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新的單克隆抗體和線蟲幼蟲抗原的制作方法

文檔序號:6115043閱讀:335來源:國知局
專利名稱:新的單克隆抗體和線蟲幼蟲抗原的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及單克隆抗體及線蟲幼蟲抗原。具體地,本發(fā)明涉及對寄生線蟲的第三階段幼蟲(L3)的表面抗原具有特異性的單克隆抗體。
背景技術
線蟲類動物寄生蟲,如羊和牛寄生蟲的群襲現(xiàn)象在農(nóng)業(yè)上具有重要的經(jīng)濟學意義,通常用驅蟲藥給藥治療線蟲感染。
然而,常規(guī)驅蟲藥的主要的缺點是線蟲對大量的驅蟲藥產(chǎn)生抗性變得越來越廣泛,因而產(chǎn)生嚴重困憂(Waller,1997;Sangster et al,1999;Van Wyk et al,1999)。
已有許多假設試圖解釋線蟲被驅除出免疫羊的腸道的機理(Rothwell 1989)。有證據(jù)表明速發(fā)型超過敏反應因素與其有關,在該反應中,抗原刺激IgE敏感性粘膜柱細胞而使可能影響線蟲存活的化合物在粘液積累(Miller 1996;Emery等1997)。粘液的抗線蟲屬性與化學介質(Douch等1983;Jones等1990)及抗體(Lee&Ogilvie 1981;Miller 1987;Carlisle等1991)的存在有關。最近本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過多次截短型感染使羊體免疫后,獲取其腸道粘液與幼蟲混合,后注入初次接受免疫的羊的十二指腸,能夠改變幼蟲形成的模式(Harrison等1999)。從對蛇形毛園線蟲(Trichostrongylus colubriforriis)具免疫力的羊的小腸中收集粘液,發(fā)現(xiàn)其具有抗線蟲活性,將其與幼蟲通過十二指腸導管注入初次接受免疫的羊后,其使線蟲在體外結塊,從而顯著減少了羊體內幼蟲形成的數(shù)目。
免疫印跡表明免疫粘液內含有IgG和IgA抗體,它們對分子量約為35kDa的抗原具有識別優(yōu)勢。從培養(yǎng)在免疫粘液中的幼蟲的表面洗脫得到的抗體也與線蟲勻漿物印跡上的35kDa的抗原反應。免疫熒光檢測法和免疫金電鏡顯微實驗表明該35kDa的抗原存在于L3的上表皮,在向L4蛻變過程中減少。在蟲卵、L1、L2、L4及成蟲上不存在該抗原,僅僅在感染前及感染后5天內的L3提取物中發(fā)現(xiàn)。該結果表明抗體與幼蟲表面結合防止了幼蟲在其偏好部位生長,并將它們清除出腸道。用部分純化的35kDa的抗原免疫羊,蛇形毛園線蟲感染后的蟲卵數(shù)目顯著下降,這表明該抗原在疫苗方面的潛在用途。
制備稱為PAB-1的單克隆抗體(PAB-1單抗,MAb PAB-1)來對抗幼蟲表面抗原。PAB-1單抗與羊粘液抗體均識別35kDa的蛇形毛圓線蟲幼蟲的抗原,且與捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)和環(huán)頸奧斯他胃蟲(Ostertagia circumcincta)寄生性線蟲的L3提取物印跡上的一種具有相似分子量的抗原及古巴毛樣線蟲(Cooperia curticei)和匙狀細頸毛樣線蟲(Nematodirus spathiger)的L3提取物的抗原印跡上的22kDa的抗原發(fā)生交叉反應。這表明其他線蟲種屬上也存在具有免疫潛力的通用表面抗原,該抗原被PAB-1單抗識別。35kDa的幼蟲抗原及相關分子可能是宿主免疫應答的新靶標,因此可在抗線蟲感染的疫苗或在其他免疫療法中使用。
PAB-1單克隆抗體在標準親和色譜法中可用來純化表面抗原。用連結于諸如瓊脂糖、瓊脂糖凝膠(sepharose)等固相支持物上的PAB-1單克隆抗體與L3粗提物中的表面抗原結合,使用低pH值的緩沖液可將表面抗原從抗體基質上洗脫出來,經(jīng)SDSPAGE電泳法顯示得到的表面抗原基本已提純。通過此法提純的表面抗原以羊的免疫粘液抗體印跡法檢測,并可用檢測糖類的方法進行染色。
已知35kDa的幼蟲抗原及其相關大分子具有糖優(yōu)勢結構,該抗原對蛋白激酶K消化具有抗性的原因是因為其在膠中不被敏感的蛋白染色劑染色;而被糖類染色劑染色,且能被諸如生物素-酰肼等的糖類標記試劑標記。
因此,PAB-1單抗可能可用于鑒別及分離表面抗原以研制抗線蟲感染的疫苗或其他免疫療法。
感染了蛇形毛圓線蟲的羊的血清及腸道粘液中含有能識別35kDa幼蟲抗原及其相關分子的抗體,因此,當存在針對幼蟲抗原的抗體時,表明感染了寄生蟲;所以,PAB-1單抗可能可用于鑒定動物感染的有效工具。
包括任何專利或專利申請在內的所有本說明書引用的參考文獻均在此被引為參考,這并不是認可任何參考文獻都構成現(xiàn)有技術。關于參考文獻提及的其作者的主張的討論,申請人保留對所引用文獻的準確性及妥當性提出質疑的權利。需要清楚解釋的是,雖然一些現(xiàn)有技術的文獻在此被涉及,但是并不認為這些文獻在新西蘭或任何其他國家已經(jīng)成為該領域的公知知識。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一方面提供了分離的單克隆抗體mAb PAB-1,該抗體已于2002年1月24日在ATCC保藏,登記號為PTA-4005,其能與線蟲L3表面抗原結合。
本發(fā)明的第二方面提供了如上所述的分離的單克隆抗體,其中該抗體與源自蛇形毛圓線蟲L3的抗原結合,且還原條件下該抗原在SDS PAGE膠中約35kDa處出現(xiàn)條帶。
本發(fā)明的第三方面提供了如上所述的分離的單克隆抗體,其與L3的表面抗原結合,該表面抗原選自a)古巴毛樣線蟲(C.curticei)上的表面抗原,其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約46kDa處和約22kDa處出現(xiàn)條帶;b)匙狀細頸毛樣線蟲(N.spathiger)上的表面抗原,其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約22kDa處出現(xiàn)條帶;c)捻轉血矛線蟲(H.contortus)上的表面抗原,其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約35kDa處和約22kDa處出現(xiàn)條帶;及d)環(huán)頸奧斯他胃蟲(O.circumcincta)上的表面抗原,其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約35-39kDa處出現(xiàn)條帶;e)T.axei或T.vitrinus上的表面抗原,其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約35kDa處出現(xiàn)條帶;f)結節(jié)線蟲(O.ostertagi)上的表面抗原,其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約30-45kDa處出現(xiàn)條帶;g)C.oncophera上的表面抗原,其在還原條件下在SDSPAGE凝膠中約20kDa處和約45kDa處出現(xiàn)條帶;h)巴西奴卡菌(N.brasiliensis)上的表面抗原,其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約9kDa處和約12kDa處出現(xiàn)條帶;i)D.eckerti上的表面抗原,其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約30kDa處出現(xiàn)條帶;本發(fā)明的第四方面提供了如上所述的分離的單克隆抗體,其中當該抗體與固體支持物連結時,其能用于通過免疫親和色譜法純化表面抗原。
本發(fā)明的第五方面提供了源自線蟲L3的分離的糖表面抗原,其中該抗原能與的單克隆抗體mAb PAB1結合,該單克隆抗體已于2002年1月24日在ATCC保藏,登記號為PTA-4005。
最優(yōu)選的所述抗原在1M NaOH中對沸騰有抗性。
本發(fā)明的第六方面提供了分離的與上述抗原基本上一致的抗原,其中該抗原在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在20-35kDa間出現(xiàn)條帶;或基本上在9kDa和12kDa處出現(xiàn)條帶。
