專利名稱：膝溝藻毒素gtx2,3間接競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用抗膝溝藻毒素GTX2,3的單 克隆抗體對(duì)膝溝藻毒素GTX2，3進(jìn)行檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。
背景技術(shù)：
麻痹性貝毒是一種低分子量、高毒性的貝毒，生存于海洋微藻中，主要通 過(guò)對(duì)鈉離子通道的影響而抑制神經(jīng)的傳導(dǎo)，為神經(jīng)毒素的一種。膝溝藻毒素 (gonyautoxin， GTX)為麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish Posoning， PSP) 家族中重要的成員之一，是一類含雙胍基的三環(huán)生物堿化合物，呈堿性，易溶 于水，在弱酸和低溫條件下比較穩(wěn)定。調(diào)査顯示我國(guó)南北海區(qū)均存在可產(chǎn)生麻 痹性貝毒的赤潮藻，且在多個(gè)樣點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了多種貝類含有麻痹性貝毒素。曾檢測(cè) 出廣東大亞灣貝類養(yǎng)殖區(qū)麻痹性貝毒含量達(dá)117Mu/g，超過(guò)可食用閾值近30 倍。已有資料顯示，GTX2，3是我國(guó)南方沿海染毒貝類和有毒赤潮藻的麻痹性 貝毒的主要成分之一。
GTX2的分子結(jié)構(gòu) GTX3的分子結(jié)構(gòu)
目前麻痹性貝毒的檢測(cè)方法主要有
(1)小白鼠生物法是將藻或貝等生物組織的萃取液注射進(jìn)小鼠腹腔，
根據(jù)小鼠死亡時(shí)間，査對(duì)Sommer表，判斷毒性大小。該方法的特點(diǎn)是不需要
昂貴的儀器，操作簡(jiǎn)便，但耗時(shí)長(zhǎng)、誤差大、重現(xiàn)性差，同時(shí)有違動(dòng)物保護(hù) 條例，在西方國(guó)家已不主張使用。
(2) 高效液相色譜分析(HPLC):其原理是樣品中的毒素在氧化劑的作 用下生成熒光性物質(zhì)，在熒光檢測(cè)器上檢測(cè)。目前使用較多的是柱后氧化法。 HPLC檢測(cè)法的特點(diǎn)是靈敏、準(zhǔn)確，能確定樣品中毒素的具體成分等，但是 該方法需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，專門的分析技術(shù)人員，且標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，前 處理麻煩，不能同時(shí)檢測(cè)大量樣品，不適合現(xiàn)場(chǎng)及大規(guī)模的推廣應(yīng)用。
(3) 細(xì)胞毒檢測(cè)技術(shù)根據(jù)麻痹性貝類毒素可以阻斷Na+內(nèi)流這一作用 機(jī)制，在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入Na+通道活化劑烏本苷，如果沒(méi)有麻痹性貝毒的 存在，細(xì)胞會(huì)因Na+內(nèi)流過(guò)多而腫脹死亡，而麻痹性貝毒可有效抑制這一過(guò) 程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)毒素的檢測(cè)。但此種方法需要特殊的裝置，難以普及。
(4) 傳統(tǒng)化學(xué)分析法以Bates等(1975)提出的氧化/熒光技術(shù)應(yīng)用最廣。
其步驟是在堿性條件下用H202氧化PSP，使其生成具有熒光的物質(zhì)，再測(cè)定其熒光值。熒光值越高，毒素的毒性越大。許多學(xué)者應(yīng)用近代化學(xué)技術(shù)對(duì)麻 痹性貝毒毒素做了進(jìn)一步的探索研究，已見(jiàn)報(bào)道的分離方法有薄層層析法、 離子交換柱層析法、電泳法等。這些方法靈敏度高，但很費(fèi)時(shí)，而且不能分 離出含量低的組分，限制了它們?cè)谌粘６拘詸z測(cè)中的應(yīng)用。
(5) 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)目前較多應(yīng)用于麻痹性貝類毒素檢測(cè)的是酶聯(lián)免 疫吸附檢測(cè)法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)和膠體金試 紙條檢測(cè)法，其檢測(cè)的原理是將PSP毒素與載體蛋白偶聯(lián)免疫動(dòng)物，獲得針 對(duì)毒素的抗體，利用樣品中的毒素與標(biāo)準(zhǔn)毒素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體并以此對(duì)樣品中 的毒素進(jìn)行定性或定量分析。該法簡(jiǎn)便、快速，可同時(shí)分析大批量樣品。
