建立了一種新的檢測(cè)方法。這種方法可以檢測(cè)復(fù)方頭孢曲松鈉舒巴坦鈉中兩種單一成分的含量和有關(guān)物質(zhì)，而不會(huì)出現(xiàn)兩種成分相互影響與干擾，該方法簡(jiǎn)便易行、操作步驟少，方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、線性范圍大、重復(fù)性好等，可用于復(fù)方制劑和原料的常規(guī)檢測(cè)。專利實(shí)例實(shí)施例一、復(fù)方原料與制劑的初步檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用"注射用頭孢曲松鈉舒巴坦鈉"，比例為2:1，規(guī)格為2.0g，因其他配比和規(guī)格在制劑上簡(jiǎn)單的裝量變化，其原料來(lái)源、制備工藝均無(wú)顯著差異。故用該配比、規(guī)格樣品進(jìn)行研究。試驗(yàn)樣品為白色或類白色粉末，進(jìn)行以下各種試驗(yàn)。1、鑒別試驗(yàn)兩種組分舒巴坦和頭孢曲松均以鈉鹽形式存在，灼燒時(shí)應(yīng)呈現(xiàn)鈉鹽的火焰反應(yīng)。取鉑絲，用鹽酸濕潤(rùn)后，蘸取本品，在無(wú)色的火焰中燃燒，火焰即顯鮮黃色。兩種組分舒巴坦鈉和頭孢曲松鈉極性不同，可通過(guò)HPLC法進(jìn)行分離，并用對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照鑒別。取本品和舒巴坦和頭孢曲松的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用流動(dòng)相制成每lml含0.3rag頭孢曲松鈉和0.15mg舒巴坦鈉的溶液，按照本專利以下描述的含量測(cè)定項(xiàng)下高效液相色譜法試驗(yàn)，結(jié)果供試品峰與對(duì)照品峰一致(試驗(yàn)方法見(jiàn)實(shí)施例二、三)。2、檢測(cè)試驗(yàn)試驗(yàn)樣品酸度檢査取試驗(yàn)樣品加注射用水制成每ml含lOOmg的溶液，用酸度計(jì)測(cè)定，結(jié)果試驗(yàn)樣品的pH在5.5—7.5之間，為合格產(chǎn)品。試驗(yàn)樣品溶液澄清度檢查取試驗(yàn)樣品5瓶，分別加水制成每lml中約含本品O.lg的溶液，與1號(hào)濁度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比較，檢査澄清度。結(jié)果試驗(yàn)樣品為澄明液體，未超過(guò)l號(hào)濁度標(biāo)準(zhǔn)液，澄清度符合相關(guān)規(guī)定，為合格樣品。試驗(yàn)樣品溶液顏色檢查取試驗(yàn)樣品5瓶，加水溶解，置于25ml的納氏比色管中，加水稀釋至10ml，與黃色色調(diào)標(biāo)準(zhǔn)比色液比較。結(jié)果試驗(yàn)樣品為澄明液體，顏色不深于黃色、黃綠色或橙黃色的9號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比色液，符合相關(guān)規(guī)定，為合格樣品。試驗(yàn)樣品澄明度檢查取試驗(yàn)樣品五瓶，分別加水制成每ml中含100mg的溶液，置光照度為10001500Lx的澄明度檢查儀上檢査，不合格率均小于5%。符合澄明度檢查細(xì)則和判斷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，為合格樣品。試驗(yàn)樣品水分檢查取試驗(yàn)樣品lg，按水分檢測(cè)法測(cè)定，結(jié)果試驗(yàn)樣品水分含量均在6%左右符合標(biāo)準(zhǔn)，為合格樣品。由于該制劑是由無(wú)菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全一樣，沒(méi)有差別。采用本專利的檢測(cè)方法對(duì)復(fù)方的原料進(jìn)行的檢測(cè)，得到與制劑相同的結(jié)果。實(shí)施例二、制劑的分析和質(zhì)量控制方法為控制產(chǎn)品的質(zhì)量，必須對(duì)產(chǎn)品中的有可能出現(xiàn)的雜質(zhì)進(jìn)行分析研究。之前由于沒(méi)有將兩個(gè)物質(zhì)混合在一起使用的經(jīng)驗(yàn)，所以現(xiàn)有的資料也只有對(duì)單一頭孢曲松鈉(或舒巴坦鈉)中有關(guān)雜質(zhì)的檢驗(yàn)方法。這樣的檢驗(yàn)方法雖然是對(duì)單一物質(zhì)檢驗(yàn)有效，但是否能夠檢驗(yàn)混合物中的有關(guān)雜質(zhì)還不清楚。因?yàn)橹苽涑苫旌现苿┮院髢煞N主要成分是否會(huì)相互影響對(duì)方的檢測(cè)，兩種雜質(zhì)是否也會(huì)影響對(duì)方的檢測(cè)有很多不確定因素，需要進(jìn)行大量的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。所以，我們根據(jù)頭孢曲松鈉、舒巴坦鈉單一物質(zhì)檢測(cè)方法，建立了相應(yīng)的對(duì)復(fù)方物質(zhì)中雜質(zhì)的檢測(cè)方法。