專利名稱：：3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于免疫學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及一種3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原及其制備技術(shù)。疼足狡不呋喃唑酮，又稱痢特靈，屬硝基呋喃類藥物，為廣譜抗生素，對革蘭陽性及陰性菌均有一定抗菌作用。由于呋喃唑酮價格低廉且抗菌效果好，因此被廣泛應(yīng)用于家禽、家畜、水產(chǎn)類的痢疾、腸炎、球蟲病以及火雞黑頭病的預(yù)防和治療中。但有關(guān)研究證明，硝基呋喃類藥物及其代謝物具有相當(dāng)大的毒性，有致畸胎副作用，且能誘發(fā)癌癥，因而引起了人們的高度重視。1990年7月歐盟頒布2377/90/EEC條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物列為A類禁用藥物，規(guī)定其在動物源性食品中的殘留檢測限為l.O^ig/kg。自1995年起歐盟全面規(guī)定禁止使用呋喃類抗菌物質(zhì)，在動物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。2004年美國FDA公布了禁止在進(jìn)口動物源性食品中使用的ll種藥物名單，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我國農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[2002]1號也規(guī)定動物源性食品中呋喃唑酮的檢出限為不得檢出。因?yàn)橄趸秽愃幬镌幏肿釉隗w內(nèi)很快就代謝，而蛋白結(jié)合態(tài)代謝產(chǎn)物能在組織中存留較長時間，所以在分析此類藥物的殘留時必須分析其代謝后的產(chǎn)物。傳統(tǒng)的硝基呋喃分析方法利用色譜、質(zhì)譜等物化手段定性定量。但這些方法繁瑣、儀器化程度高及分析速度慢，不能滿足及時、快速的檢測要求。免疫學(xué)檢測方法具有簡便、快速、靈敏、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，越來越被關(guān)注。國際權(quán)威學(xué)術(shù)刊物將其列為近年來首位優(yōu)先發(fā)展的新分析技術(shù)。大多數(shù)藥物、毒素、環(huán)境污染物分子質(zhì)量小于1000u，屬于僅有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原。目前制備小分子半抗原抗體的常規(guī)方法為選擇具有毒理學(xué)意義的代謝產(chǎn)物或原形藥物作為待測物，設(shè)計(jì)合成保留待測物分子結(jié)構(gòu)特征并帶有活性基團(tuán)的半抗原，通過共價鍵使半抗原與大分子蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，制備人工免疫原，經(jīng)動物免疫程序制備針對半抗原的特異性抗體。半抗原設(shè)計(jì)為抗體制備的關(guān)鍵所在，也是免疫化學(xué)分析中最為困難的關(guān)鍵步驟。合理的半抗原設(shè)計(jì)將大大提高抗體的質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原，此半抗原偶連載體蛋白后能使機(jī)體產(chǎn)生效價高，特異性好的針對3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物的抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供上述3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原的制備方法。本發(fā)明3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原是3-氨基-2-噁唑烷酮與帶羧基的苯甲醛衍生物氨醛縮合后的產(chǎn)物。上述帶羧基的苯甲醛衍生物優(yōu)選間羧基苯甲醛、2-(4-甲酰基苯氧基)乙酸、式(I)或式(II);其中n為l9的自然數(shù)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(II)所得到的3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原的結(jié)構(gòu)式分別為,0<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(VI)其中n為19的自然數(shù):上述3-氨基-2-噁唑垸酮衍生物半抗原的制備方法，包括以下步驟(1)通過水合肼和環(huán)氧乙垸合成乙醇肼；(2)通過乙醇肼和碳酸二甲酯合成3-氨基-2-噁唑烷酮；(3)將3-氨基-2-噁唑烷酮與帶羧基的苯甲醛衍生物在室溫條件下于甲醇中進(jìn)行氨醛縮合反應(yīng)，即可生成目標(biāo)半抗原。