目前國(guó)外已經(jīng)有商品化的PSP酶免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒上市，但是價(jià)格昂貴， 檢測(cè)一個(gè)樣品的價(jià)格都是在200元以上，同時(shí)這些試劑盒都是利用抗石房蛤 毒素抗體所制備，而我國(guó)多發(fā)的PSP毒素是GTX，故并不適合在我國(guó)推廣使 用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種利 用抗GTX2,3單克隆抗體檢測(cè)GTX2,3的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，該方法可以大規(guī) 模地對(duì)海洋魚(yú)貝類食品中殘留的麻痹性貝類毒素進(jìn)行快速、靈敏的檢測(cè)，保障我國(guó)海產(chǎn)品食用安全及維護(hù)我國(guó)在相關(guān)國(guó)際貿(mào)易領(lǐng)域中的利益。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種膝溝藻毒素GTX2，3間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA檢測(cè)方法，包括如下步驟分別將魚(yú)貝類樣品提取液和系列濃度的 GTX2，3標(biāo)準(zhǔn)液加入到抗原預(yù)包被條的微孔中；然后加入抗GTX2,3單克隆抗 體到每個(gè)微 L,混合后孵育；在每個(gè)微孔中依次加入生物素化羊抗鼠IgG多抗 和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素，孵育；在每個(gè)微孔加入顯色液TMBG ，3'，5 ，5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物工作液反應(yīng)后，再在每個(gè)微孔中加入終止液終止反應(yīng)； 用酶聯(lián)讀數(shù)儀測(cè)定每個(gè)微孔的OD(吸光度)值；對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)液所得的曲線回歸方 程，計(jì)算出魚(yú)貝類樣品中實(shí)際的GTX2,3濃度。
上述膝溝藻毒素GTX2，3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，包括如下步驟
(1 )分別將50pL處理好的魚(yú)貝類樣品提取液和50^L系列濃度的GTX2，3 標(biāo)準(zhǔn)液加入到抗原預(yù)包被條的微孔中；然后加入5(HiL用稀釋液1 : 800稀釋 的抗GTX2，3單克隆抗體到每個(gè)微孔，混合，37。C孵育0.5 0.75h;然后用洗 滌液洗滌各微孔3 5次；
(2) 在每個(gè)微孔中加入100^1用稀釋液1 : 2000稀釋的生物素化羊抗鼠 IgG多抗，37。C孵育0.5 0.75h;然后用洗滌液洗滌各微孔3 5次；
(3) 在每個(gè)微孔中加入100^1用稀釋液1 : 6000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶 標(biāo)記親和素，37'C孵育0.5 0.75h;然后用洗滌液洗滌各微孔3 5次；
(4) 在每個(gè)微孔加入100pL顯色液TMB (3 ,3'，5 ,5'-四甲基聯(lián)苯胺)底 物工作液，反應(yīng)15 20min;
(5) 在每個(gè)微孔中加入50^iL 2M H2S04 (終止液)終止反應(yīng)，并振蕩混
勻；
(6) 用酶聯(lián)讀數(shù)儀測(cè)定在450nm波長(zhǎng)下的OD(吸光度)值；
(7) 將所得標(biāo)準(zhǔn)液和魚(yú)貝類樣品的吸光度值除以O(shè)標(biāo)準(zhǔn)((Hxg/L的標(biāo)準(zhǔn) 液)的吸光度值再乘以100%，以此標(biāo)準(zhǔn)液計(jì)算值為縱坐標(biāo)，GTX2，3濃度(ppb) 的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)每個(gè)樣品的B/B0值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出 對(duì)應(yīng)的GTX2,3濃度，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出魚(yú)貝類樣品中實(shí)際的 GTX2，3濃度。
所述的稀釋液和洗滌液均為含0.05% (體積百分比)吐溫-20的0.01M
磷酸鹽緩沖液。
為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述魚(yú)貝類樣品提取液按下述方法預(yù)處理將均質(zhì)后的10g魚(yú)肉或貝肉加入10 20ml 0.1M的HC1，煮沸并攪拌5分鐘，4°C 3500g離心10分鐘，離心后用5N的鹽酸調(diào)節(jié)PH到4.0以下，取10(^1上清 液，用稀釋液1:10 (體積比)稀釋。
所述的抗GTX2,3單克隆抗體按下述方法制備而成用甲醛法將GTX2,3 偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫 小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌抗GTX2,3單克隆抗體 (MAb-GTX2，3)的陽(yáng)性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘生腹水， 純化，獲得抗GTX2，3單克隆抗體。
所述抗原預(yù)包被條是按下述方法制備而成
(a) 包被用pH9.6的0.05M碳酸鈉緩沖液或0.01 0.05M pH7.4磷酸 鹽緩沖液將GTX2,3-葡萄糖氧化酶稀釋至5pg/mL，每孔100pL加入到聚苯乙 烯微孔板微孔中，4。C包被過(guò)夜或37。C包被2 3h;
(b) 洗滌倒出微孔板微孔中上述液體后，將200 300nl洗滌液加入 微孔中；然后倒出微孔板微孔中的液體，完全除去微孔板微孔中的液體；
