專利名稱：魚露中章魚胺及其前體化合物酪胺含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食品檢測方法，具體涉及一種魚露中腎上腺素能受體激動劑章 魚胺及其前體化合物酪胺含量的高效液相色譜檢測方法。
背景技術(shù)：
章魚胺，作為一種重要的生物胺與神經(jīng)介質(zhì)，有廣泛的生理作用，其中之一是
作為內(nèi)源性的e 3—腎上腺素能受體激動劑，它在能量的平衡和代謝調(diào)節(jié)上起著重 要作用，也是目前唯一作為產(chǎn)品的防治肥胖癥與糖尿病的e3-腎上腺素能受體激動 劑。中藥枳實和食品魚露是天然章魚胺的主要來源，但枳實中章魚胺的含量僅為
0.01 0.03%，而魚露中含有相對豐富的章魚胺，因而，進一步改進魚露的發(fā)酵工
藝，從魚露中提取章魚胺，提升魚露加工產(chǎn)業(yè)的效益，是海洋藥物研究的一個新領(lǐng) 域。
魚露中章魚胺的檢測，早期采用魚露堿化處理后用乙醚提取，氣相色譜測定的
方法， Mclver RC, Brooks RI， Reineccius GA. Flavor of fermented fish sauce. [J] .J. Agric. Food Chem, 1982， 30: 1017-1019。由于章魚胺在乙醚中的溶解度 有限，研究中發(fā)現(xiàn)該方法僅可以用于定性，而定量則數(shù)值偏低。目前，當(dāng)生物胺采 用HPLC測定時， 一般是對生物胺進行化學(xué)衍生處理，但此操作過程繁瑣，成本高， 見李志軍吳永寧薛長湖.食品中多種生物胺同時檢測方法研究進展[J].衛(wèi)生研究， 2006， 35(5):670-674報道。由于魚露含有27%的氯化鈉，成分復(fù)雜，用上述化學(xué) 衍生方法不完全適合魚露中章魚胺的測定，因此研究新的適用于魚露的、通用的、 不需化學(xué)衍生處理的章魚胺的HPLC分析方法具有重要的意義。2004年，Pellat報
3道了不經(jīng)衍生處理在220nm檢測枳實中章魚胺的HPLC的方法,Pellati F， Benvenuti S，Melegari M,High-performance liquid chromatography methods for the Analysis of adrenergic amines and flavanones in citrus aurantium var amara [J]， Phytochemical Analysis, 2004,15: 220-225.但該方法流動相在220nm處有 吸收，對檢測數(shù)據(jù)有干擾，不能精確測定。酪胺是章魚胺的前體化合物，研究新的 適用于章魚胺及其前體化合物酪胺含量的檢測方法尤其重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計采用HPLC檢測方法 測定章魚胺及其前體化合物酪胺含量的方法。
本發(fā)明對魚露中章魚胺含量測定方法進行了研究，本發(fā)明經(jīng)用紫外分光光度儀 對章魚胺及其前體化合物酪胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行掃描，均具有相同的最大吸收波長 274nm，且不受pH、生物胺濃度及含鹽量的影響，故選擇274nm作為檢測波長。本 研究以相關(guān)物質(zhì)在紫外波段內(nèi)的吸收峰的研究為基礎(chǔ)，在檢測波長274nm對魚露中 的章魚胺及酪胺進行了 HPLC分析方法的研究，提供了一種快速的不需要衍生處理 的HPLC檢測方法。
本發(fā)明人進行了下列基礎(chǔ)試驗
實驗條件
色譜柱phe醒enex l腿C18(150X4. 60mm， 5um)。
流動相0.02mol *L—l檸檬酸一0.02mol *L—l磷酸二氫鈉(7: 3)， pH調(diào)為 3，流速1.0mL*min-1，紫外檢測波長274nrn,進樣體積10uL。 實驗內(nèi)容
紫外檢測波長的確定分別取章魚胺標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動相配制成濃度分別為 250ug 'mL—1， 125ug ml/1, 62.5ug ml/1的三種標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照分光光度法，在200—300nm波長范圍內(nèi)用分光光度計進行掃描，結(jié)果三種濃度的章魚胺溶液 最大吸收峰都在274nm處(圖l)，不受pH與濃度的影響，而流動相在220nm處有吸收。 酪胺在274nm處也有最大吸收。因此用HPLC檢測時選擇274nm作為章魚胺及其前體化 合物酪胺的檢測波長。
線性關(guān)系將濃度為50ug mL-l的章魚胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)品，加流動相稀釋成O， 10， 20， 30， 40， 50ii g mL-l的梯度溶液，按色譜條件檢測，以峰面積Y與濃 度X做標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)回歸分析，章魚胺在0.0057 50ixg ，mL-l范圍內(nèi)有良好的線性 關(guān)系，回歸方程為Y二2868. 4X+60. 619， r=0.9991，酪胺在O. 025 50 u g mL-l范圍 內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y-3008.2X+449. 1， r=0.9995。
最小檢測濃度分別取章魚胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進樣10uL，記錄色譜圖。當(dāng) 色譜峰的峰高為噪音的3倍時(s/『3)，章魚胺和酪胺的濃度為最小檢測濃度，分別 為5.7ng mL-l和25ng mL-1。符合痕量測定的要求。
精密度取50ug raL-l的章魚胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進樣6次，在上述色譜條 件下測定，章魚胺峰面積的平均值為145795， RSD=1.8%，表明儀器精密度良好。