1、有關(guān)雜質(zhì)物質(zhì)檢測(cè)由于HPLC方法已經(jīng)能夠很好地用于單一的兩種成分檢測(cè)，因此我們采用HPLC方法建立復(fù)方的雜質(zhì)檢測(cè)方法。舒巴坦的堿性降解產(chǎn)物與頭孢曲松光降解產(chǎn)物混合溶液的制備稱取舒巴坦對(duì)照品3mg，加0.Olmol/L氫氧化鈉溶液10ml，溶解后，室溫放置30分鐘，用lmol/L的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，量取5ml，置25ml的量瓶中，加乙腈4.25ml，用0.005mol/L四丁基氫氧化銨溶液(Ph4.0)稀釋至刻度，量取5ml，置25ml量瓶中，加入經(jīng)紫外光照射24小時(shí)的頭孢曲松鈉15mg，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻備用。取上述溶液在下述色譜條件下測(cè)試，檢測(cè)舒巴坦鈉、頭孢曲松鈉是否有明顯降解，以降解產(chǎn)物峰與主峰分離〉2.0，頭孢曲松鈉降解產(chǎn)物與舒巴坦鈉主峰分離度〉1.5為合格標(biāo)準(zhǔn)的判斷指標(biāo)。我們首先采用如下的色譜條件進(jìn)行篩選最佳的檢測(cè)方法5色譜條件(1):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱UltimateXB-NH2正相分析柱；規(guī)格5ura，4.6*50mm;流動(dòng)相正己烷-氯仿溶液(2:1);檢測(cè)波長(zhǎng)220nro—260nm;流速0.13ml/min;進(jìn)樣量1030"1。色譜條件(2):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱DiamonsilTMC18250X4.6mm5咖；流動(dòng)相乙腈-O.005mol/L四丁基氫氧化銨溶液(取40%四丁基氫氧化銨溶液6.6ml，加水稀釋至1800ml，用lmol/L的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，再加水稀釋至2000ml，搖勻)(300-200:700-800);檢測(cè)波長(zhǎng)220nm—260nm;流速0.13ml/min;進(jìn)樣量1030ul。色譜條件(3):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱DiamonsilTMC18250X4.6ram5um;流動(dòng)相乙腈-磷酸二氫鉀溶液(0.015mol/L)(400-301:600-699)(用磷酸調(diào)pH值為4.0);檢測(cè)波長(zhǎng)220rai—260nm;流速0.13ml/min;進(jìn)樣量1030ul。色譜條件(4):試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱DiamonsilTMC18250X4.65um;流動(dòng)相乙腈-磷酸二氫鉀溶液(0.015mol/L)-乙醇(15%)(290-305:675-690:35-5)(用磷酸調(diào)pH值為4.0);檢測(cè)波長(zhǎng)220nm一260nm;流速0.13ml/min;進(jìn)樣量1030tU。采用上述方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，色譜條件(1)、(3)、(4)雖然也可以用于檢測(cè)但兩者的分離度都小于1.0，兩組分都分不開(kāi)，而色譜條件(2)的分離度較好，但還需優(yōu)化。經(jīng)過(guò)堿破壞和光照的樣品在色譜條件(2)試驗(yàn)條件下舒巴坦鈉、頭孢曲松鈉均無(wú)明顯降解，頭孢曲松鈉雜質(zhì)峰與舒巴坦鈉主峰分離度〉1.5。哪是不是方法學(xué)不夠靈敏沒(méi)檢測(cè)出雜質(zhì)？還是本身就沒(méi)有出現(xiàn)雜質(zhì)？對(duì)此，我們首先采用LC-MS對(duì)樣品進(jìn)行了檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)上述破壞試驗(yàn)的樣品，在LC-MC檢測(cè)條件下也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有新的雜質(zhì)的出現(xiàn)，說(shuō)明本檢驗(yàn)方法是可靠。更進(jìn)一步，我們提取頭孢曲松峰、舒巴坦峰在200nm400nm的二極管陣列光譜圖，進(jìn)行峰純度檢查，結(jié)果頭孢曲松峰、舒巴坦峰的純度角均小于他們的純度閾值，表明頭孢曲松峰、舒巴坦峰均為純色譜峰。根據(jù)頭孢曲松鈉和舒巴坦鈉的自身特性，頭孢曲松鈉具有光不穩(wěn)定性，舒巴坦鈉具有堿性容易中的不穩(wěn)定性，因此，采用光降解頭孢曲松鈉和堿破壞舒巴坦鈉獲得相應(yīng)的降解物，采用含量測(cè)定的色譜條件進(jìn)行分離，有關(guān)物質(zhì)均能與主組分分離，因此，該色譜條件對(duì)含量測(cè)定具有專屬性。