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明針對3-氨基-2-噁唑垸酮衍生物，此半抗原在分子結(jié)構(gòu)，立體化學(xué)和電子分布上與3-氨基-2-噁唑垸酮衍生物對應(yīng)體相似。半抗原結(jié)構(gòu)中的連接臂不易于誘導(dǎo)產(chǎn)生"臂抗體"，并且使用了一定長度的飽和碳鏈，使機(jī)體更易于識別。半抗原分子具有便于與蛋白載體偶聯(lián)的活性基團(tuán)，且活性基團(tuán)的存在對待測物分子的電子分布沒有影響。此半抗原偶連載體蛋白后能使機(jī)體產(chǎn)生效價高，特異性好的針對3-氨基-2-噁唑垸酮衍生物的抗體。具體實(shí)施方式實(shí)施例l乙醇肼制備方法量取1000mL80X水合肼G6.48mo1)至2000mL三口燒瓶中，于-l(TC乙醇浴，攪拌至水合肼冷卻后，緩慢注入100ml液態(tài)環(huán)氧乙烷(2mo1)，反應(yīng)lh后緩慢升高乙醇浴溫度至4(TC，繼續(xù)反應(yīng)lh。將反應(yīng)液95。C減壓蒸餾，得130ml無色油狀液體。實(shí)施例23-氨基-2-噁唑烷酮制備方法稱取乙醇肼11.4g，加入0.5gNaOH及l(fā)ml甲醇，7(TC攪拌均勻后遞加20ml碳酸二甲酯，在帶有蒸餾裝置的反應(yīng)器中反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后加入100ml二氯甲烷，過濾沉淀，10ml二氯甲烷洗漆濾餅。濾液蒸餾剩三分之一時停止，fC冰箱內(nèi)放置結(jié)晶，得2.5g晶體。剩余液體過硅膠柱得5.8g產(chǎn)物，總產(chǎn)率54.3%。實(shí)施例33-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原(III)的制備方法在50ml圓底燒瓶中加入間羧基苯甲醛1.15g，緩慢加入甲醇直至對羧基苯甲醛完全溶解，攪拌下加入0.5g3-氨基-2-噁唑垸酮，室溫攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，蒸餾水洗滌兩遍，甲醇洗漆兩遍，干燥，得0.80g白色粉末狀產(chǎn)物m。HNMR(400MHz，^rDMSO，TMS):(513.12(s，1H，-COOH);8.33(d,/=8Hz,2H，ArH);7.97(s，1H，-N=CH-);7.93-7.96(m，2H，ArH);7.58(t,J:8Hz，2H，ArH);4.51(t，8Hz，2H，-CH2-);3.96(t，J:8Hz，2H，-CH2-)。實(shí)施例43-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原(IV)的制備方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>圓底燒瓶中加入2-(4-甲?；窖趸?乙酸1.06g,緩慢加入甲醇直至對羧基苯甲醛完全溶解，攪拌下加入0.5g3-氨基-2-噁唑垸酮，室溫攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束后過濾，蒸餾水洗兩遍，甲醇洗兩遍，干燥，得0.93g白色粉末狀產(chǎn)物IV。HNMR(400MHz，^-DMSO，TMS):<57.78(s,1H，-N=CH-);7.65(d，/=8Hz，2H，ArH);6.99(d,J:8Hz，2H,ArH);4.73(s,1H，-COOH);4.48(t，/=8Hz,2H，-CH2-);3.92(t，/=8Hz,2H,-CH2-)。實(shí)施例5AOZ衍生物半抗原(V)(11=3)的制備方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>稱取0.68g戊二酸酐，加入無水吡啶10ml，DMAP0.5g和0.24g間羧基苯甲醛，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至55。C反應(yīng)，TLC監(jiān)控。8h后反應(yīng)結(jié)束，減壓蒸出吡啶，殘留固體物用乙酸乙酯溶解，稀鹽酸(pH2.0)洗滌3次，無水硫化鈉干燥，硅膠柱分離(乙酸乙酯:石油醚=1:1)，得產(chǎn)物I(n=3)，產(chǎn)率47%。