本發(fā)明的第七方面提供了分離的與上述抗原基本上一致的抗原,其中該抗原源自蛇形毛圓線蟲L3。
本發(fā)明的第八方面提供了一種分離的與上述抗原基本上一致的抗原,其中該抗原源自線蟲L3,該線蟲L3分離自古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環(huán)頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節(jié)線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
本發(fā)明的第九方面提供了含有與上述抗原基本上一致的抗原和藥學上或獸學上可接受的載體或稀釋劑的組合物。
本發(fā)明的第十方面提供了與上述抗原基本上一致的抗原的用途,該用途是生產(chǎn)用于預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性的組合物。
本發(fā)明的第十一方面提供了與上述組合物基本上一致的組合物用于受線蟲感染的易感羊體以預防、治療線蟲感染或降低其感染易感性的用途,這些線蟲選自蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環(huán)頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節(jié)線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
本發(fā)明的第十二方面提供了與上述組合物基本上一致的組合物,該組合物用于除羊之外的易感動物以預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性;其中這些其它種類的線蟲也具有可通過與上述單克隆抗體PAB-1反應來檢測的幼蟲表面抗原。
優(yōu)選地,這些其它種類動物可是任何易感于線蟲感染的如前所述的動物,還可以是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、馬、豬、犬、貓、雞、?;蚵沟取?br> 本發(fā)明的第十三方面提供了與上述組合物基本上一致的組合物,其中該組合物還含有至少一種佐劑或細胞因子。
本發(fā)明的第十四方面提供了診斷易感動物線蟲感染的方法,該方法包含如下步驟a)自動物上獲得血液樣品;b)通過合適的檢驗方法,分析血樣是否存在抗本發(fā)明第三方面所述抗原的抗體。
優(yōu)選地,所述的檢驗方法可是ELISA或western印跡法,但這并不能看作是對可用的其它方法的限制。
本發(fā)明的第十五方面提供了與上述抗體基本相同的分離的抗體,其中該抗體來源于動物的胃腸道粘液,這些動物用選自下列的線蟲的截短型感染(truncated infection)免疫蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環(huán)頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節(jié)線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
本發(fā)明的第十六方面提供了通過用本發(fā)明的組合物給藥來預防或治療動物線蟲感染的方法。
本發(fā)明的第十七方面提供了本發(fā)明的抗原用于在羊或其他易感動物的腸道粘液內引起抗體反應以預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性的用途。
本發(fā)明的第十八方面提供與上述單克隆抗體基本一致的抗體用于檢測羊體內線蟲感染的用途。
術語“分離的”的意思是指本發(fā)明的單克隆抗體或糖已經(jīng)從原始環(huán)境中移離,并與提供該抗體或糖的天然系統(tǒng)中的所有或部分共存物質分離。
術語“L3”指的是線蟲生活周期中特定的幼蟲發(fā)育階段。
除非在上下文中另有指定,35kDa抗原一般指具有基本相同分子量的蛇形毛圓線蟲抗原。術語“易感動物”是指容易感染線蟲,如蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環(huán)頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節(jié)線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti的羊,或指容易感染那些具有用所述PAB-1單抗檢測出的抗原的線蟲的其他動物。
本發(fā)明的單克隆抗體是一種能夠識別寄生性線蟲L3上的糖類表面抗原的單克隆抗體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),該單克隆抗體與用蛇形毛圓線蟲免疫的羊的腸道粘液中存在的抗幼蟲抗體具有相同的特異性。能產(chǎn)生單克隆抗體mAb PAB-1的雜交瘤于2002年1月24日在ATCC保藏,相應的登記號為PTA-4005。
下文用通用的非限制性術語對本發(fā)明的抗體鑒定步驟進行了簡要描述。
容易遭受線蟲感染的羊自出生至4月齡在無線蟲環(huán)境中飼養(yǎng)成長,四月齡時一些既定數(shù)目的動物被施以一系列的蛇形毛圓線蟲截短型感染致免疫。其它的免疫羊繼續(xù)在無線蟲條件下飼養(yǎng)成長。優(yōu)選地,所用的羊在一段時間內被進行3次截短型感染,每次感染在經(jīng)歷一段既定的時限后停止。優(yōu)選地,這一既定的時限是14天,再次感染的時間約是前次結束后7天,但是這些時限的數(shù)值不應該視為限制。
最后一次感染結束后,屠殺羊,取其小腸內的粘液。這基本上按照Harrison et al,1999的描述進行,但是該方法不應視為限制,其理由是也可以應用其他的一些方法。未感染的未感染羊的粘液也如上法取得。
一旦獲得粘液樣品,分析免疫的和未感染的羊的粘液未感染羊樣品以觀察蛋白差異。例如用SDS PAGE凝膠及Coomassie藍、銀染分析。
然后特征鑒定粘液抗體,優(yōu)選地通過免疫印跡均勻混合抗原和碳針檢測免疫的及未感染羊的粘液樣品進行檢測。檢測抗體的結合時,可以通過與商業(yè)上可用的抗羊免疫球蛋白產(chǎn)生的并與酶結合的抗血清反應來進行。優(yōu)選地,結合的該抗體可以通過RAS/IgG-HRP法檢測。
可以通過下法制備L3均勻混合物在適合的清潔劑或變性劑的存在或不存在的情況下,借助機械手段或化學手段將任何一種在此列出的寄生性線蟲的出鞘的(exshealthed)L3裂解;隨后以離心和/或過濾法使提取物澄清。
最優(yōu)選地,可以通過裂解冷凍于液氮的蛇形毛圓線蟲的出鞘的L3來制備均勻混合物,即用研鉢及乳槌將冷凍的L3研磨直至裂解。隨后將幼蟲的組分提取入中性緩沖液,如含有1~2%諸如CHAPS、去氧膽酸鈉、脲或SDS等助溶劑的、pH7.5的50mM的Tris-HCl緩沖液。以100,000×g離心提取物1小時,或用孔徑逐漸變小,如5.0μM至0.2μM的系列濾膜過濾來使其澄清。
制備單克隆抗體mAb PAB的方法可以是任何合適方法,如Kohler及Milstein(1975)所述的方法。
例如,可以從聚丙烯酰胺凝膠片上切下35kDa片段,用同體積的不完全油佐劑浸泡并混合,然后給藥到需要免疫的動物的腹腔、皮下或腳墊等位置,所述動物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、馬、豬、犬、貓、雞、?;蚵沟?。這些動物中優(yōu)選小鼠。
諸如脾細胞、淋巴細胞、外周血細胞等的抗體產(chǎn)生細胞,可以從免疫動物上收集,與骨髓瘤細胞(一種腫瘤細胞株)融合后形成雜交瘤。優(yōu)選脾細胞作為抗體產(chǎn)生細胞。
細胞融合用的骨髓瘤細胞優(yōu)選那些與免疫動物異源的細胞系,但是各種動物的細胞系均可使用。
優(yōu)選地,NS-1細胞可以用作骨髓瘤細胞,但是這不應該視為對本發(fā)明范圍的限制。