我們以上述溶液作為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)我們建立的HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，最后確定了以下方法作為最佳鑒定方法試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱DiamonsilTMC18250X4.6mm5um;流動(dòng)相乙腈-0.005mol/L四丁基氫氧化銨溶液(取40%四丁基氫氧化銨溶液6.6ml，加水稀釋至1800ml，用lmol/L的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，再加水稀釋至2000ml，搖勻)(250:750);檢測(cè)波長(zhǎng)220ran;流速lml/min;進(jìn)樣量20ul。我們以上述檢驗(yàn)方法，對(duì)檢驗(yàn)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如下樣品溶液制備取頭孢曲松和舒巴坦對(duì)照品適量，加水溶解并稀釋成每lml約含頭孢曲松6ug和舒巴坦3ug的溶液作為對(duì)照溶液，取20ul注入液相色譜儀，計(jì)算數(shù)次進(jìn)樣結(jié)果，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差不得過(guò)3.0%;另取含量測(cè)定項(xiàng)下的溶液作為供試品溶液，同法測(cè)定，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的2倍。試驗(yàn)檢驗(yàn)了三批生產(chǎn)樣品有關(guān)物質(zhì)檢査結(jié)果均符合規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>該品種定為最大雜質(zhì)不得過(guò)1.0%，雜質(zhì)總量不得過(guò)4.0%。該三批樣品有關(guān)物質(zhì)合格。2、頭孢曲松鈉聚合物由于頭孢曲松鈉還有聚合物產(chǎn)生，如果聚合物含量高會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生，需要在產(chǎn)品中控制聚合物的含量，按照相關(guān)要求必須對(duì)聚合物進(jìn)行檢測(cè)。以往，只有在單方頭孢曲松鈉中進(jìn)行聚合物的檢測(cè)，還沒(méi)有關(guān)于復(fù)方頭孢曲松鈉舒巴坦鈉混合后中進(jìn)行聚合物測(cè)定的研究報(bào)告，是否單方測(cè)定的條件可以準(zhǔn)確反應(yīng)復(fù)方中的情況，或者說(shuō)，復(fù)方混合物是否會(huì)影響原來(lái)?xiàng)l件的檢測(cè)的準(zhǔn)確性，對(duì)此，我們也進(jìn)行了研究。我們首先進(jìn)行了頭孢曲松聚合物色譜條件與測(cè)定方法試驗(yàn)。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用葡聚糖凝膠G-10(40120um)為填充劑，玻璃柱內(nèi)徑為1.3~1.5cm，床體積為5060ml;流動(dòng)相A為磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉21.85g和磷酸二氫鈉5.38g，加水1000ml使溶解，混勻。調(diào)pH值為7.0)，流動(dòng)相B為O.OW的十二垸基硫酸鈉溶液；流速為分鐘lml;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。以流動(dòng)相A為流動(dòng)相，用lmg/ml藍(lán)色葡聚糖2000溶液進(jìn)樣200ul進(jìn)行測(cè)定，理論板數(shù)以藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算應(yīng)不低于700,拖尾因子應(yīng)在0.751.75之間。對(duì)照品溶液以流動(dòng)相B為流動(dòng)相，重復(fù)進(jìn)樣量200ul，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于5.0%。對(duì)照品溶液的制備取頭孢曲松對(duì)照品約25mg，精密稱定，置250ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。測(cè)定方法取本品約0.2g，精密稱定，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，立即取200ul注入色譜儀，以流動(dòng)相A為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖；另取對(duì)照品溶液200pl注入色譜儀，以流動(dòng)相B為流動(dòng)相，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算。舒巴坦鈉干擾性實(shí)驗(yàn)取舒巴坦鈉原料適量，精密稱定，加流動(dòng)相A溶解后，照頭孢曲松聚合物方法測(cè)定，結(jié)果表明舒巴坦鈉對(duì)本品頭孢曲松聚合物測(cè)定無(wú)干擾。