離子的檢測試劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬有機合成和分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地說是一種NCV離子的檢測試劑及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 陰離子在生物和環(huán)境系統(tǒng)中扮演著重要角色。例如，硝酸根離子可使人體正常的 血紅蛋白氧化而失去運輸氧的能力，還可與仲胺類化合物反應(yīng)生成具有致癌性亞硝胺類化 合物。根據(jù)報道每升水中硝酸鹽含量達(dá)數(shù)十毫克時，可能導(dǎo)致嬰兒患高鐵血紅蛋白癥的幾 率增加。因而對硝酸根離子的測定具有重要的實際意義。目前測定硝酸根離子的方法有多 波長法、二階導(dǎo)數(shù)法、流動注射法、離子色譜法、極譜法等。熒光光譜法由于操作簡單，檢測 靈敏和較低的檢測限，以及無需昂貴儀器設(shè)備等優(yōu)點而受到越來越多的關(guān)注。但是，目前大 多數(shù)的熒光探針只能用于金屬離子的檢測，用于陰離子檢測的熒光試劑尤其是能應(yīng)用到水 環(huán)境的探針很少。這主要是因為陰離子一般存在于水環(huán)境中，而陰離子在水溶液中會形成 很強的氫鍵，所以檢測水溶液中的陰離子是非常困難的。因此，發(fā)展以特定陰離子為識別測 定對象的熒光探針分子具有重要研宄意義和實際應(yīng)用價值。
[0003]另一方面，熒光探針與熒光顯微技術(shù)的結(jié)合，使熒光探針在生物活性物質(zhì)檢測和 細(xì)胞成像方面得到廣泛應(yīng)用。例如，美國加州大學(xué)戴維斯分校（UCDavis)生物光子學(xué)科學(xué) 技術(shù)中心（CBST)的科研人員首次通過熒光標(biāo)記成功地對活腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的納米尺寸區(qū)室 的運動進(jìn)行了成像。這一成果為未來理解癌癥和一大批其他疾病的分子原因和生物力學(xué) 的突破進(jìn)展帶來了希望，它還促進(jìn)了神經(jīng)科學(xué)和干細(xì)胞等領(lǐng)域的研宄。熒光成像分析是目 前廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞分析的一種高靈敏的可視化分析技術(shù)。另一方面，由于陰離子在生命 活動和環(huán)境治理等方面的重要價值，如何檢測和識別陰離子的研宄是科研工作者的熱點之 一。尤其是陰離子參與調(diào)控細(xì)胞的諸多功能與性質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)起著非常重要的作用，因此， 實現(xiàn)活體細(xì)胞內(nèi)各種陰離子生理活性小分子物種的實時在線動態(tài)檢測對生命科學(xué)研宄與 發(fā)展具有重要的價值。然而，由于陰離子具有較高的溶劑化自由能以及較大的離子半徑，到 目前為止，真正能夠應(yīng)用到環(huán)境或活細(xì)胞內(nèi)陰離子熒光成像的熒光探針不多。本專利申請 首次報道了一種能檢測中性水溶液中微量NCV離子的熒光探針并將其應(yīng)用于活體細(xì)胞內(nèi) NO,陰離子熒光成像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于研宄一種能高靈敏、高選擇性檢測pH值中性水溶液中微量 NO,的熒光光譜分析新方法并將其應(yīng)用于活性細(xì)胞內(nèi)NCV陰離子熒光成像。本發(fā)明的目的 通過發(fā)明人研制合成的新的熒光試劑，采用增強熒光光譜強度法對NCV離子進(jìn)行熒光光譜 分析。
[0005] -種NCV離子檢測試劑，其特征是其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為a:
分子式：C44H54Br2N2;分子量：770. 72 在水溶液中的熒光激發(fā)波長是470nm，最大發(fā)射波長是640nm，熒光強度很弱，與NOf離子結(jié)合后，最大發(fā)射波長是575nm，焚光強度明顯增強，可用于NOf離子的檢測。