雖然本發(fā)明所述的單克隆抗體一般是一種通過雜交瘤產(chǎn)生的抗體,但是通過諸如血漿酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等不具降解抗原結合位點(Fab)能力的蛋白水解酶與抗體相互作用獲得的抗體片段,如Fab,F(xiàn)(ab’)2,F(xiàn)acb等,或通過分子克隆技術生產(chǎn)的抗體片段均包括在本發(fā)明的單克隆抗體之內,條件是只要它們具備本發(fā)明的單克隆抗體的性質。
本發(fā)明的糖類表面抗原存在于蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環(huán)頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節(jié)線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti的L3表面。
下文用通用的非限制性術語對本發(fā)明的抗體鑒定步驟進行了簡要描述。
本發(fā)明的糖類表面抗原可以從此處列出的線蟲L3提取物中分離出。優(yōu)選地,糖類抗原從如上所述的蛇形毛圓線蟲L3的提取物中分離。PAB-1單克隆抗體先與固體支持介質相連結,優(yōu)選地與蛋白A-瓊脂糖或蛋白G-并共價連結以防止抗體從凝膠上脫落。
隨后將凝膠裝塞入色譜柱,采用L3提取物。用中性緩沖液沖洗后,優(yōu)選用含有0.05%Tween 20的PBS沖洗以防止非特異性結合后,用高pH值或低pH值或高鹽水平的洗脫緩沖液使結合的糖類抗原從柱上洗脫,優(yōu)選地,用pH 2.5-2.8的甘油-鹽酸緩沖液洗脫抗原。洗脫后糖類抗原的pH值可以用添加1M Tris的方法提高到中性,隨后電泳法和免疫羊粘液抗體的印跡法進行進一步分析鑒定該糖類抗原。用檢測糖類的銀染法染色和結合糖類的生物素-酰肼試劑進行印跡,可以檢測糖類抗原的性質。
本領域的技術人員能夠理解其他檢測糖類的方法也可以使用,這些方法包括但不限于凝集素結合、HPLC、TLC、熒光基團輔助的糖電泳、MS及NMR。
制備藥劑組合物的方法及藥學載體是本領域內公知的,正如教科書Remington’s Pharmaceutical Sciences,19th Edition,
Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,USA)所述。
本發(fā)明所述物質、疫苗或組合物可以用任何合適的途徑給藥,本領域的技術人員能夠容易地根據(jù)治療的情況確定最合適的給藥途徑及劑量。劑量由相關的內科醫(yī)生或獸醫(yī)審慎判斷后決定,取決于治療情況的狀態(tài)和性質、治療對象的的年齡、總體健康狀況、給藥途徑及給藥的前期治療。
所述的載體或稀釋劑、及其他賦形劑取決于給藥途徑,本領域的普通技術人員根據(jù)個案能夠容易地確定最合適的配方。
為了實現(xiàn)本說明書的目的,很明顯“包含”一詞的意思是“包括但不局限于”,與“含有”的意思相同。


通過實施例并參考如下附圖,下文將對本發(fā)明的其它方面座更清除的說明。
圖1顯示了在將幼蟲與不同量的未感染羊粘液或免疫羊粘液共孵育后在未感染的羊中的幼蟲數(shù)量;圖2顯示了顯示了在將幼蟲與未感染羊粘液或免疫羊粘液共孵育不同時間后在未感染的羊中的幼蟲數(shù)量;圖3顯示了用未感染的或免疫的粘液中的L3混合物灌輸未感染的受體羊后未感染羊的最近部分和最遠部分的幼蟲數(shù)量;圖4顯示了在免疫不同時間后免疫粘液的抗幼蟲活性;圖5顯示了免疫的和未感染的粘液的SDS PAGE分析結果;圖6顯示了免疫的和未感染的粘液的植物凝集素印跡結果,AUEA-1(α-L-果糖) BJAC(α-gal-Me-吡喃糖苷)CWGA(N-乙酰氨基葡萄糖) DLL(甘露糖,葡萄糖);
圖7顯示了免疫的和未感染的粘液的植物凝集素印跡結果,其中箭頭表示70和28KDa。
APNA(β-半乳糖-N-乙酰氨基半乳糖)BEcorA(β-半乳糖-N-乙酰氨基半乳糖)CSBA(N-乙酰氨基半乳糖)DECA(β-半乳糖-N-乙酰氨基半乳糖);圖8顯示了免疫的和未感染的粘液的植物凝集素印跡結果,其中箭頭表示55和27KDa。
ASNA(唾液酸)B用RAS/IgG-HRP免疫印跡探查圖9顯示了蛇形毛園線蟲L3抗原的免疫印跡結果,其中的L3抗原用免疫羊(第1、5、10、11、12和19道)或未感染羊(第13-18道)的腸粘液、免疫粘液的100000×g離心上清(第3道)、從蛋白G-瓊脂糖純化出的免疫粘液上清(第4和7道)、從出鞘的蛇形毛園線蟲L3洗脫出的抗體(第6和20道)、來自免疫羊的硫酸胺沉淀的腸道內腔液體的抗體(第8和9道)探測。第2道顯示了用膠體金著色的蛇形毛園線蟲L3蛋白,用RAS/IgG-HRP檢測IgG抗體(第1-18道),用MAS/IgA,接著用RAS/IgG-HRP檢測IgA抗體(第19和20道);圖10顯示了用未感染的或免疫的粘液探查的蛇形毛園線蟲L3抗原的免疫印跡結果,抗原帶與未感染的粘液或免疫的粘液反應,然后與RAS/IgG、抗IgG1的mAB、抗IgG2的mAB、抗IgA的mAB、抗IgM的mAB反應;圖11顯示了蛇形毛園線蟲L3抗原,古巴毛樣線蟲L3抗原和匙狀細頸毛樣線蟲L3抗原的免疫印跡結果;其中Tc L3抗原(第1-8道)、Cc L3抗原(第9-12道)和Ns L3抗原(第13-16道)的免疫印跡結果,用Tc免疫羊的粘液(第2、3、5、9、13道),Ns免疫羊的粘液(第6、10、14道),Ns免疫羊的腸內容物的硫酸胺沉淀(第7、11、15道),Ns免疫羊的血清(第8、12、16道)探查。第1道用吸收了260000只出鞘的Tc L3后的Tc免疫羊的粘液探查;第4道用膠體金蛋白染色著色的Tc L3抗原。箭頭指示35或22KDa抗原的抗原。用As/lg-HRP檢測抗體。
圖12顯示了捻轉血矛線蟲(第1道)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(第2道)、匙狀細頸毛樣線蟲(第3道)、古巴毛樣線蟲(第4道)和蛇形毛園線蟲(第5道)的L3的抽提物的免疫印跡分析的結果;其中用Tc免疫羊的粘液探查后通過TAS/lgG-HRP印跡,箭頭表示35KDa抗原的位置。
圖13顯示了蛇形毛園線蟲L3抗原的腸粘液IgG和IgA抗體滴度與抗感染保護作用的關系;其中相對于對照幼蟲減少的百分率;圖14顯示了腸粘液中的IgG和IgA抗體滴度隨時間的推移逐漸降低;圖15顯示了與免疫的或未感染的粘液反應的出鞘的蛇形毛園線蟲L3(上圖),并顯示了在感染并與免疫粘液反應后第5天收集的蛇形毛園線蟲的幼蟲(下圖);圖16顯示了在與未感染的(A)或免疫的(B)粘液反應后出鞘的蛇形毛園線蟲L3的電子顯微照片。圖C-F顯示了在感染并與免疫的粘液反應后第2、3、4或5天收集的蛇形毛園線蟲的幼蟲;圖17顯示了對蛇形毛園線蟲卵漸近線SDS PAGE和免疫印跡分析的結果。圖A、C和D與免疫粘液反應,圖B是銀染色蛋白;圖A和B第1道,Tc卵;第2、3、4道,在體外生長1、3和7天的幼蟲;第5道,卵;第6-14道,在體外生長1-9天的幼蟲。圖C第1道,卵;第2、3、4道,在體外生長1、3和5天的幼蟲;第5道,在8℃下生長6個月的L3;第6道,L4(感染后第14天);第7-9道,成蟲。圖D第1和2道,出鞘的13;第3和5道,鞘;第6和7道,L4(感染后第14天);第8-13道,成蟲。
圖18顯示了感染前和感染后不同時間的蛇形毛園線蟲L3的SDS PAGE和免疫印跡分析結果;圖A第1和7道,第1天的幼蟲;第2和8道第2天的幼蟲;第3和9道第3天的幼蟲;第4和10道,第4天的幼蟲;第5和11道,第5天的幼蟲;第6和12道,第14天的幼蟲。圖B第1和5道,感染前的L3;第2和6道,第5天的幼蟲;第3和7道,第6天的幼蟲;第4和8道,感染后第7天的幼蟲;圖19顯示了與免疫粘液或單克隆抗體PAB-1反應的蛇形毛園線蟲L3抽提物和蛋白酶K消化的L3抽提物的免疫印跡分析結果;用mAB PAB-1(A)或免疫羊粘液(B)探查的蛋白酶k消化的Tc L3抽提物(第1-4道)和Tc L3抽提物(第5和6道)的免疫印跡分析結果,用RAM/lgG-HRP(A)或RAS/lgG-HRP檢測抗體;圖20顯示了來自與單克隆抗體PAB-1反應的5個線蟲種的L3抗原抽提物和蛋白酶K消化的L3抽提物的印跡分析結果;箭頭是35和22KDa;第1道蛇形毛園線蟲;第2道匙狀細頸毛樣線蟲;第3道古巴毛樣線蟲;第4道捻轉血矛線蟲;第5道環(huán)頸奧斯他胃蟲;圖21顯示了與對照的單克隆抗體(左和中間的圖)或與單克隆抗體PAB-1(右圖)反應的出鞘蛇形毛園線蟲L3的表面熒光;圖22顯示了Tc幼蟲表面抗原的分析結果,該抗原用單克隆抗體PAB-1進行免疫親和色譜來純化;第1和2道從mAb柱洗脫的抗原,針對蛋白或糖(第3和4道)銀染色;第5-8道從mAb柱洗脫的抗原,用免疫羊粘液的抗體探查;第9和12道TcL3抽提物,針對蛋白(9)或糖(12)銀染色;第10和11道從mAb柱洗脫的抗原的抽提物,針對蛋白(10)或糖(11)銀染色;第13和15道,用生物素-酰肼原位標記的Tc L3抽提物;第14道從mAb柱洗脫的用生物素-酰肼原位標記的抽提物。