檢出限取頭孢曲松對(duì)照品，依次稀釋成不同濃度，用上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，高聚物檢測(cè)限為6.704Xl(Tug。測(cè)定結(jié)果及限度取三批試制樣品，測(cè)定頭孢曲松聚合物，結(jié)果見(jiàn)表2。表2頭孢曲松聚合物檢查結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根據(jù)測(cè)試結(jié)果和注射用頭孢曲松鈉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，擬定本品頭孢曲松聚合物限度為以頭孢曲松計(jì)不得過(guò)1.0%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這樣的情況，我們對(duì)于上述方法采用了LC-MS驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用上述方法測(cè)定的結(jié)果和LC-MS方法測(cè)定的結(jié)果能夠很好的對(duì)應(yīng)，說(shuō)明復(fù)方藥物雖然是混合物，但是這樣的混合物并不影響原來(lái)測(cè)定聚合物方法的專屬性和靈敏度。實(shí)施例三、用于該復(fù)方制劑的新檢測(cè)方法的建立和制劑含量測(cè)定驗(yàn)證為控制產(chǎn)品的質(zhì)量，對(duì)復(fù)方制劑中兩個(gè)主要成分的含量控制是個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)于單一頭孢曲松鈉、舒巴坦鈉兩種含量檢測(cè)已經(jīng)有比較多的研究方法建立，中國(guó)藥典也有指定的方法。但是，在制備成混合物后，是否這樣的方法仍然能夠用于混合物中成分的檢測(cè)？或者說(shuō)，混合物中兩個(gè)物質(zhì)是否會(huì)相互影響對(duì)方的檢測(cè)？這樣的問(wèn)題尚無(wú)人進(jìn)行研究，其中還有很多不確定因素需要面對(duì)和解釋。對(duì)此，我們對(duì)于如何開(kāi)展復(fù)方制劑中兩種成分的含量進(jìn)行檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。由于HPLC方法已經(jīng)能夠很好地用于單一的兩種成分檢測(cè)，同時(shí)HPLC方法也是中國(guó)藥典推薦的方法，因此，我們采用HPLC方法建立復(fù)方的兩個(gè)成分含量的檢測(cè)方法。色譜條件選用試驗(yàn)采用Waters515泵，Waters2487紫外檢測(cè)器；色譜柱DiamonsilTMC18250X4.6mm5um;流動(dòng)相乙腈-0.005mol/L四丁基氫氧化銨溶液(取40%四丁基氫氧化銨溶液6.6ml，加水稀釋至1800ml，用lmol/L的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，再加水稀釋至2000ml，搖勻)(250:750);檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;流速lml/min;進(jìn)樣量20ul。流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化本品為復(fù)方制劑，流動(dòng)相的選擇主要考慮兩主峰的出峰時(shí)間，分離效果以及主峰與雜質(zhì)峰的分離情況，選用乙腈-磷酸二氫鉀溶液(O.015mol/L)-乙醇(15%)(用磷酸調(diào)pH值為4.0)時(shí)，兩組份的分離度太小，而且頭孢曲松鈉的保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不適于測(cè)定。適當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相組成。為避免頭孢曲松保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，采用乙腈-0.005mol/L四丁基氫氧化銨溶液(取40%四丁基氫氧化銨溶液6.6ml，加水稀釋至1800ml，用lmol/L的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，再加水稀釋至2000ml，搖勻)(250:750);作為本品的流動(dòng)相，該流動(dòng)相能夠使樣品中的兩個(gè)組分有效檢出，分離度均大于1.5，能獲得較佳的分離效果。pH對(duì)色譜峰形狀與分離度的影響按照0.005raol/ml四丁基氫氧化銨-乙腈(750:250)的比例，pH值增加到5.0時(shí)，頭孢曲松鈉出峰時(shí)間較長(zhǎng)，并且色譜峰拖尾嚴(yán)重。pH值低于4.0時(shí)，兩個(gè)主組分之間的分離度降低，因此，因而流動(dòng)相的最佳pH值為4.0。