(c) 封閉每孔微孔加入150 200pL含0.5 3 %牛血清白蛋白的0.01 0.05MpH7.4磷酸鹽緩沖液，37。C封閉1.5 0.5h;
(d) 洗滌按步驟(b)洗滌3 5次；
(e) 保護(hù)加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時(shí)；
(f) 干燥微孔板干燥后，即得到抗原預(yù)包被條。
上述膝溝藻毒素GTX2，3進(jìn)行檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法可在檢測(cè)海洋 魚(yú)貝類食品等中的應(yīng)用。
本發(fā)明是將GTX2，3-葡萄糖氧化酶(GTX2,3-GOX)包被96孔酶標(biāo)板， 加入GTX2,3標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，再加入抗GTX2,3單克隆抗體，包被抗原 GTX2,3-GOX (GTX2，3-葡萄糖氧化酶)與游離的GTX2，3競(jìng)爭(zhēng)抗GTX2，3單克 隆抗體，洗去游離的GTX2,3與抗GTX2,3單克隆抗體(MAb-GTX2，3)的復(fù) 合物，與包被抗原GTX2,3-GOX結(jié)合的MAb- GTX2,3再與生物素化羊抗鼠IgG 多抗結(jié)合，然后生物素又可與酶標(biāo)記的親和素結(jié)合，經(jīng)底物顯色后終止反應(yīng)， 用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(OD)， OD值越大，樣品中自由的GTX含量越 少，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品所得的曲線回歸方程，計(jì)算樣品中GTX2,3的含量。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果
本發(fā)明利用得到的分泌抗GTX2,3單克隆抗體的陽(yáng)性細(xì)胞可大量制得抗膝溝藻毒素2,3的單克隆抗體，所建立的方法成本低廉，可快速、簡(jiǎn)便、靈敏 地測(cè)定樣品中GTX2，3的含量。該方法可以大規(guī)模地對(duì)海洋貝類食品中殘留的 麻痹性貝類毒素進(jìn)行快速、靈敏的檢測(cè)，保障我國(guó)海產(chǎn)品食用安全及維護(hù)我 國(guó)在相關(guān)國(guó)際貿(mào)易領(lǐng)域中的利益。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
試劑的配制
稀釋液及洗滌液均為PBS-T即含0.05%吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液 (KH2P04 0.2g， Na2P04.12H20 2.9g， NaCl 8g，定容至1000ml， pH7.4，再 加0.5ml吐溫-20);顯色液為TMB (3 ,3'，5 ,5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物工作液； 終止液為2M硫酸溶液即量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至lOOOmL。
實(shí)施例1
利用抗GTX2,3單克隆抗體檢測(cè)GTX2，3的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，包括 如下步驟
(A) 用甲醛法將GTX2，3偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白(KLH)上，混合弗式不完全 佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出 穩(wěn)定分泌抗GTX2,3單克隆抗體(MAb-GTX2,3)的陽(yáng)性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)， 注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘生腹水，蛋白A柱純化，獲得抗GTX2,3單克隆抗體。
(B) 用高碘酸鹽氧化法偶聯(lián)得到GTX2，3-葡萄糖氧化酶。
(C) 抗原預(yù)包被條的制備
(a) 包被用包被緩沖液(0.05M碳酸鈉緩沖液，pH9.6)將GTX2,3-葡 萄糖氧化酶(GTX2，3-GOX)(Glucose Oxidase,葡萄糖氧化酶)稀釋至5jxg/mL, 每孔100nL加入到聚苯乙烯微孔板微孔中，4t:包被過(guò)夜。
(b) 洗滌倒出微孔板孔中包被緩沖液后，將微孔板倒置在吸水紙上拍 打以保證完全除去孔中的液體。用洗瓶或多通道移液器將250pl洗滌液加入 孔中。3分鐘后再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體。
(c) 封閉每孔加入150]xL含0.5%(w/v)BSA(Bovine serum album,牛血 清白蛋白)的0.01MPBS (Phosphate-Buffered Saline,磷酸鹽緩沖液，pH7.4)， 37。C封閉1.5h;
(d) 按步驟(2)洗滌微孔3次；
(e) 加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時(shí)；
(f) 干燥置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存。
(D) 樣品預(yù)處理(貝肉樣品提取液)