箭頭指示lg重鏈和輕鏈或35KDa表明抗原的位置;圖23顯示了加熱、氧化、消化或用有機溶劑沉淀后的蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫印跡分析結果;經(jīng)過不同處理的TcL3抗原的免疫印跡第1道未處理的對照;第2和第10道37℃下加熱18h;第3道37℃下高碘酸氧化24h;第4道37℃下鏈霉蛋白酶消化22h;第5道37℃下脂酶消化22h;第6、7、8、9道用TCA、丙酮、氯仿甲醇或己烷-異丙醇處理后的沉淀抗原;圖24顯示了用蛋白酶或脂酶消化后蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果;37℃下與下列物質共孵育22h小時后Tc L3抗原的免疫印跡,第1道僅緩沖液;第2道胰島素;第3道胃蛋白酶;第4道鏈霉素蛋白酶;第5道蛋白酶K;第6道木瓜蛋白酶;第7道谷草桿菌蛋白酶;第8道裂解酶;第9道脂肪酶;第10道溶菌酶;第11道磷脂酶A2;第12道磷酸肌醇-磷脂酶C;第13道磷脂酶D;圖25顯示了用蛋白酶消化后蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果;與下列物質37℃孵育3h后Tc L3抗原的免疫印跡第1道胰蛋白酶E;第2道膠原酶;第3道蛋白酶K+SDS;第4道蛋白酶K,無SDS;Tc L3抗原與下列物質在50℃下共孵育18h;第5道僅緩沖液;第6道蛋白酶K+SDS、DTT和EDTA;第7道蛋白酶K+SDS和EDTA;第8道蛋白酶K+SDS、DTT和Ca++;第9道蛋白酶K+SDS和Ca++;圖26顯示了用糖苷酶消化后蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果;在37℃與N-糖苷酶共孵育22h后,Tc L3抗原和胎球蛋白對照糖蛋白的免疫印跡分析結果;第1道未處理的胎球蛋白;第2道胎球蛋白+N-糖苷酶F;第3和5道Tc L3抗原;第4道Tc L3抗原+N-糖苷酶F;通過與地高辛標記的植物凝聚素SNA反應后與抗地高辛-HRP反應,檢測印跡上的胎球蛋白;用免疫粘液和RAS/lgG-HRP檢測Tc抗原;圖27顯示了顯示了堿分解后蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果;Tc L3抗原在60℃下堿降解18h;第1道抗原對照(僅加熱);第2道抗原+1M NaOH;第3道抗原+1MNaOH和8M NaBH4;左圖用免疫羊粘液的抗原探查和RAS/lgG-HRP的印跡;右圖銀染色;圖28顯示了加熱或堿或酸分解后蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫印跡分析結果;第1道僅在緩沖液中100℃處理16h;第2道4℃下氫氟酸處理48h;第3道100℃肼處理16h;第4道20℃肼處理1h;圖29顯示了加熱或堿或酸分解后蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果;第1道100℃下肼處理7天;第2道4℃下肼處理14天;第3和4道三氟乙酸處4h或16h;第5道未處理對照;圖30顯示了加熱或堿分解或蛋白酶消化后蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫分析結果;第1和2道蛋白酶K+SDS在50℃下處理4小時或20小時;第3和6道1.0M NaOH在37℃下處理18小時;第4道90℃下加熱20min,然后1.0M NaOH在37℃下處理18小時;第5和9道對照抗原在37℃下處理18小時;第7道0.5M NaOH在37℃下處理18小時;第8道0.1M NaOH在37℃下處理18小時;第10道37℃下用胰蛋白酶消化22小時;第11道對照抗原在50℃下處22小時;第12道蛋白酶K+SDS+DTT在50℃下處理22小時;第13道90℃下加熱20min,然后37℃下加熱18h;第14道90℃下加熱20min,然后胰蛋白酶消化18小時;用免疫粘液探測印跡然后經(jīng)過RAS/lgG-HRP;圖31顯示了在原始條件下或在脲或去氧膽酸鈉存在的條件下電泳后蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫印跡分析和蛋白染色結果;在僅緩沖液(左圖)、6M脲(中間圖)或1%脫氧膽酸鈉(右圖)中溶解并電泳的Tc L3凝膠電泳和免疫印跡分析;膠用Coomassie藍著色,印跡用免疫粘液探測后經(jīng)過RAS/lgG-HRP;第1、5和8道蛋白標記;其它道含有溶于合適樣品緩沖液重點Tc L3抽提物;圖32顯示了在二維電泳后蛇形毛園線蟲L3抽提物的免疫印跡分析和蛋白染色結果;用Coomassie藍著色(上圖)或用免疫粘液和RAS/lgG-HRP探查的Tc L3脲抽提物的二維電泳;箭頭表示35KDa抗原的位置;圖33顯示了在6只其它線蟲的L3抽提物中存在糖著色分子;圖中顯示了10個寄生性線蟲L3的NaOH抽提物的免疫印跡分析和糖染色結果;圖A印跡與Tc免疫羊的腸粘液反應后與抗羊lgG-HRP反應;圖B膠用糖類銀染色法著色;第1道Hc,第2道Oc;第3道Ta;第4道Tc;第5道Tv;第6道Ns;第7道Cc;第8道Oo;第9道Co;第10道Nb;第11道De;箭頭表示35kDa抗原的位置;圖34顯示了蛇形毛園線蟲L3抽提物(L3)和在非變性條件下(無去污劑或還原劑)電泳純化的糖基幼蟲抗原(C)的凝膠電泳(8%PAGE)和免疫印跡分析結果。針對蛋白質或糖對膠進行染色;印跡與mAb PAB-1反應后與兔抗鼠lg-HRP結合,或者與羊粘液反應后與兔抗鼠lgG-HRP結合。
具體實施例方式
1.材料與方法
1.1截短型感染對羊的免疫所有的羊的實驗均按照Wallaceville動物倫理委員會的規(guī)定進行。Romney羊自出生開始就在無線蟲的條件下成長,圈養(yǎng)并飼以市售羊飼料,干草及水,自由進食。羊在進行免疫感染時至少4月齡。以40000只蛇形毛圓線蟲L3截短型感染免疫羊,至少進行三次。每次感染均在14天后通過口腔灌喂奧芬達唑(Systamex,Schering Plough Ltd.,4.5mg kg-1)中止,羊在灌喂7天后重復進行感染操作。在一些實驗中,羊還被給予第四次的感染(加強劑量),此時不用灌喂給藥法中止,而是在加強給藥2-3天后將羊屠殺。
1.2.采樣羊以槍殺及放血法被屠殺。羊的小腸被打結成5米的片段,每個片段用4×150毫升的生理鹽水沖洗以收集幼蟲。為了供生化分析及體內注射用,收集小腸前6米處的粘液,以哈里森(Harrison等1999)所述的方法改良后處理,改良如下述。在輕柔地用100毫升生理鹽水淋洗去除腸的內容物后,在4℃放置小腸2小時,然后以拇指和食指用力擠壓小腸使流出粘液,隨后以2×5毫升的生理鹽水洗滌。收集粘液和洗液,并以哈里森(Harrison等1999)所述方法處理,貯存在-20℃。
對于進行了4次截短型感染的羊,在最后一次免疫后的第3,16,35天收集粘液的活組織檢查樣本。在手術時,定位十二指腸并用手術鉗輕柔夾取分離一段5厘米的片段。應用具鈍端的18規(guī)格的針頭注入3毫升生理鹽水。液體前后搖蕩10次使粘液與生理鹽水混合后,取樣2-3毫升。縫合切口,使羊逐漸康復。
1.3不同方法處理對粘液體外活性的影響通過幼蟲結塊實驗評價粘液結合幼蟲的能力,將2000只出鞘的L3放入一個置于振動平臺的Eppendorf管中,37℃下與0.4毫升的粘液共孵育。四小時后,檢驗樣本并估算幼蟲結塊的程度,以與未感染的粘液或生理鹽水共孵育的L3為對照,與對照比較。