最后，將產(chǎn)物I溶于5ml甲醇，加入O.2g3-氨基-2-噁唑烷酮，攪拌，2h后反應(yīng)完全，減壓蒸餾出甲醇，殘留固體用水洗滌2次，得0.49g純凈白色粉末狀產(chǎn)物V。HNMR(40OMHz，々DMSO，TMS):<512.12(s，1H，-COOH);7,84(s,1H，-N=CH-);7.60(d，/=8Hz，2H，ArH);7.48-7.52(m,2H，ArH);7.18(d，/=8Hz，2H，ArH);4.51(t/=8Hz，2H,-CH2-);3.95(t，/=8Hz,2H，-CH2-);2.66(t，/:8Hz,2H，-CHr);2.36(t，/=8Hz,2H，-CHr);1,88(p，/=7.41Hz，2H,-CH2-)。實(shí)施例63-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原(VI)(11=3)的制備方法稱取0.68g戊二酸酐，加入無水吡啶10ml，DMAP0.5g，溶解后加入0.24g對羧基苯甲醛，氮?dú)獗Ｗo(hù)狀態(tài)下加熱至55。C反應(yīng)，TLC監(jiān)控。8h后結(jié)束反應(yīng)，減壓蒸餾出吡啶，乙酸乙酯溶解剩余物，稀鹽酸(pH2.0)洗滌3遍，無水硫化鈉干燥，硅膠柱分離(乙酸乙酯石油醚=1:1)，得中間體II(n-3)。最后，將所得中間體n溶于5ml甲醇，加入0.2g3-氨基-2-噁唑烷酮，攪拌，2h后反應(yīng)完全，減壓蒸餾出甲醇，殘留固體用水洗滌2遍，得0.39g白色粉末狀純產(chǎn)物VI。HNMR(400MHz，^j-DMSO，TMS):312.15(s,1H，-COOH);7.83(s，1H，-N=CH-);7.75(d，/=8Hz，2H，ArH);7.22(d，/=8Hz，2H,ArH);4.47(t，J:8Hz，2H，-CH2-);3.93(t，/=8Hz，2H，-CH2-);2.63(t,/=8Hz，2H，-CH2-);2.34(t，J:8Hz，2H，-CH2-);1.83-1.88(m,2H，-CH2-)。實(shí)施例7免疫原IV-BSA的制備及鑒定方法免疫原IV-BSA的制備取半抗原(IV)0.1mmol溶于2mlDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg。4。C下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清夜為A液，稱取BSA140mg溶于10ml濃度為O.lmol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMFlml，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4。C下反應(yīng)12h。離心后，取上清夜，4匸下用生理鹽水透析3d，每天更換3次透析液。得到的全抗原IV-BSA，以lmg/ml的濃度分裝于0.51111離心管中，凍存于-2(TC冰箱中，供免疫用。免疫原IV-BSA結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>IV-BSA免疫原IV-BSA鑒定對載體蛋白BSA，半抗原IV和免疫原IV-BSA進(jìn)行紫外掃描測定(200400nm)，發(fā)現(xiàn)免疫原IV-BSA與BSA和半抗原IV相比，吸收曲線有明顯改變，說明半抗原IV與BSA偶連成功。三硝基苯黃酸法(TNBS)測得半抗原IV與BSA的偶連比為15:1。實(shí)施例8包被原IV-OVA的制備及鑒定方法包被原IV-OVA的制備取半抗原IVO.lmmol溶于2mlDMF中，攪拌加入DCC27.5mg和NHS14.4mg。4。C下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清夜為A液，稱取OVA140mg溶于10ml濃度為O.lmol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMFlml，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4。C下反應(yīng)12h。離心后，取上清夜，4"C下用生理鹽水透析3d，每天更換3次透析液。得到的包被原IV-OVA，以lmg/ml的濃度分裝于0.51111離心管中。凍存于-20。C冰箱中，供包被用。包被原IV-OVA結(jié)構(gòu)如下IV-OVA包被原IV-OVA的鑒定對載體蛋白OVA，半抗原IV和包被原IV-OVA進(jìn)行紫外掃描測定(200400nm)，發(fā)包被原IV-OVA與載體蛋白OVA及半抗原IV相比，吸收曲線有明顯改變，說明半抗原IV與載體蛋白OVA偶連成功。TNBS法測得半抗原IV與載體蛋白OVA的偶連比為12:1。