流動(dòng)相比例對(duì)色譜峰形狀與分離度的影響分別考察了不同流動(dòng)相比例條件下的流動(dòng)相對(duì)樣品的洗脫情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水相與有機(jī)相的比例變化，影響二組分的出峰時(shí)間，影響二組分的分離度，因此根據(jù)不同色譜柱的具體響應(yīng)，可以改變乙腈的比例，但應(yīng)考慮適當(dāng)?shù)某龇鍟r(shí)間及二組分的分離度。另外，流動(dòng)相的酸堿度對(duì)色譜峰的響應(yīng)有影響，pH增加，色譜響應(yīng)時(shí)間增大，頭孢曲松峰容易出現(xiàn)拖尾，對(duì)稱性不好，pH值偏低，色譜響應(yīng)時(shí)間較快，雖然二組分的峰對(duì)稱性較好，但二組分的分離度容易減小，因此，選用合適的pH值為4.0，采用水相與有機(jī)相(750:250)的比例，既能保證二組分一定的分離度，又能保證色譜峰的對(duì)稱性和合適的出峰時(shí)間。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇和優(yōu)化按照0.005mol/ml四丁基氫氧化銨-乙腈(750:250)的比例，在不同的波長(zhǎng)處測(cè)定色譜響應(yīng)，230nm和254nm舒巴坦峰的色譜響應(yīng)和頭孢曲松的色譜響應(yīng)懸殊較大，舒巴坦峰的色譜響應(yīng)較小。為不使舒巴坦的吸收度太小、并兼顧頭孢曲松與頭孢曲松反式異構(gòu)體的檢測(cè)，選擇220nm為含量測(cè)定與有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。在上述研究的基礎(chǔ)上，我們采用選定的色譜條件首先進(jìn)行了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，在上述色譜條件下，溶劑峰保留時(shí)間約3min，不干擾主成分測(cè)定。用十八垸基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.005mol/L四丁基氫氧化銨溶液(取40%四丁基氫氧化銨溶液6.6ml，加水稀釋至1800ml，用lmol/L的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，再加水稀釋至2000ml，搖勻)(250:750)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。取降解產(chǎn)物的混合溶液20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖，頭孢曲松反式異構(gòu)體峰、頭孢曲松峰、舒巴坦的堿性降解產(chǎn)物和舒巴坦峰之間的分離度應(yīng)符合規(guī)定，理論板數(shù)按舒巴坦峰計(jì)算，應(yīng)不低于3500，拖尾因子應(yīng)不大于1.5。我們進(jìn)一步對(duì)檢測(cè)方法的線性范圍進(jìn)行了研究采用頭孢曲松鈉和舒巴坦鈉的對(duì)照品在一定的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算進(jìn)樣量和峰面積的線性，結(jié)果如下表3和表4及圖1-12:表3頭孢曲松的線性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>求得線性方程Y=A+BxA=-399111.1236B=2329514.057r=0.9999表4舒巴坦的線性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>求得線性方程Y=A+BxA=-43500.6B=353924.6r=0.9999從上述線性關(guān)系可以看出，在含量測(cè)定的一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，能夠滿足含量測(cè)定的要求。范圍通過(guò)對(duì)頭孢曲松和舒巴坦的線性的測(cè)定可以看出在含量測(cè)試的80%120%的范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與色譜響應(yīng)的峰面積的線性關(guān)系良好，能夠準(zhǔn)確地測(cè)定含量。再進(jìn)一步，我們對(duì)這個(gè)檢測(cè)方法的精密度進(jìn)行了試驗(yàn)，精密度的測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣的方法進(jìn)行，比較峰面積的變化情況，結(jié)果如下表5:表5精密度試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>我們對(duì)這個(gè)方法的準(zhǔn)確度也進(jìn)行了研究，該復(fù)方制劑為原料直接分裝，未添加輔料，故準(zhǔn)確度以對(duì)照品的不同濃度測(cè)定回收率，結(jié)果如表6及圖13-21:表6回收率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>頭孢曲松的平均回收率為99.4%，RSD=0.68%舒巴坦的平均回收率為99.6%，RSD=0.69%從回收率結(jié)果來(lái)看，該方法的準(zhǔn)確度較好，能夠保證含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。