除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質(zhì)器均質(zhì)，稱取10g均質(zhì)后的樣品加 入10ml0.1M的HCl，煮沸并攪拌5分鐘，4°C 3500g離心10分鐘，離心后 用5N的鹽酸調(diào)節(jié)PH到4.0以下，取100^1上清液，用稀釋液1:10 (體積比) 稀釋。
(E) 膝溝藻毒素的檢測(cè)
(1) 分別加入50pL系列濃度0ppb(相當(dāng)于Kig/L、 pg/kg)、 30ppb、 60ppb、 120ppb、 240ppb、 480ppb的GTX2,3標(biāo)準(zhǔn)液和50pL上述處理好的貝肉樣品 提取液到每個(gè)微孔中；
(2) 加入50pL用稀釋液1:800稀釋的抗GTX2，3單克隆抗體到已有標(biāo)準(zhǔn) 液或貝肉樣品的每個(gè)微孔中，輕輕混合，37-C孵育0.75h;然后用洗滌液洗滌 各微孔3次；
(3) 在每個(gè)微孔中加入100pl用稀釋液1 : 2000稀釋的生物素化羊抗鼠 IgG多抗，37"C孵育0.75h;用洗滌液洗滌各微孔3次；
(4) 在每個(gè)微孔中加入lOOpil用稀釋液1 : 6000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶 標(biāo)記親和素，37-C孵育0.5h;然后用洗滌液洗滌各微孔3次；
(5) 每孔加入100^iL顯色液TMB (3 ,3',5 ，5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物工作 液，反應(yīng)15min;
(6) 每孔加入5(HiL2MH2S04 (終止液)終止反應(yīng)，并輕輕振蕩混勻；
(7) 在15分鐘內(nèi)用酶聯(lián)讀數(shù)儀測(cè)定在450nm波長(zhǎng)下的OD(吸光度)值。 標(biāo)準(zhǔn)液讀數(shù)依次為1.516、 1.198、 1.031、 0.834、 0.606和0.334，樣品讀數(shù)為 1.102。
(F) 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 將所得標(biāo)準(zhǔn)液和樣品吸光度值除以O(shè)標(biāo)準(zhǔn)(Opg/L的標(biāo)準(zhǔn)液)的吸光度
值再乘以100%，以此標(biāo)準(zhǔn)液計(jì)算值為縱坐標(biāo)，GTX2,3濃度(ppb)的對(duì)數(shù) 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
B(標(biāo)準(zhǔn)的或樣品吸光度值) %最大吸光度值=--------------------------------------xl00%
BO(O標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值)
根據(jù)每個(gè)樣品的B/B0值就可以從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出對(duì)應(yīng)的GTX2，3濃 度，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，最終計(jì)算出樣品中實(shí)際的GTX2,3濃度為 46.99ppb。樣品中GTX2，3的含量測(cè)定結(jié)果為939.8(xg/kg 。
實(shí)施例2
利用抗GTX2,3單克隆抗體檢測(cè)GTX2，3的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，包括 如下步驟
(A) 用甲醛法將GTX2,3偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白(KLH)上，混合弗式不完全 佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出 穩(wěn)定分泌抗GTX2,3單克隆抗體(MAb-GTX2，3)的陽(yáng)性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)， 注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘生腹水，蛋白A柱純化，獲得抗GTX2,3單克隆抗體。
(B) 用高碘酸鹽氧化法偶聯(lián)得到GTX2，3-葡萄糖氧化酶。
(C) 抗原預(yù)包被條的制備
(a) 包被用包被緩沖液(0.05M碳酸鈉緩沖液，pH9.6)將GTX2,3-葡 萄糖氧化酶(GTX2,3-GOX)(Glucose Oxidase,葡萄糖氧化酶)稀釋至5pg/mL， 每孔lOOpL加入到聚苯乙烯微孔板微孔中，37'C包被3h。
(b) 洗滌倒出微孔板孔中包被緩沖液后，將微孔板倒置在吸水紙上拍 打以保證完全除去孔中的液體。用洗瓶或多通道移液器將300pl洗滌液加入 孔中。3分鐘后再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體。
(c) 封閉每孔加入200pL含3%BSA(Bovine serum album,牛血清白蛋 白)的0.01MPBS (Phosphate-Buffered Saline,磷酸鹽緩沖液，pH7.4) ， 37°C 封閉0.5h;
(d) 按步驟(b)用洗滌液洗滌微孔5次；
(e) 加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時(shí)；
(f) 干燥置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存待用。
