專利名稱：采用秀麗線蟲檢測(cè)可溶性重金屬持久性毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
采用秀麗線蟲檢測(cè)可溶性重金屬持久性毒性的方法，涉及一種采用秀麗線蟲對(duì)可溶性重金屬進(jìn)行涵蓋多個(gè)連續(xù)世代的持久性暴露，從而檢測(cè)該重金屬在長(zhǎng)期、低濃度條件下的毒性效應(yīng)的方法。屬于環(huán)境保護(hù)、生態(tài)毒理學(xué)研究、生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)對(duì)外界環(huán)境的變化非常敏感，環(huán)境脅迫會(huì)改變它們的生殖速度、生命周期等發(fā)育特征以及其他行為學(xué)特征。毒理學(xué)研究經(jīng)常采用秀麗線蟲作為毒性測(cè)試模式動(dòng)物，但是對(duì)于低濃度、連續(xù)性地暴露多個(gè)世代周期的持久性毒性的研究并沒(méi)有先例。用秀麗線蟲測(cè)定藥品與個(gè)人護(hù)理品類物質(zhì)世代毒性的方法已經(jīng)有所研究，其方法涉及不同世代的秀麗線蟲經(jīng)過(guò)相同的暴露后的效應(yīng)之間的比較，雖然能夠?qū)χ亟饘僭谑来g的毒性效應(yīng)得到一定的比較結(jié)果，但是該效應(yīng)及其比較結(jié)果相對(duì)于真實(shí)環(huán)境依舊存在差異和不足，主要表現(xiàn)在其一，暴露時(shí)間的不連續(xù)，每一世代的線蟲其生命周期只有某一段時(shí)間接受暴露，并不是全生命階段的暴露，尤其是沒(méi)有涵蓋秀麗線蟲對(duì)外界環(huán)境變化更加敏感的、從蟲卵到成蟲的發(fā)育階段；其二，并不能夠反映實(shí)際環(huán)境下食物與重金屬共存的真實(shí)條件，已有研究表明，食物能夠改變秀麗線蟲對(duì)重金屬的響應(yīng)，不考慮食物對(duì)秀麗線蟲的影響并不能夠?yàn)檎鎸?shí)環(huán)境條件下的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行有力的說(shuō)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種采用秀麗線蟲檢測(cè)可溶性重金屬持久性毒性的方法，具體是以蟲卵作為起始受試生物，確定了不影響蟲卵正常孵化的蟲卵起始濃度，以及能夠滿足其生長(zhǎng)發(fā)育所需的食物起始濃度，在暴露時(shí)間、暴露劑量尤其是食物與重金屬共存等方面更加貼近實(shí)際環(huán)境暴露情形，與現(xiàn)有采用秀麗線蟲進(jìn)行毒性測(cè)試方法比較，具有明確的針對(duì)性，對(duì)模擬實(shí)際環(huán)境暴露情形下的毒性研究方法進(jìn)行了補(bǔ)充和擴(kuò)展。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用秀麗線蟲對(duì)重金屬進(jìn)行涵蓋多個(gè)連續(xù)世代的持久性暴露，從而檢測(cè)該重金屬在長(zhǎng)期、低濃度條件下的毒性效應(yīng)。本發(fā)明確定了不影響蟲卵孵化的蟲卵起始濃度，以及能夠滿足其生長(zhǎng)發(fā)育所需的食物起始濃度，在暴露時(shí)間、暴露劑量尤其是食物與重金屬共存等方面更加貼近實(shí)際環(huán)境暴露情形。本發(fā)明所用秀麗線蟲以及 E. coli 0P50均由復(fù)旦大學(xué)發(fā)育生物學(xué)研究所惠贈(zèng)。具體包括如下步驟A，依照傳統(tǒng)急性毒性測(cè)試方法，以秀麗線蟲成蟲作為受試生物，測(cè)得該可溶性重金屬的急性LC5tl值，在急性LC5tl值的1/10下設(shè)置4個(gè)濃度梯度，其中包括3個(gè)重金屬濃度， 1個(gè)空白對(duì)照；其中，測(cè)定LC5tl的具體步驟是按照B步驟獲得同步化的卵液，在覆有E. coli 0P50并37°C培養(yǎng)過(guò)24h的NGM固體培養(yǎng)基上，置于20°C培養(yǎng)48h，獲得同步化的秀麗線蟲成蟲，然后以96孔板為染毒環(huán)境，向每孔中加入15條秀麗線蟲成蟲，染毒24h后采用體視顯微鏡對(duì)96孔板中的秀麗線蟲進(jìn)行觀察，蟲體僵直且對(duì)輕微觸碰無(wú)反應(yīng)則認(rèn)定其死亡，分別記錄秀麗線蟲成蟲的總數(shù)與死亡數(shù)，計(jì)算死亡率；若所設(shè)定的濃度梯度沒(méi)有同時(shí)涵蓋30% 至70%的死亡率，則根據(jù)情況調(diào)整重金屬的濃度梯度若所設(shè)定的濃度梯度所產(chǎn)生的死亡率均小于70%，則保持空白對(duì)照不變，將重金屬濃度梯度中的最低濃度不變，增加所采用的等對(duì)數(shù)間距，設(shè)定較高的濃度梯度；若所設(shè)定的濃度梯度所產(chǎn)生的死亡率均大于30%，則保持空白對(duì)照不變，將重金屬濃度梯度中的最高濃度不變，增加所采用的等對(duì)數(shù)間距，設(shè)定較低的濃度梯度。