實(shí)施例9多克隆抗體的制備方法及抗體效價測定多克隆抗體的制備將免疫原慢慢解凍，然后加入等量佐劑(第1次免疫用弗氏完全佐劑，以后加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑)。完全乳化后，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳緣靜脈多種注射方式免疫6只體重為2.53kg的健康新西蘭大白兔。第4次加強(qiáng)免疫后l周耳緣靜脈采血，并利用間接ELISA測定血清效價。當(dāng)效價不再上升時，采用耳緣靜脈免疫兔子。1周后心臟采血，室溫靜置0.51h，于4'C冰箱過夜后吸取上層析出的血清?？寡宀捎昧蛩徜@沉淀法純化得到多克隆抗體，透析后冷凍干燥成粉末，于-2CTC下保存?zhèn)溆谩？贵w效價的檢測間接競爭ELISA測定抗體陽性滴度以2.1倍于陰性血清的測定值為準(zhǔn)，測得抗體的陽性滴度為1:320000。實(shí)施例IO抗體親和性及特異性試驗(yàn)將不同濃度的3-氨基-2-噁唑垸酮衍生物——3-(2-硝基苯基亞甲胺基)-2-噁唑烷酮(NPAOZ)與抗體一起進(jìn)行間接競爭ELISA反應(yīng)，測定其抑制率，優(yōu)化條件下，其IC50可達(dá)7.8ng/mL，說明抗體對NPAOZ的親和性好，靈敏度較高。另外，將NPAOZ，鄰硝基苯甲醛，苯甲醛，硝基苯，呋喃它酮，呋喃西林，呋喃妥因配成不同濃度溶液，測定其交叉反應(yīng)率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與同類藥物無交叉反應(yīng)(表1)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基于所設(shè)計(jì)半抗原的免疫原，能有效地誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生靈敏度高、特異性強(qiáng)的抗體。表1.交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1.一種3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原，其特征是3-氨基-2-噁唑烷酮與帶羧基的苯甲醛衍生物氨醛縮合后的產(chǎn)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半抗原，其特征在于所述帶羧基的苯甲醛衍生物為間羧基苯甲醛、2-(4-甲?；窖趸?乙酸、式(I)或式(II);其中n為l9的自然數(shù)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半抗原，其特征在于結(jié)構(gòu)式分別為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中n為19的自然數(shù)。4.權(quán)利要求1所述的半抗原的制備方法，其特征在于包括以下步驟求:(1)通過水合肼和環(huán)氧乙烷合成乙醇肼；(2)通過乙醇肼和碳酸二甲酯合成3-氨基-2-噁唑垸酮；(3)將3-氨基-2-噁唑烷酮與帶羧基的苯甲醛衍生物在室溫條件下于甲醇中進(jìn)行氨醛縮合反應(yīng)，即可生成目標(biāo)半抗原'全文摘要本發(fā)明公開了一種3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物半抗原及其制備方法。它是3-氨基-2-噁唑烷酮與帶羧基的苯甲醛衍生物氨醛縮合后的產(chǎn)物。本發(fā)明針對3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物，此半抗原在分子結(jié)構(gòu)，立體化學(xué)和電子分布上與3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物對應(yīng)體相似。半抗原結(jié)構(gòu)中的連接臂不易于誘導(dǎo)產(chǎn)生“臂抗體”，并且使用了一定長度的飽和碳鏈，使機(jī)體更易于識別。半抗原分子具有便于與蛋白載體偶聯(lián)的活性基團(tuán)，且活性基團(tuán)的存在對待測物分子的電子分布沒有影響。此半抗原偶連載體蛋白后能使機(jī)體產(chǎn)生效價高，特異性好的針對3-氨基-2-噁唑烷酮衍生物的抗體。文檔編號G01N33/53GK101230048SQ200710032840公開日2008年7月30日申請日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者孫遠(yuǎn)明,張世偉,沈玉棟,弘王,肖治理,雷紅濤申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)