(D) 樣品預(yù)處理(魚(yú)肉樣品提取液) 用雙蒸水洗凈魚(yú)肉后均質(zhì)器均質(zhì)，稱取10g均質(zhì)后的魚(yú)肉加入10ml 0.1
M的HCK如果樣品為較干燥的魚(yú)肉則加入20ml0.1M的HC1，稀釋系數(shù)等 同)，煮沸并攪拌5分鐘，4°C 3500g離心10分鐘，離心后用5N的鹽酸調(diào) 節(jié)PH到4.0以下，取10(Hil上清液，用稀釋液1:10 (體積比)稀釋。
(E) 膝溝藻毒素的檢測(cè)
(1)分別加入50^L系列濃度0ppb(相當(dāng)于pg/L、 ng/kg)、 30ppb、 60ppb、 120ppb、 240ppb、 480ppb的GTX2，3標(biāo)準(zhǔn)液和50nL上述處理好的魚(yú)肉樣品提
取液到每個(gè)微孔中；
(2) 加入50^iL用稀釋液1:800稀釋的抗GTX2，3單克隆抗體到已有標(biāo)準(zhǔn) 液或魚(yú)肉樣品的微孔中，輕輕混合，37t:孵育0.75h;然后按步驟(b)用洗 滌液洗滌各微孔5次；
(3) 在每個(gè)微孔中加入lOOpl用稀釋液1 : 2000稀釋的生物素化羊抗鼠 IgG多抗，37"C孵育0.5h;然后用洗滌液洗滌各微孔5次；
(4) 在每個(gè)微孔中加入100^1用稀釋液1 : 6000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶 標(biāo)記親和素，37"C孵育0.75h;然后用洗滌液洗滌各微孔5次；
(5) 每孔加入100pL顯色液TMB (3 ,3',5 ，5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物工作 液，反應(yīng)20min;
(6) 每孔加入5(HiL2MH2S04 (終止液)終止反應(yīng)，并輕輕振蕩混勻；
(7) 在15分鐘內(nèi)用酶聯(lián)讀數(shù)儀測(cè)定在450nm波長(zhǎng)下的OD(吸光度)值。 標(biāo)準(zhǔn)液讀數(shù)依次為1.435、 1.179、 0.947、 0.779、 0.568和0.315，樣品讀數(shù)為 0.899。
(F) 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
將所得標(biāo)準(zhǔn)液和樣品吸光度值除以0標(biāo)準(zhǔn)(OppbOig/L)的標(biāo)準(zhǔn)液)的吸 光度值再乘以100%，以此標(biāo)準(zhǔn)液計(jì)算值為縱坐標(biāo)，GTX2,3濃度(ppb)的 半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
B(標(biāo)準(zhǔn)的或樣品吸光度值)
%最大吸光度值=--------------------------------------xl00%
BO(O標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值)
根據(jù)每個(gè)樣品的B/B0值就可以從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出對(duì)應(yīng)的GTX2,3濃 度，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，最終計(jì)算出樣品中實(shí)際的GTX2,3濃度為 75.19ppb。樣品中GTX2,3的含量測(cè)定結(jié)果為1.504mg/kg 。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí) 施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種膝溝藻毒素GTX2，3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟分別將魚(yú)貝類樣品提取液和系列濃度的GTX2，3標(biāo)準(zhǔn)液加入到抗原預(yù)包被條的微孔中；然后加入抗GTX2，3單克隆抗體到每個(gè)微孔，混合后孵育；在每個(gè)微孔中依次加入生物素化羊抗鼠IgG多抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素，孵育；在每個(gè)微孔加入顯色液TMB底物工作液反應(yīng)后，再在每個(gè)微孔中加入終止液終止反應(yīng)；用酶聯(lián)讀數(shù)儀測(cè)定每個(gè)微孔的OD值；對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)液所得的曲線回歸方程，計(jì)算出魚(yú)貝類樣品中實(shí)際的GTX2，3濃度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種膝溝藻毒素GTX2,3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè) 方法，其特征在于(1) 分別將5(HiL處理好的魚(yú)貝類樣品提取液和50pL系列濃度的GTX2,3 標(biāo)準(zhǔn)液加入到抗原預(yù)包被條的微孔中；然后每孔加入50pL用稀釋液1 : 800 稀釋的抗GTX2,3單克隆抗體到每個(gè)微孔，混合，37"C孵育0.5 0.75h;用洗 滌液洗滌各微孔3 5次；(2) 在每個(gè)微孔中加入100nl用稀釋液l : 2000稀釋的生物素化羊抗鼠IgG 多抗，37'C孵育0.5 0.75h;用洗滌液洗滌各微孔3 5次；(3) 在每個(gè)微孔中加入10(Hil用稀釋液1 : 6000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo) 記親和素，37。