免疫粘液以多種不同的方法處理,然后分析其幼蟲結塊的效力。等分取1毫升免疫粘液IP5置于4℃生理鹽水中透析24小時,在10000×g、10000×g或100000×g下離心,60℃加熱或100℃加熱5分鐘,在10mM的DTT中還原或烷基化1小時,然后在冰上與20mM碘乙酰胺反應30分鐘,再以pH7.4的TBS水解過夜,以除去多余的鹽分。以胃蛋白酶處理時,粘液以1M HCl調節(jié)pH至4.5,在3毫升粘液中加入含3毫克胃蛋白酶的pH4.5的0.1M乙酸緩沖液,于振動平臺上37℃共孵育20小時,加Tris至濃度為2M令反應停止。以蛋白水解酶處理時,于每毫升粘液中加入溶于pH7.5的0.1M Tris的1毫克鏈蛋白酶,于振動平臺上37℃共孵育20小時,反應通過加入蛋白水解酶抑制劑而停止。粘液以脂肪酶處理時,每毫升粘液用1毫克的脂肪酶處理,于pH7.2的PBS中37℃下孵育20小時,然后冷凍貯存。粘液氧化處理時,以醋酸調節(jié)pH值至4.5,加入高碘酸鹽于pH4.5的50mM醋酸鈉緩沖液中至120mM,并于室溫攪拌下避光孵育2小時,加入硼氫化鈉至50mM,攪拌下孵育1小時。超濾粘液時,將5毫升免疫粘液IP5稀釋至250毫升的pH7.2的PBS中,然后在Filtron 100000mw的膜上濃縮至5毫升,隨后將濾液在10000mw的膜上濃縮至5毫升,然后將濾液在3000mw的膜上濃縮至5毫升。凍干低mw膜的濾液,重溶于5毫升的蒸餾水中,置入1000mw管中蒸餾水透析。
通過上述步驟處理后,冷凍儲存粘液樣品直至測定。
1.4體內粘液實驗40000只出鞘的L3與2.5-10ml未感染羊體積的免疫羊或未感染羊的粘液共孵育24小時,然后通過一個特別的外科植入導管(Harrison等.1999)注入到未經(jīng)線蟲感染的羊的十二指腸。一周后殺死羊,對每5米小腸片段內的生長的線蟲的數(shù)目進行計數(shù)。
40000只出鞘的L3于37℃下與10ml體積的免疫羊或未感染羊的粘液,或與經(jīng)100000×g離心后的2×10ml體積的粘液上清共孵育4小時。未感染羊孵育后取一等分的未感染羊及免疫羊的上清在200×g離心3分鐘以沉淀幼蟲。立即去除上清,以10ml生理鹽水清洗L3,如上法離心,去除上清,將L3在10ml生理鹽水重混懸。每10ml未感染羊等量的液體通過十二指腸管注入未感染羊腸道。一周后,殺死羊,計幼蟲數(shù)目。
1.5粘液生化分析以SDS-PAGE法和Coomassie藍染未感染羊或銀染染色法分析免疫羊組和未感染羊組樣品的蛋白差異。以凝集素印跡法檢查糖基化的差異,其中凝集素以生物素標記,以抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶檢測。粘液中IgG的存在與否通過RAS/IgG-HRP印跡法顯示。
1.6粘液抗體的特征鑒定對免疫羊及未感染羊的樣品進行L3均勻混合抗原的免疫印跡法探查。抗體的結合通過對羊的IgG1,IgG2,IgA,及IgM的RAS/IgG-HRP或mAb檢測及隨后的GAM/Ig-HRP法進行測定。
出鞘的L3與粘液上清在37℃下孵育4小時,用45%硫酸銨從粘液中沉淀抗體,或用蛋白G從粘液中純化抗體。孵育后幼蟲用TBS-Tw清洗3次,通過在pH 2.4的0.1M甘油-鹽酸緩沖液中孵育5分鐘洗脫全部結合態(tài)抗體。洗脫液以1M tris中和,用于探查Tc,Ns,Cc中的L3抗原的印跡。
體積為500毫升的免疫羊腸道內容物用45%硫酸銨處理以回收抗體。在透析后將抗體用于探查L3抗原,從蛋白G-Sepharose上洗脫的粘液上清或粘液抗體與幼蟲共孵育2小時,用TBS-Tw清洗3次后,與FITC-RAS/IgG反應。清洗后用熒光顯微法檢查幼蟲。
幼蟲在羊經(jīng)感染后的不同時間收集,用上述免疫熒光及免疫印跡法和免疫金電鏡檢查法進行分析。將幼蟲固定在BGPA固定劑(90℃的含1%戊二醛及15%飽和苦味酸的0.1M磷酸緩沖液)中。埋入部分以蛋白G純化的粘液抗體進行染色,隨后用金標記抗羊抗體。
用于體內感染實驗的粘液樣本的抗體滴度以EIA法估算。微滴度板以Tc L3抗原包被,并與粘液稀釋液反應。經(jīng)清洗后,結合態(tài)抗體通過對羊的IgA的RAS/IgG-HRP或mAb檢測及隨后的GAM/Ig-HRP法進行測定。
1.7單克隆抗體PAB-1的制備小鼠以含有Tc幼蟲表面抗原的多聚酰胺凝膠膠片進行免疫,該抗原在膠中的位置通過印跡相鄰泳道和檢測所述的粘液抗體來確定。浸泡含有抗原的凝膠膠片,將其與等量的不完全油佐劑混合,并注射入小鼠,共注射2次,每次相隔兩周。十天后取受試血液,篩選Tc L3抗原的粗產(chǎn)品,并對表面抗原進行部分純化。采用制備單抗的標準方法將陽性反應最強的小鼠的脾細胞與NS-1細胞融合,使用ELISA及印跡法進行初級和次級篩選以證實特異性。制備出的大量mAb PAB-1培養(yǎng)物,以等分在-20℃保存。
用單克隆抗體PAB-1探查幼蟲抗原的印跡,用RAM/IgG-HRP檢測結合態(tài)抗體。在90℃加熱出鞘的幼蟲20分鐘使其固定,與PAB-1反應,以TBS-Tw全面清洗,與RAM/IgG-FITC反應,并在紫外光下檢驗。針對非相關蛋白(羊細胞因子)的且具有相同PAB-1亞型的單克隆抗體用作陰性對照。
1.8幼蟲抗原的免疫親和純化單克隆抗體與蛋白A-瓊脂糖反應從而使該抗體結合,在PBS清洗去除未結合抗體之后,結合態(tài)抗體通過與交聯(lián)劑DSS(disuccinimidyl suberate)反應而永久地固定在蛋白A上。再次清洗后,L3提取物流過用含有0.05%Tween 20的PBS液全面清洗過的PAB-1-蛋白A-瓊脂糖柱,以pH2.5的0.2M甘油-鹽酸液洗脫全部的結合抗原。洗脫液以1M Tris中和,在pH8.0的5mM Tris中透析,在Speedvac濃縮器中濃縮??贵w柱以PBS全面清洗重平衡。
從柱上洗脫的抗原樣本以SDS PAGE法及印跡法分析(圖23)。凝膠中的糖類以改良銀染法檢測(Kittelberger等,1993);印跡上的糖類以生物素-酰肼反應法檢測(Bouchez-Mahiout等,1999)。
1.9幼蟲抗原的特征鑒定將出鞘的Tc L3以液氮冷凍,以研鉢及鉢槌磨碎,蛋白質以2%Chaps+2%Tween 20、1%脫氧膽酸鈉、2%SDS,或9M脲溶解提取。提取物在10000g離心,上清在-20℃下貯存。蟲卵、L1、L2、成蟲線蟲直接溶解于SDS PAGE樣品緩沖液(含有2%SDS,20mM DTT的pH6.8的50mM Tris-HCl)中。將SDS抗原提取物用于電泳法及印跡法研究,將Chaps及脲提取物用于二維電泳,脲提取物在pH 7.4的50mM tris-HCl中透析2天后,去除脲,隨后進行化學或酶學處理??乖?jīng)適當方法溶解后,也僅在緩沖液,即0.5%DOC或6M urea中進行電泳。
在Tc L3脲提取物的二維電泳分析中,在以IPGphor(Pharmacia)固定于pI3-10長條的IEF上進行,隨后行SDS PAGE電泳。蛋白質或以Coomassie藍染/銀染,或與粘液抗體印跡發(fā)生反應來檢測抗原。Tc L3脲溶解抗原以上述方法透析,通過加入等體積的10%TCA、10倍體積的冷凍丙酮、9倍體積的氯仿∶甲醇(2∶1)或9倍體積的己烷∶異丙醇(3∶2)來使其沉淀。漩渦樣品并振動10分鐘,隨后在10000g離心10分鐘,并應用免疫印跡法分析離心出的沉淀,通過化學法及酶法降解分析糖??乖?0mM的高碘酸在37℃處理24小時,或在60℃以1M NaOH及8M NaBH4處18小時。樣品在電泳之前進行透析??乖?00℃下以肼處理7和14天,或在4℃下以三氟乙酸處理4和16小時,隨后化合物用一個Speedvac離心機揮發(fā),剩余的抗原重溶解在SDS PAGE樣品緩沖液中。將各種酶溶解于生產(chǎn)商推薦的緩沖液中,并在37℃下與抗原溫浴22小時以進行酶消化。所用的酶是N-糖苷酶F,胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,鏈霉蛋白酶,蛋白水解酶K,枯草桿菌蛋白酶,脂肪酶,溶菌酶,彈性蛋白酶,膠原蛋白酶,磷酸肌醇-磷脂酶C,磷脂酶A2,磷脂酶D。顯色底物酪蛋白-試鹵靈及彈性蛋白-剛果紅作為顯示蛋白酶及彈性蛋白酶的活性的對照。在一個實驗中,抗原在90℃下加熱變性20分鐘,隨后以胰蛋白酶或氫氧化鈉消化。在0.5%SDS、15mM DTT、50mM EDTA或2mM CaCl2存在或不存在的條件下于50℃下維持18小時來進行蛋白酶K的消化。捻轉血矛線蟲、環(huán)頸奧斯他胃蟲、古巴毛樣線蟲和匙狀細頸毛樣線蟲的幼蟲提取物也在相似的條件下用蛋白酶K處理。