從上面的試驗(yàn)結(jié)果表明，我們建立的這個(gè)含量測(cè)定方法，具有靈敏度、穩(wěn)定性好,重復(fù)性高。是個(gè)理想的用于檢驗(yàn)復(fù)方藥物兩個(gè)成分的方法。由于該制劑是由無(wú)菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全一樣，沒(méi)有差別。采用本專利的檢測(cè)方法對(duì)原料進(jìn)行的檢測(cè)，得到與制劑相同的結(jié)果。實(shí)施例四、采用新的檢測(cè)方法對(duì)復(fù)方頭孢曲松鈉舒巴坦鈉樣品進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)一步，我們采用這個(gè)新的檢驗(yàn)方法對(duì)三批GMP條件下生產(chǎn)的試驗(yàn)樣品含量測(cè)定。按照前述含量測(cè)定方法進(jìn)行，取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每ml含頭孢曲松鈉0.5mg和含舒巴坦鈉0.25mg的溶液，精密量取10^1，注入色譜儀；另取頭孢曲松鈉和舒巴坦鈉對(duì)照品適量，同法稀釋并測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算供試品中舒巴坦鈉和頭孢曲松鈉的含量。i-一旦(vA樣xW對(duì)x對(duì)％xW裝,nno/A對(duì)x樣xW樣x標(biāo)不量說(shuō)明W對(duì)對(duì)照品的稱樣量，W樣樣品的稱樣量，W裝樣品的平均裝量，A標(biāo)對(duì)照品的峰面積，A樣樣品的峰面積，對(duì)％:對(duì)照品的純度，標(biāo)示量樣品的標(biāo)示量按照上述色譜條件，對(duì)三批樣品的含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)下表7及附圖22-27。表7含量測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由于該制劑是由無(wú)菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全-樣，沒(méi)有差別，采用本專利的檢測(cè)方法對(duì)原料進(jìn)行的檢測(cè)，得到與制劑相同的結(jié)果<實(shí)施例五、新檢測(cè)方法對(duì)不同配比的復(fù)方原料與制劑的檢測(cè)采用上述實(shí)例建立的檢測(cè)方法，我們對(duì)不同配比的頭孢曲松鈉舒巴坦鈉的復(fù)方制劑進(jìn)行了檢測(cè)，以觀察這樣的方法是否可以用于不同的配比的復(fù)方制劑的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于頭孢曲松鈉/舒巴坦鈉20:1，10:1，8:1，6:1，4:1，5:1，3:1，2:1，1:1,1:2，1:4，1:5，1:6，1:8,1:10，1:20等17個(gè)不同配比的樣品的檢測(cè)，本專利建立的新方法均能很好的對(duì)兩個(gè)組成成分進(jìn)行測(cè)定，該方法有很好的靈敏度和可靠性。由于該制劑是由無(wú)菌原料直接分裝的，所以，原料與制劑的成分、含量上完全一樣，沒(méi)有差別。采用本專利的檢測(cè)方法對(duì)復(fù)方的原料進(jìn)行的檢測(cè)，得到與制劑相同的結(jié)果。實(shí)施例六、采用該種檢驗(yàn)方法評(píng)判為合格制劑的進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果根據(jù)GMP規(guī)范進(jìn)行三批樣品制備，按照本專利實(shí)例一、二、三的方法對(duì)三批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，采用上述標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格的制劑樣品進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，檢查通過(guò)上述新檢測(cè)方法檢驗(yàn)合格的樣品是否能夠符合動(dòng)物試驗(yàn)的要求。試驗(yàn)樣品首先進(jìn)行無(wú)菌檢査。在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌操作，取三批試驗(yàn)樣品各6支，分別加入100ml0.9y。無(wú)菌氯化鈉溶液使溶解，搖勻，打開(kāi)濾器蓋，在火焰旁打開(kāi)樣品供試液的塞子使瓶口通過(guò)火焰，立即倒入濾器中，并閉濾器蓋，打開(kāi)排液架的閥門，啟動(dòng)真空泵進(jìn)行減壓抽濾，待干后，用滅菌生理鹽水照上述操作沖洗濾膜3次，每次100ml。打開(kāi)抽氣瓶排氣管，將過(guò)濾器取下，用滅菌鑷子將濾膜取出放入滅菌雙碟中。用滅菌剪刀將濾膜平均分成3份，分別置于各含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中一份做陽(yáng)性對(duì)照。