C孵育0.5 0.75h;用洗滌液洗滌各微孔3 5次；(4) 在每個(gè)微孔加入100pL顯色液TMB底物工作液，反應(yīng)15 20min;(5) 在每個(gè)微孔中加入5(HiL終止液2MH2S04終止反應(yīng)，并振蕩混勻；(6) 用酶聯(lián)讀數(shù)儀測(cè)定在450nm波長(zhǎng)下的OD值；(7) 將所得標(biāo)準(zhǔn)液和魚(yú)貝類樣品的吸光度值除以0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值再乘以 100%，以此標(biāo)準(zhǔn)液計(jì)算值為縱坐標(biāo)，GTX2，3濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線；根據(jù)每個(gè)樣品的B/B0值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出對(duì)應(yīng)的G"DC2，3濃度，再乘以相 應(yīng)的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出魚(yú)貝類樣品中實(shí)際的GTX2,3濃度；所述的稀釋液和洗滌液均為含0.05%吐溫-20的O.OIM磷酸鹽緩沖液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種膝溝藻毒素GTX2,3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè) 方法，其特征在于所述魚(yú)貝類樣品提取液按下述方法預(yù)處理將均質(zhì)后的10g 魚(yú)肉或貝肉加入10 20ml O.lM的HCl，煮沸并攪拌5分鐘，4℃ 3500g離心 10分鐘，離心后用5N的鹽酸調(diào)節(jié)PH到4.0以下，取10μ1上清液，用稀釋液1:10體積比稀釋。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種膝溝藻毒素GTX2，3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè) 方法，其特征在于所述的抗GTX2，3單克隆抗體按下述方法制備而成用甲 醛法將GTX2，3偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取 免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌抗GTX2,3單克隆抗 體的陽(yáng)性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘生腹水，純化，獲得抗 GTX2，3單克隆抗體。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種膝溝藻毒素GTX2,3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè) 方法，其特征在于所述抗原預(yù)包被條是按下述方法制備而成(a) 包被用pH9.6的0.05M碳酸鈉緩沖液或0.01 0.05MpH7.4磷酸鹽 緩沖液將GTX2，3-葡萄糖氧化酶稀釋至5pg/mL，每孔lOO^L加入到聚苯乙烯 微孔板微孔中，4"C包被過(guò)夜或37i:包被2 3h;(b) 洗滌倒出微孔板微孔中上述液體后，將200 300nl洗滌液加入微 孔中；然后倒出微孔板微孔中的液體，完全除去微孔板微孔中的液體；(c) 封閉每孔微孔加入150 200&含0.5 3%牛血清白蛋白的0.01 0.05MpH7.4磷酸鹽緩沖液，37""C封閉1.5 0.5h;(d) 洗滌按步驟(b)洗滌3 5次；(e) 保護(hù)加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時(shí)；(f) 干燥微孔板干燥后，即得到抗原預(yù)包被條。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種膝溝藻毒素GTX2，3進(jìn)行檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，該方法包括抗原預(yù)包被條的制備和膝溝藻毒素的檢測(cè)，本發(fā)明利用得到的可分泌抗GTX2，3單克隆抗體的陽(yáng)性細(xì)胞可大量制得抗膝溝藻毒素2，3的單克隆抗體，所建立的方法成本低廉，可快速、簡(jiǎn)便、靈敏地測(cè)定樣品中GTX2，3的含量。本發(fā)明可以大規(guī)模地對(duì)海洋魚(yú)貝類食品中殘留的麻痹性貝類毒素進(jìn)行快速、靈敏的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101196520SQ20071003291
公開(kāi)日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2007年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者向軍儉, 勇 唐, 琦 唐, 楊紅宇, 宏 王, 羅輝武, 賀文妃, 寧 鄧 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)