穩(wěn)定性魚露用流動相稀釋100倍，然后經(jīng)微孔濾膜(0.45um)濾過，間隔一定 時間進樣，測定。RSD=1.63%。結(jié)果表明，章魚胺在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。
重現(xiàn)性精密量取5份同一批次樣品1.0mL，用流動相稀釋100倍，制成5份樣品 溶液，進樣測定，RSD=1.51% 。表明本方法重現(xiàn)性良好。
加樣回收率將已知含量的分析試樣、溶液取等量三份，加入不同量的章魚胺標(biāo) 準(zhǔn)品溶液，用流動相配成一系列不同濃度的溶液，進樣10uL，測定回收率，平均 加樣回收率為104.4%。
經(jīng)過上述試驗，確定了用HPLC的檢測方法。
本發(fā)明提供了一種魚露中章魚胺及其前體化合物酪胺含量的檢測方法。 該方法采用HPLC方法，包括下列步驟
5(1) 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取章魚胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別用流動相配成濃度 為50"g'mL-1的溶液，然后將兩種溶液等體積混合，微孔濾膜(0.45um)過濾， 成為章魚胺和酪胺的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
(2) 樣品溶液的制備魚露用流動相稀釋100倍，微孔濾膜(0.45um)過濾；
(3) 檢測采用phenomenex luna C18(150X4. 60腦，5um)色譜柱，流動相 為0.02mo1'L—l檸檬酸一0.02mo1'L—1磷酸二氫鈉(7: 3) (v/v) ， pH調(diào)至3， 流速1.0mL，min-1，紫外檢測波長274nm，混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進樣10u L,記錄色譜 圖(圖2);
樣品溶液進樣10uL，記錄峰面積，以外標(biāo)法計算樣品百分含量。(鍉魚魚露樣 品色譜圖如圖3所示)。
本發(fā)明方法樣品用量少，可直接上機測定，具有良好的專一性，精密度和回收 率。實驗結(jié)果表明，測定結(jié)果穩(wěn)定，具有微量、簡便、快捷、靈敏等特點，能符合 痕量測定的要求。


圖1三種濃度的章魚胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在200—300nm波長范圍內(nèi)紫外掃描色譜圖。 圖2章魚胺和酪胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在274nm的HPLC色譜圖。 圖3鍉魚魚露樣品在274nm的HPLC色譜圖。
具體實施例方式
實例l
鍉魚魚露和七星魚魚露的檢測
鍉魚魚露和七星魚魚露用流動相稀釋100倍，微孔濾膜(0.45um)過濾，備用； 采用phenomenex lunaC18(150X4. 60mm， 5um)色譜柱，流動相為0. 02mol L—l檸檬酸—0.02mol L—1磷酸二氫鈉(7: 3)， pH調(diào)至3，流速1. OmL min-l， 紫外檢測波長274nm，樣品溶液進樣10nL，記錄峰面積(表1)，以外標(biāo)法計算樣 品百分含量。
表l HPLC測定所得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液的峰面積
混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液鍉魚魚露七星魚魚露
章魚胺656942772314873
酪胺689007099545253
已知混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中章魚胺和酪胺濃度均為25ix g mL-l，根據(jù)外標(biāo)法可以得 出，鍉魚魚露中含章魚胺1055ug mL—、酪胺2576ug mL—、七星魚露中含章 魚胺566ug mL—'，酪胺1642ug mL一1。 (鍉魚魚露樣品色譜圖如圖3所示)。
權(quán)利要求
1、一種魚露中章魚胺及其前體化合物酪胺含量的檢測方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取章魚胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別用流動相配成濃度為50μg·mL-1的溶液，然后將兩種溶液等體積混合，微孔濾膜0.45μm過濾，成為章魚胺和酪胺的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(2)樣品溶液的制備魚露用流動相稀釋100倍，微孔濾膜0.45μm過濾；(3)檢測采用phenomenex luna C18 150×4.60mm，5μm色譜柱，流動相為0.02mol·L—1檸檬酸—0.02mol·L—1磷酸二氫鈉73v/v，pH調(diào)至3，流速1.0mL·min-1，紫外檢測波長274nm，混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進樣10μL，記錄色譜圖；樣品溶液進樣10μL，記錄峰面積，以外標(biāo)法計算樣品百分含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種魚露中章魚胺及其前體化合物酪胺含量的檢測方法。該方法采用HPLC方法，本發(fā)明方法樣品用量少，可直接上機測定，具有良好的專一性，精密度和回收實驗結(jié)果表明，測定結(jié)果穩(wěn)定，具有微量、簡便、快捷、靈敏等特點，能符合痕量測定的要求。
文檔編號G01N33/48GK101464455SQ20071017254
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者曲映紅, 朱婷婷, 王建中, 王錫昌, 榮艷萍, 陳舜勝 申請人:上海水產(chǎn)大學(xué)