[0006] 上述的一種NCV離子的檢測試劑，是指所述探針a的制備方法為以9, 10-雙吡啶 基乙烯蒽為原料，以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，與溴代辛烷烴反應(yīng)，合成路線如下：
核磁共振氫譜：蟲NMR(DMS0-d6，500MHz)J: 9. 06 (d,歲5Hz,，4H)，8. 95 (d， ^15Hz, 2H), 8. 51(d, ^5Hz, 4H), 8. 41 (m, , 4H), 7. 63 (m, , 4H), 7. 28 (d, ^15 Hz, 2H), 4. 55 (t, ^20Hz, 4H), 1. 93 (t,歲20Hz, 4H), 1. 93 (m, 20H), 0? 83 (m, 6H)。
[0007] 所述的一種N(V離子檢測試劑的應(yīng)用，是指用于檢測中性水溶液中微量NO^離子 的焚光光譜分析。
[0008] 上述的一種NCV離子檢測試劑的應(yīng)用，是指用于水溶液中微量N0，離子的定性或 定量分析，定量分析的線性濃度范圍1. 5X1(T7~2. 1X1(T5mol噸4;定性分析檢測限低至 10 8mol?L\
[0009] 所述的一種NCV離子檢測試劑的應(yīng)用，是指其它陰離子F'Cl、Br、HSCV，S042' Ac0_，BF4_，H2P04_在濃度與NO3_濃度相當(dāng)時，不干擾N03_的測定。
[0010] 上述的一種NCV離子檢測試劑的應(yīng)用，是指用于對活體細(xì)胞內(nèi)NO離子染色后的 熒光成像，對細(xì)胞影像拍照獲得清晰的細(xì)胞輪廓影像。
[0011] 上述的一種NCV離子檢測試劑的應(yīng)用，所指的細(xì)胞為活體的PC3細(xì)胞。
[0012] 上述的一種NCV離子檢測試劑的應(yīng)用，所指的細(xì)胞為活體PC3人體前列腺癌細(xì)胞。
[0013] 上述的一種NCV離子檢測試劑的應(yīng)用，是指用探針a對細(xì)胞內(nèi)N0 ^進(jìn)行染色，用熒 光倒置顯微鏡觀測活體細(xì)胞，染色成像的具體方法為：活性PC3細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇接種于含10%胎 牛血清以及含1%雙抗的培養(yǎng)基（RPMI1640)中，在溫度為37°C，5%C02及飽和濕度為100% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天傳代1次，選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于12孔板中培養(yǎng)， 密度為2X104個/ml，次日用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，將細(xì)胞浸入含5ymol?廠1探針a (900yL培養(yǎng)基 + 100ymol?L-1 探針a的CH30H/H20 混合溶液 100yL)中，在 37°C，5% C02、飽和濕度100%的培養(yǎng)箱中孵育30min，吸出含探針a的培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì) 胞三次，熒光倒置顯微鏡下觀察并進(jìn)行亮場和暗場拍照；再浸入含20ymol?I71NCV溶液 (900yL培養(yǎng)基 + 500ymol.I71NO,溶液lOOyL)，在 37°C、5%C02、飽和濕度 100% 的 培養(yǎng)箱中孵育30min，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)探針對NCV染色，吸出含NCV溶液的培養(yǎng)液，染色后的細(xì) 胞再用新鮮培養(yǎng)基清洗三次，在熒光倒置顯微鏡下觀察探針對細(xì)胞內(nèi)NCV染色后的熒光成 像，對細(xì)胞影像拍照獲得清晰的細(xì)胞輪廓影像。
[0014] 上述的一種NCV離子檢測試劑的應(yīng)用，是指細(xì)胞成像中，探針a和N0，都能滲透到 活體PC3細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞呈圓滑飽滿狀，探針與細(xì)胞具有良好的相容性，未見細(xì)胞凋亡，對細(xì) 胞無毒性；探針與NCV在細(xì)胞內(nèi)染色后，熒光倒置顯微鏡檢測顯示了清晰的黃色熒光細(xì)胞 分布，染色具有特定區(qū)域的選擇性聚集能力。