按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。結(jié)果無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，無(wú)菌試驗(yàn)符合規(guī)定，為合格產(chǎn)口試驗(yàn)樣品進(jìn)行異常毒性檢查取三批試驗(yàn)樣品，加氯化鈉注射液制成每lral中含0.15g的溶液，取15只小鼠分成三組，每組5只尾靜脈注射同一批號(hào)的溶液0.5ml，觀察48小時(shí)的內(nèi)無(wú)異常反應(yīng)也無(wú)死亡，結(jié)果為合格產(chǎn)品。試驗(yàn)樣品進(jìn)行熱原檢查取三批試驗(yàn)樣品，加滅菌注射用水制成每lml中含0.15g的溶液，取9只家兔分成3組，每組3只，測(cè)定其正常體溫后15分鐘內(nèi)，劑量按家免體重每lkg注射lml，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫?zé)嶂?8t:的供試品溶液，然后每隔30分鐘測(cè)量其體溫1次，共測(cè)6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度。各兔體溫升髙均低于0.6'C，而且每組家兔體溫升高總和低于1.4'C，因此三批樣品可判斷為熱源檢査符合規(guī)定，三批樣品為合格產(chǎn)品。結(jié)果見(jiàn)表8<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1、一種新的用于頭孢曲松鈉與舒巴坦鈉復(fù)方原料和制劑的檢測(cè)方法。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法采用高效液相色譜法，所采用的流動(dòng)相可以是正已垸，氯仿，二氯甲烷，四丁基氫氧化胺、乙腈、磷酸二氫鉀、甲醇、水等，其中優(yōu)選的采用四丁基氫氧化胺和乙腈。3、根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法，其特征在于該方法所采用的檢測(cè)波長(zhǎng)可以是210260nm，優(yōu)選的波長(zhǎng)采用220nm。4、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3所述的方法，其特征在于該方法所采用的流動(dòng)相流速可以是0.1~3.Oml/min，優(yōu)選地流速采用1.Oml/min;5、根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述的方法，其特征在于該方法所采用的色譜柱可以是胺基柱，氰基柱，十八垸基硅垸鍵合硅膠柱，八烷基硅烷鍵合硅膠柱，四垸基硅垸鍵合硅膠柱，苯基硅垸鍵合硅膠柱等；優(yōu)選地采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(C18柱)。6、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5所述的方法，其特征在于該方法對(duì)于不同比例的頭孢曲松鈉舒巴坦鈉復(fù)方均能檢測(cè)，頭孢曲松鈉舒巴坦鈉兩者成分的比例可以包括1:5(T50:1，優(yōu)選地用于1:2(T20:1。7、根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6所述的方法，其特征在于該方法可以用于頭孢曲松鈉舒巴坦鈉復(fù)方的原料檢測(cè)，也可以用于該復(fù)方的制劑檢測(cè)。8、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5、6、7所述方法，這種檢測(cè)頭孢曲松鈉舒巴坦鈉復(fù)方的方法，對(duì)兩個(gè)組分的含量及雜質(zhì)能很好地檢測(cè)，并且這樣的檢驗(yàn)不受另一成分的干擾，有很好的靈敏度、專屬性、簡(jiǎn)便易行，該方法可以用于制藥公司在該復(fù)方的原料與制劑生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量的檢測(cè)，也可以用于藥檢所、醫(yī)院等單位對(duì)制劑質(zhì)量的監(jiān)控。全文摘要一種新的高效液相色譜(HPLC)方法，可以同時(shí)檢測(cè)頭孢曲松鈉舒巴坦鈉復(fù)方中兩種單一成分的含量及有關(guān)雜質(zhì)，兩種成分不相互干擾與影響，該方法操作簡(jiǎn)單易行，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，線性范圍大，穩(wěn)定性好，可用于復(fù)方制劑與原料的檢測(cè)。文檔編號(hào)G01N30/02GK101592634SQ20081002834公開(kāi)日2009年12月2日申請(qǐng)日期2008年5月28日優(yōu)先權(quán)日2008年5月28日發(fā)明者孫明杰,霆王,鄧桂興,馬宏強(qiáng)申請(qǐng)人:廣州威爾曼新藥開(kāi)發(fā)中心有限公司;湘北威爾曼制藥有限公司