1.10用35kDA的抗原進行的免疫用溶于含有Span 85、Tween 85及蓖麻油(比例是5.4∶4.6∶90)的菜油佐劑中的35kDa抗原,對5只12月齡的Romney羊進行腹腔注射,如每2周一次,共3次??乖瓘碾娪痉蛛x出的Tc L3凝膠膠片上得到。電泳后將每一個凝膠的條帶轉印到硝酸纖維素上與免疫粘液反應以檢測35kDa的抗原。用RAS/IgG-HRP進一步處理后,將印跡與凝膠的主要部分重新一一對應,切下與35kDA抗原位置相對應的凝膠片段。將取下的膠片置入裝有100mM pH7.8的trisHCl的透析管中,將透析管置入轉印槽中在50v下維持3小時以對凝膠中的抗原進行電洗脫。收集多個洗脫液,通過BCA實驗估計蛋白產(chǎn)出率約是0.2mg/ml。用Ultraturrax超聲勻漿器將抗原與同等量的菜油佐劑相混合。每一只羊每次注射時接受0.2毫克左右的總蛋白量,但是糖類抗原的量未知。對照羊腹腔注射生理鹽水加佐劑。在第三次注射結束2周之后所有的羊通過口服感染40000只Tc L3。在感染3-4周后獲取糞便中蟲卵計數(shù)資料。
2.結果2.1.體外實驗所有的粘液或經(jīng)不同處理的粘液在體外引起幼蟲結塊的能力如表1所示,結果顯示透析或低速離心不影響免疫粘液使幼蟲結塊的能力,100000×g離心使幼蟲結塊的效應降低,但是洗滌劑Tx-100或CHAPS存在時例外。粘液在60℃加熱5分鐘后使幼蟲結塊的能力仍然存在,但是在100℃加熱后消失。粘液經(jīng)蛋白酶消化或高碘酸氧化之后失去活性,但是脂肪酶消化無失活作用。這種幼蟲結塊作用與粘液中大分子量的成分相關。
2.2.體內實驗L3與遞增體積的粘液共孵育后使未感染受體羊中的幼蟲排出或數(shù)目減少的效應如圖1所示。幼蟲與5或10毫升未感染羊的粘液共孵育后仍然能夠在小腸前5米腸段正常生長。與免疫羊的粘液共孵育的幼蟲隨共孵育粘液體積的增加而逐漸地移位或消失。與未感染羊的粘液相比較,與10毫升免疫羊粘液共孵育的幼蟲的生長數(shù)目減少82%,且在腸道的前5米腸段幼蟲排出率達100%。
L3與10毫升粘液共孵育不同時間后的效果如圖2所示。幼蟲與免疫羊粘液共孵育的時間低至1小時的情況下,幼蟲的生長數(shù)目減少46%,且在腸道的前5米腸段處幼蟲排出率達81%。共孵育的時間為4,10,24小時時的減少超過94%,排出超過93%。
L3與16份未感染羊的粘液樣品及25份免疫羊的粘液樣品共孵育后對幼蟲生長的效應如圖3所示。總體上,接受L3+免疫羊粘液的受體的幼蟲減少率達67%(范圍0-95%);給予L3+免疫羊粘液的羊的腸道前5米腸段的幼蟲生長率減少80%(p<0.001)。
粘液收集時間對其抗幼蟲性質的影響如圖4所示。在最后一次以幼蟲免疫2-3天后收集到的粘液的活性大致上比一周后或更晚時刻收集的粘液的活性強。回歸分析表明免疫后粘液收集時間與其保護作用間呈顯著的陰性相關關系。
L3與未感染羊或免疫羊粘液的經(jīng)清洗/未經(jīng)清洗過的100000×g離心上清共孵育后的效應如表2所示。結果顯示L3與未感染羊粘液的上清或經(jīng)清洗后的上清共孵育后能夠在未感染的受體羊上生長。與此相反,L3與免疫羊粘液的上清或經(jīng)清洗后的上清共孵育后大部分不能夠在未感染羊接受者上生長,與未感染羊粘液組相比較數(shù)目減少了91%。
2.3粘液生物化學粘液的電泳分離結果如圖5所示。免疫羊及未感染羊粘液的蛋白總體情況高度復雜,兩系列的粘液間未見清楚明了的差異,凝集素印跡也表明兩系列顯示含有糖基的粘液都具有復雜的糖蛋白性質(圖6,7,8)。另外凝集素對免疫羊粘液或未感染羊粘液的結合的差異也不明顯,而花生凝集素對大部分的免疫羊樣品在與Ig的重鏈及輕鏈對應的約70000及28000mw處染色增強(圖7A)。然而,當粘液與RAS/IgG-HRP反應時,所有樣品均見55000及27000的主要條帶,其可能與IgG的重鏈及輕鏈對應(圖8B)。
2.4粘液印跡用粘液或自粘液回收的抗體探查Tc L3的免疫印跡結果如圖9所示。6個未感染羊的樣本(第13-18道)不與L3抗原反應。免疫羊的粘液樣本主要和35kDa的條帶反應,且兩只羊的腸內容物通過硫酸銨沉淀得到的抗體的表現(xiàn)與此相同(第8,9道)。免疫羊粘液上清在蛋白G-瓊脂糖上純化后的抗體以及L3與免疫羊粘液共孵育后酸透析得到的抗體也與35kDa條帶反應(第4,7道及第6,20道)。接受3次Tc截短型感染的羊的血清還包括識別35kDa抗原和許多其他抗原的抗體(未顯示)。與35kDa條帶反應的粘液抗體的亞型特異性如圖10所示。存在IgG1及IgA型抗體,但是IgG及IgM未檢出。
用Tc免疫羊粘液探查腸道感染性線蟲匙狀細頸毛樣線蟲(Ns)和古巴毛樣線蟲(Cc)的L3抗原提取物的免疫印跡結果發(fā)現(xiàn)它主要與22kDa的條帶反應(圖11,第9,13道)。接受Ns截短型感染的羊的粘液與Ns及Cc的抗原反應(第12及16道),也與Tc的35kDa條帶反應(第8道)。將260000只出鞘的Tc L3與2ml免疫粘液共孵育使粘液內抗體完全消失(第1道)。用膠體金蛋白染色法檢測印跡上的蛋白(第4道),在與免疫粘液的抗體檢測相對應的區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)染色(第3,4道)。腸道線蟲匙狀細頸毛樣線蟲及古巴毛樣線蟲和胃線蟲捻轉血矛線蟲及環(huán)頸奧斯他胃蟲的L3提取物以Tc免疫羊粘液探查,發(fā)現(xiàn)在Tc和Hc的35kDa處,Oc的39kDa處Cc的46kDa和22kDa和Ns的22kDa發(fā)生發(fā)應(圖12)。圖33示腸道線蟲T.axei(Ta)、T.vitrinus(Tv)、結節(jié)線蟲(Ooi)、C.oncophera(Co)、D.eckerti(De)、胃線蟲捻轉血矛線蟲(Hc)及環(huán)頸奧斯他胃蟲(Oc)的1M NaOH提取物以Tc免疫羊粘液探查的結果,顯示在Ta、Tv和Hc的35kDa處,Oo的45,35,33和30kDa處,Co的45kDa和20kDa,Nb的12kDa和9kDa處,以及De的30kDa處發(fā)生反應。
粘液IgG及IgA抗體滴度與粘液體內給予時所提供的保護作用之間的相互關系以線性回歸法分析(圖13)??筁3抗原的IgG及IgG抗體的滴度與其保護作用之間存在著明顯的關系(R2=0.6,P<0.01)粘液活組織檢查發(fā)現(xiàn)樣本的抗體滴度自免疫3天后達到高水平(圖14),然而,IgG及IgA的滴度到16天后下降,但是至免疫后第37天時仍然處于高于基線的水平。
幼蟲的免疫熒光染色結果如圖15所示。出鞘的L3在與免疫羊粘液共孵育后顯示強的表面熒光,但是與未感染羊的粘液共孵育并不能(上圖)。在感染羊2,3,4天后獲得的幼蟲也顯示出表面染色(未圖示),但是感染第5天許多幼蟲不被抗體染色,且發(fā)現(xiàn)一些處于蛻皮階段(下圖)。蛻皮的L3的表皮與來自免疫羊粘液的抗體反應,但是出現(xiàn)的L4不被染色。在感染的6,7天獲得的L4不顯示表面染色。
免疫金電鏡檢查的結果與此類似,L3階段在表皮出現(xiàn)表面標記(圖16,B)。感染后第2天再觀察金標記,在第3,4天變弱,第5天消失(分別見圖C,D,E和F)。
在蟲卵、L1、L2、L3、及免疫羊感染不同時間后獲取的幼蟲的抗原提取物以粘液抗體探查進行免疫印跡(圖17及18)。L3在感染前至感染5天后發(fā)現(xiàn)存在35kDa的抗原,但是在蟲卵期、L1或L2、感染后7~14天的L4、或線蟲成蟲上無此抗原。
2.5PAB-15單克隆抗體PAB-1單克隆抗體及Tc免疫羊粘液的抗體與Tc L3抗原的印跡反應的對比在圖19中顯示。單抗在35kDa處與主要的Tc L3抗原,在30-40kDa處與離散抗原和一些更低分子量的抗原反應。
其他種屬的線蟲的抗原的鑒定結果如圖20所示。腸道線蟲匙狀細頸毛樣線蟲和古巴毛樣線蟲及胃線蟲、捻轉血矛線蟲和環(huán)頸奧斯他胃蟲的L3提取物以單克隆抗體PAB-1探查,發(fā)現(xiàn)在Tc及Hc的大約35kDa處,Oc的39kDa處,Cc的46kDa及22kDa處,Ns的22kDa處發(fā)生反應(圖20)。將L3提取物用蛋白酶K消化后,以取自免疫羊粘液的抗體或單克隆抗體MAB-1進行免疫印跡發(fā)現(xiàn)該酶不消化幼蟲抗原(圖19和20)。
以抗鼠FITC結合物染色與出鞘的Tc L3反應的mAb PAB-1,發(fā)現(xiàn)了強的表面熒光(圖21),IgG3對照單抗不與幼蟲表面反應。