[0015] 上述的一種NCV離子檢測試劑的應(yīng)用，是指所用的試劑為分析純或生化試劑，所 用水為二次蒸餾水或生理鹽水；所用活體PC3細(xì)胞為人體前列腺癌細(xì)胞；所用的拍照設(shè)備 為熒光倒置顯微鏡。
[0016] 上述的一種NCV離子檢測試劑的應(yīng)用，滿足了（1)良好的水溶性；（2)在生理條件 下具有良好的熱穩(wěn)定性；（3)良好的膜穿透性，并且對細(xì)胞是無毒的；（4)對NCV具有選擇 性、高靈敏的熒光增強作用，有較長的激發(fā)波長和較高的發(fā)光產(chǎn)率。利用探針a在活體細(xì)胞 內(nèi)與NO,的染色作用，用熒光倒置顯微鏡能清晰獲得發(fā)射黃色熒光的細(xì)胞圖像。發(fā)明了一 種新穎的活體細(xì)胞內(nèi)的熒光成像技術(shù)。
[0017]發(fā)明效果：本發(fā)明用于pH值中性水溶中微量NO,離子的定性和定量分析，定量分 析的濃度線性范圍寬為1.5X10_7~2. 1X10_5mol?L-1，檢測限低至10_8mol?L-1，同時， 其它陰離子F_，Cl_，Br_，HS04_，S0廣，Ac0_，BF4_，H2P04_在濃度相當(dāng)時不干擾測定。此外， 熒光成像分析是目前廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞分析的一種高靈敏的可視化分析技術(shù)。因此發(fā)現(xiàn)對 NO,陰離子活體細(xì)胞內(nèi)熒光成像的方法具有較強的科學(xué)研宄意義和實際應(yīng)用價值。本發(fā)明 首次報道了在生理條件下，利用熒光成像技術(shù)觀察活體細(xì)胞內(nèi)NCV陰離子聚集情況。在細(xì) 胞成像中，探針a和N0 ^都能滲透到活體PC3細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞呈圓滑飽滿狀，探針與細(xì)胞具有 良好的相容性，未見細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞無毒性；探針與NCV在細(xì)胞內(nèi)染色后，熒光倒置顯微 鏡檢測顯示了清晰的黃色熒光細(xì)胞分布，對細(xì)胞影像拍照獲得清晰的細(xì)胞輪廓影像，染色 具有特定區(qū)域的選擇性聚集能力。
【附圖說明】
[0018] 圖1熒光探針a的晶體結(jié)構(gòu)。
[0019] 圖2熒光探針a的核磁共振氫譜 圖3熒光探針a(1. 00X10 _5mol?I71)的水溶液在不同陰離子（1. 00X10_54mol?I71)F_，Cl_，Br_，HS04_，S042_，Ac0_，BF4_，H2P04_存在下的熒光光譜。N03_ 的加入使a在 575nm 處的熒光強度增強。而其他上述實驗陰離子的加入，，幾乎不會改變a的熒光強度。測試的 激發(fā)波長為470nm。
[0020] 圖4其它陰離子對探針a檢測NO3_的熒光強度影響。在濃度為1. 00X1(T5mol七1 的a的水溶液中，加入2. 00X10 _4mol噸―1的N0 3_后測定a在波長為575nm處的熒光強度 值。再分別向a-N03_混合溶液中加入等量的其他陰離子：F_，Cl_，&_，HS04_，S0廣，Ac0_， BFpH2P(V后的熒光強度值的變化。表明其它實驗陰離子沒有引起a-NO,體系熒光強度 的變化。測試的激發(fā)波長為470nm。
[0021] 圖5 365nm紫外燈照射下濃度為1. 00X1(T5mol?r1熒光分子a的水溶液中加入 10倍不同陰離子后的顏色變化。
[0022] 圖6不同濃度的N0 3_對探針a的熒光滴定光譜圖。在濃度為1. 00X1(T5mol?I71 試劑a的水溶液中分別加入不同濃度NO3_到a溶液中，隨著NO3_的加入，分別測得的熒光光 譜。在575nm處的發(fā)射峰逐漸升高。測試的激發(fā)波長為360nm。
[0023] 圖7探針a的熒光光譜法檢測NO，的校準(zhǔn)曲線?？v坐標(biāo)為發(fā)射波長為575nm處 的熒光強度值，橫坐標(biāo)為NO,的濃度。激發(fā)波長為470nm。NO,響應(yīng)的濃度線性范圍為 1. 5X1(T7~2. 1X1(T5mol?L'
[0024] 圖8探針a與NO3_對PC3細(xì)胞的熒光倒置顯微鏡拍攝照片。
[0025] 8-1為PC3細(xì)胞內(nèi)只有探針a(濃度為5ymol?I71)時的亮場顯