2.6幼蟲抗原的免疫親和純化使用鍵合在蛋白A-瓊脂糖上的單抗PAB-1來免疫親和純化幼蟲抗原的結果如圖22所示。對洗脫物進行銀染發(fā)現(xiàn)沒有蛋白染色帶在幼蟲抗原的可能電泳區(qū)域出現(xiàn)。在洗脫物中檢測出一個單一的糖染色條帶,其位置與以免疫羊粘液抗體免疫印跡法檢出的抗原在相同的分子量的位置上。用一種能與經(jīng)高碘酸氧化后暴露的糖基相結合的生物素-酰肼試劑也在原位標記了該條帶。
2.7幼蟲抗原的特征鑒定
L3抗原的各種化學或酶處理對35kDa抗原與粘液抗體的免疫印跡反應的影響如圖23-30所示??乖?7℃下加熱18小時對其中的35kDa抗原的免疫印跡反應無影響(圖23,第2道),用高碘酸或脂肪酶處理輕微降低信號強度(圖23,第3,5道),但是鏈霉蛋白酶無作用(第4道),35kDa抗原在酸沉淀或溶劑沉淀后發(fā)現(xiàn)存在于沉淀物中(第6-9道)。
以胰蛋白酶,胃蛋白酶,蛋白水解酶K,磷脂酶A2處L3抗原使印跡反應變得更加分散,但是不降低分子量(圖24,第2,3,5,11道)。以木瓜蛋白酶,枯草桿菌蛋白酶,裂解酶處理L3抗原引起信號強度降低,但是不改變分子量(第6-8道)。鏈霉蛋白酶,脂肪酶,溶菌酶,磷酸肌醇-磷脂酶C,磷脂酶D沒有作用(第4,9,10,12,13道)。以彈性蛋白酶處理產(chǎn)生分子量稍微降低的條帶(圖25,第1道)。膠原蛋白酶、蛋白水解酶K在37℃下無作用(第2,3,4道)。在多種條件下蛋白水解酶K在50℃處理18小時也不能毀壞35kDa抗原,仍能夠在印跡上檢測到(第6-9道)。以N-糖苷酶F處理L3抗原引起35kDa抗原印跡信號強度降低,但是不改變分子量(圖26,第4道),而在此條件下對照糖蛋白胎球蛋白被降解(第2道),這說明酶具有活性。以1M氫氧化鈉在60℃處18小時后,印跡上分子量稍微降低的條帶的數(shù)目增加,但是在35kDa處的反應仍然是主要的(圖27,第2道)。用NaOH加NaBH4處理,銀染后未見任何的蛋白,但是35kDa抗原的印跡反應與對照抗原比較未見減弱(圖27,第3道)。
L3抗原以氫氟酸在4℃處理48小時,或以酰肼在20℃處理16小時不能毀壞35kDa抗原(圖28)。以酰肼在100℃處理7或14天,與未處理的對照抗原相比印跡的強度降低(圖29,第1,2道)。以氫氟酸處理4或16小時毀壞了抗原(圖29,第4,5道)。
如免疫印跡所示(圖30),L3抗原以下列程序處理不能毀壞35kDa抗原蛋白酶K+SDS在50℃下處理4小時或20小時(第1及2道);0.1-1.0M NaOH在37℃下處理18小時(圖30,第3,6,7,8道);在90℃下進行20分鐘的熱變性,然后以1M NaOH消化(第4道);不論其是否在90℃下進行了20分鐘的熱變性都在37℃下用胰蛋白酶消化22小時(第10及14道);蛋白酶K+SDS+DTT在50℃下處理22小時(第12道)。來自5個種屬的線蟲的L3抗原以蛋白酶K消化都不能破壞35kDa抗原,或其他種屬的46、35或22kDa的交叉反應抗原(圖20)。
Tc L3提取物在原生條件下和在0.5%DOC或6M脲存在下以電泳法及印跡法分析。抗原在此條件下電泳出高分子量的模糊帶(圖32)。向樣品加入還原劑(20mM DTT)和電泳緩沖液不改變這些結果(未圖示)。
Tc L3脲提取物進行二維電泳分析顯示了35kDa處的強免疫印跡反應,其超出pH3-10范圍(圖33)。盡管印跡強度大,但相應區(qū)域未見蛋白。
3.6羊免疫實驗FEC(糞便線蟲計數(shù))數(shù)據(jù)如表3所示。在感染3周后,組間FEC無顯著差異,但是免疫組第四周的計數(shù)顯著下降(p<0.05)。綜合兩周的計數(shù)值,免疫組FEC總值具顯著的下降(p<0.05)。
圖34顯示了蛇形毛圓線蟲L3提取物及純化的糖類幼蟲抗原(c)在非變性條件(無洗滌劑及還原劑)下的凝膠電泳(8%PAGE)及免疫印跡分析結果。凝膠進行了蛋白質或糖染色。印跡與PAB-1單抗反應后,與兔抗鼠Ig-HRP結合物或免疫羊粘液反應,最后與免疫羊Ig-HRP結合物反應。
表1.免疫羊粘液經(jīng)不同處理后的體外抗L3活性

*結塊分值+++=大部分幼蟲成大團狀結塊;++=一些結塊;+=輕微結塊;-=無結塊。
表2.L3與未感染羊/免疫羊的粘液、經(jīng)100000×g離心的粘液上清或經(jīng)上述離心后清洗過的上清共孵育,注入未感染的受體羊一周后小腸5米腸段內生長的蛇形毛圓線蟲幼蟲的數(shù)目

*%與未感染羊的粘液的總計量相比幼蟲數(shù)目的減少量。
表3.用35kDA抗原免疫的羊的FEC數(shù)據(jù)

與對照有明顯差別(P<0.023,Kruskall-Wallis測試)3.討論免疫羊粘液影響線蟲存活的能力已經(jīng)在先期的工作中發(fā)現(xiàn),如果將幼蟲與粘液共孵育,幼蟲出篩遷徙就會受抑制(Douch等1983)。最近我們觀察到幼蟲與免疫粘液共孵育后常成團結塊,且這種幼蟲若通過十二指腸導管注入未感染羊后不能正常生長(Harrison等1999)。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了本研究,結論性地表明免疫粘液能夠有效防止幼蟲生長,這種對感染的保護程度取決于免疫后收集粘液的時間及劑量。抗體下降的水平與時間的關系在粘液或組織檢查樣本中可以觀察到,該樣本取自免疫5星期后的截短型感染羊。免疫粘液的100000×g離心上清也能防止幼蟲生長,該發(fā)現(xiàn)表明這種作用存在于粘液的可溶性成分中,而不是由于粘液的物理阻礙性,如粘性引起。共孵后清洗幼蟲并不影響免疫粘液上清防止幼蟲生長的效果,這表明活性因子與幼蟲發(fā)生了結合。
免疫粘液經(jīng)透析、離心或分子篩過濾處理后體外進行幼蟲結塊分析,結果表明其結塊能力與粘液中的高分子量成分相關。熱處理、蛋白酶消化表明結塊需要粘液中的蛋白組分。然而,SDSPAGE分析及Coomassie藍染/銀染法檢測蛋白并沒有發(fā)現(xiàn)免疫羊和未感染羊樣品組中的粗蛋白存在差異。與此相似,凝集素印跡法也未發(fā)現(xiàn)兩組粘液的糖蛋白組分存在差異。例外的是免疫粘液樣本中的花生凝集素,其可以檢測到存在于重鏈及輕鏈上的糖,重鏈為70kDa,表明IgA存在。印跡法也顯示了所有粘液樣本中存在IgG。
上述發(fā)現(xiàn)和免疫粘液中存在IgG及IgA表明是識別線蟲抗原的抗體導致了幼蟲結塊并在體內提供保護。以免疫粘液探查幼蟲抗原的免疫印跡發(fā)現(xiàn)存在IgG1及IgA抗體,這些抗體主要與主抗原的35kDa反應,也和9、12、20、30-45kDa的離散區(qū)域反應。重要的是,與免疫粘液共孵育后,用從完整出鞘幼蟲中洗脫下的抗體探查L3抗原的印跡也表明該抗原是優(yōu)勢反應抗原。這些結果與表面熒光染色法及免疫金電鏡法的結果一起說明了抗原表型存在于幼蟲表面,抗35kDa抗體存在于用于體內感染實驗的粘液樣本中,而且IgG、IgA的滴度與免疫粘液提供的保護程度存在明顯相關。蛇形毛圓線蟲免疫羊的粘液抗體也識別其它腸道線蟲古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、T.axei、T.vitrinus、結節(jié)線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌、D.eckerti和胃線蟲捻轉血矛線蟲及環(huán)頸奧斯他胃蟲的幼蟲提取物印跡上的抗原。這種交叉反應顯示其他種屬線蟲表面存在與蛇形毛圓線蟲抗原功能類似的表面分子,可以是免疫反應的標靶。PAB-1單抗也與這些抗原反應,因此能用來鑒定與純化這些種屬寄生性線蟲的表面抗原。所有產(chǎn)生交叉反應的受試抗原對蛋白酶K的消化具有抗性的發(fā)現(xiàn)證明了它們同樣也不是蛋白質,而是與蛇形毛圓線蟲的35kDa抗原的性質相似。
與蛋白A-瓊脂糖相連結的PAB-1單抗能純化蛇形毛圓線蟲幼蟲表面抗原,發(fā)現(xiàn)這種蛇形毛圓線蟲幼蟲表面抗原主要是糖類,這通過其對蛋白酶K等蛋白酶消化具有抗性,對糖基進行銀染改良法染色和用能與暴露的糖基結合的生物素-酰肼試劑標記得到證實。該抗原不被諸如銀染/Coomassie藍染法等的蛋白質檢測術所染色。該抗原對脂肪酶降解有抗性,且不溶于有機溶劑,這表明脂類成分不存在或不能進入。用N-糖苷酶F處理不影響抗原,這說明糖不是N-連接的,或者說明酶不能進入而產(chǎn)生攻擊作用。堿處理或酰肼廣泛水解不毀壞抗原,表明其糖結構不常見。以三氟乙酸進行強酸水解,抗原遭毀壞。
以PAB-1單抗探查蛇形毛圓線蟲幼蟲提取物,觀察到印跡上的低分子量抗原以階梯狀條帶形式出現(xiàn)多級條帶圖案,這表明35kDa抗原的結構含有由更小單元組成的多聚體。但是,在存在于幼蟲表面時的原生狀態(tài)下,抗原是一個高分子量的復合物,正如非變性條件下進行的電泳結果所顯示。將該復合物溶解于SDS+DTT使其降解為一種在印跡的35kDa處能檢測到的抗原,表明該復合物是一種35kDa抗原的多聚物或35kDa抗原與其他未明組分的異聚體。該抗原在以等電聚焦分離時顯示出帶電異質性,這再次說明它是一個復雜的結構。上述結果表明了這種存在于幼蟲外表面的分子復合物可能對線蟲宿主的胃腔、腸道內所能有的物理條件所致的降解具有抗性。線蟲表面抗原的這些性質所隱含的功能性作用尚未確定,但是個復合物可能在幼蟲通過宿主系統(tǒng)內的敵對環(huán)境達到其嗜好的小腸時發(fā)揮臨時保護作用。35kDa抗原僅僅在L3感染前直至感染后5天內出現(xiàn),這表明這種覆層是幼蟲通過胃腔時保護所需要的。當在小腸內蛻皮成L4過程中,由于不需要,因而這種保護性覆層蛻離。很明顯針對該保護性覆層的免疫反應能嚴重損壞線蟲在宿主體內成功生長的能力,因此對線蟲控制具有廣泛意義。在對羊的初級疫苗試驗中,用含有部分純化35kDa抗原和油佐劑的疫苗對動物免疫,與對照組比較,免疫組的糞便蟲卵數(shù)量顯著減少。
本發(fā)明的所有方面僅以實施例的形式描述,需說明的是,在不超出所附權利要求的范圍的情況下可以對其進行的修改與增加。
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權利要求
1.分離的單克隆抗體mAb PAB-1,于2002年1月24日在ATCC保藏,登記號為PTA-4005,其能夠與線蟲L3表面的抗原結合。
2.如權利要求1所述的分離的單克隆抗體,其中該抗體與源自蛇形毛圓線蟲(T.colubriformis)L3的抗原結合,且在還原的條件下該抗原在SDS PAGE凝膠中約35kDa處出現(xiàn)條帶。
3.如權利要求1所述的分離的單克隆抗體,其與L3的表面抗原結合,該表面抗原選自a)古巴毛樣線蟲(C.curticei)上的表面抗原,其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在46kDa處和22kDa處出現(xiàn)條帶;b)匙狀細頸毛樣線蟲(N.Spathiger)上的表面抗原,其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在22kDa處出現(xiàn)條帶;c)捻轉血矛線蟲(H.contortus)上的表面抗原,其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在35kDa處出現(xiàn)條帶;d)環(huán)頸奧斯他胃蟲(O.circumcincta)上的表面抗原,其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在約35-39kDa處出現(xiàn)條帶;e)T.axei或T.vitrinus上的表面抗原,其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在35kDa處出現(xiàn)條帶;f)結節(jié)線蟲(O.ostertagi)上的表面抗原,其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中基本上在30-45kDa處出現(xiàn)條帶;g)C.oncophera上的表面抗原,其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在20kDa處和約45kDa處出現(xiàn)條帶;h)巴西奴卡菌(N.brasiliensis)上的表面抗原,其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在9kDa處和約12kDa處出現(xiàn)條帶;i)D.eckerti上的表面抗原,其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在30kDa處出現(xiàn)條帶。
4.如權利要求1所述的分離的單克隆抗體,其中當該抗體與固體支持物連結時,其能用于通過免疫親和色譜法純化表面抗原。
5.源自線蟲L3的分離的糖表面抗原,其中該抗原能與單克隆抗體mAb PAB1結合,該單克隆抗體已于2002年1月24日在ATCC保藏,登記號為PTA-4005。
6.基本上如權利要求5所述的分離的抗原,其中該抗原在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在20-35kDa間出現(xiàn)條帶,或基本上在9kDa和12kDa處出現(xiàn)條帶。
7.如權利要求5所述的分離的抗原,其中該抗原源自蛇形毛圓線蟲L3。
8.如權利要求5所述的分離的抗原,其中該抗原源自線蟲L3,該線蟲L3分離自古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環(huán)頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitriyzus、結節(jié)線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌或D.eckerti。
9.含有如權利要求5所述的抗原和藥學上或獸學上可接受的載體或稀釋劑的組合物。
10.如權利要求5所述的抗原在制備用于預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性的組合物的用途。
11.如權利要求9所述的組合物用于受線蟲感染的易感羊,以預防、治療線蟲感染或降低其感染易感性,這些線蟲選自蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環(huán)頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節(jié)線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
12.如權利要求9所述的組合物,該組合物用于除羊之外的易感動物以預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性,其中這些其它種類的線蟲也具有可通過與上述單克隆抗體PAB-1反應來檢測的幼蟲表面抗原。
13.如權利要求9所述的組合物,其中的組合物還包含至少一種佐劑或細胞因子。
14.診斷易感動物線蟲感染的方法,該方法包括如下步驟a)自動物獲得血液樣品;b)通過合適的檢驗方法,分析血樣是否存在抗如權利要求3所述抗原的抗體。
15.如權利要求3所述的分離的抗體,其中該抗體來源于動物的胃腸道粘液,這些動物用選自下列的線蟲的截短型感染免疫蛇形毛園線蟲、古巴毛樣線蟲、匙狀細頸毛樣線蟲、捻轉血矛線蟲、環(huán)頸奧斯他胃蟲、T.axei、T.vitrinus、結節(jié)線蟲、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
16.通過用如權利要求9所述的組合物給藥來預防、治療動物線蟲感染或降低線蟲感染易感性的方法。
17.如權利要求5-8中任一項所述的抗原用于在羊或其他易感動物的腸道粘液內引起抗體反應以預防、治療線蟲感染或降低線蟲感染易感性的用途。
18.如權利要求1-3中任一項所述的抗體用于檢測羊體內線蟲感染的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及到分離的單克隆抗體mAb PAB-1,該抗體于2002年1月24保藏于ATCC,登記號為PTA-4005,其能與線蟲L3的表面抗原結合。本發(fā)明還涉及到能與該單克隆抗體結合的抗原以及該單克隆抗體和抗原在診斷和治療或預防線蟲感染方面的應用。
文檔編號G01N33/53GK1966524SQ20061009901
公開日2007年5月23日 申請日期2003年1月30日 優(yōu)先權日2002年1月30日
發(fā)明者加文·伯納德·李爾·哈里森, 韋恩·羅伯特·海恩, 休·道格拉斯·普爾福德, 查理·比克斯·舒梅克 申請人:奧維塔有限公司
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