然后再次以96孔板為染毒環(huán)境，向每孔中加入15條秀麗線蟲成蟲，染毒 24h后采用體視顯微鏡對(duì)死亡率進(jìn)行觀察；重復(fù)此操作直至獲得的死亡率同時(shí)涵蓋30%至 70%，然后以濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、死亡率為縱坐標(biāo)，采用直線內(nèi)插法獲得其急性LC5tl值；B,按照傳統(tǒng)方法，在20°C條件下將秀麗線蟲培養(yǎng)三天后，用2mL無(wú)菌水將NGM培養(yǎng)基表面的秀麗線蟲沖洗至15mL具刻度的離心管中，靜置30min，去除上清液至蟲液小于 1.5mL，根據(jù)傳統(tǒng)同步化方法，按照蟲液clorox溶液=1 7的體積比，將clorox溶液加入蟲液中，混合搖勻，反應(yīng)20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對(duì)clorox溶液有抵抗能力的蟲卵，2500rpm離心;3min，棄上清液，再加入無(wú)菌水至離心前相同的刻度，搖勻， 2500rpm離心3min，棄上清液，重復(fù)該操作兩次，然后向離心管中加入IOmL按照傳統(tǒng)配方獲得的無(wú)菌K-溶液后混勻，采用體視鏡觀察40 μ L該混合液的蟲卵數(shù)量，若蟲卵數(shù)量多于500 枚，則向離心管中再加入2mL無(wú)菌K-溶液再混勻、觀察，若蟲卵數(shù)量少于300枚，則靜置沉淀lOmin，去除2mL上清液再混勻、觀察，直至將蟲卵濃度稀釋為每40 μ L含有約400枚蟲卵為止，該密度能夠不影響蟲卵的正常孵化，此為第一批進(jìn)行染毒的蟲卵，標(biāo)記為卵液Ptl,待用；C，采用依傳統(tǒng)配方獲得的LB液體培養(yǎng)基在37°C、200rpm條件下將E. coli0P50培養(yǎng)24h至48h，混勻后倒入已滅菌的15mL離心管中，4000rpm離心5min，棄上清液，保留沉于底部的菌體，加入8mL無(wú)菌K-溶液混勻，以M孔板為容器、以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為檢測(cè)儀器，測(cè)定每300 μ L該混合液在570nm處的吸光度，若吸光度值小于1. 1或大于1. 3，則將混合液重新離心，棄上清液，保留沉于底部的菌體，加入6mL或IOmL無(wú)菌K-溶液混勻，再次測(cè)定混合液在570nm處的吸光度，通過(guò)減少或增加無(wú)菌-K溶液的體積將吸光度值調(diào)整至1. 1 與1. 3之間，此時(shí)E. coli 0P50的總量約為IO8至IO9個(gè)，該數(shù)量條件下的菌個(gè)數(shù)能夠?yàn)锽 步驟所得秀麗線蟲蟲卵的正常生長(zhǎng)發(fā)育提供足夠的食物，標(biāo)記為菌液，待用；D，采用無(wú)菌透明的M孔板進(jìn)行染毒，先將C步驟獲得的菌液搖勻，向M孔板的每孔中加入300 μ L該菌液，將B步驟稀釋好的卵液搖勻，向M孔板的每孔中加入200 μ L該卵液，將M孔板劃分為4行、6列，這些含有蟲卵的M孔，每行作為一組、4行共4組對(duì)應(yīng)于 A步驟確定的4個(gè)濃度梯度，對(duì)秀麗線蟲進(jìn)行染毒；在對(duì)孔板的孔與孔之間加入ImL無(wú)菌 K-溶液以減少染毒期間，蒸發(fā)對(duì)染毒體系的影響；可根據(jù)實(shí)際需要對(duì)所采用的M孔板的個(gè)數(shù)及相關(guān)布局進(jìn)行調(diào)整；將M孔板置于20°C條件下培養(yǎng)并開(kāi)始計(jì)時(shí)；E，在D步驟計(jì)時(shí)的后，從每行中隨機(jī)移取1孔中的秀麗線蟲用于測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，均標(biāo)記為Ptl的各指標(biāo)值；Fdf M孔板中4個(gè)濃度梯度對(duì)應(yīng)的混合液分別吸取到4個(gè)無(wú)菌的15mL離心管中， 并用ImL無(wú)菌K-溶液沖洗M孔板每一孔中殘留的蟲體，并將沖洗液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的離心管中，靜置沉淀15min，棄上清液保留沉淀，根據(jù)傳統(tǒng)同步化方法，加入clorox溶液至12mL刻度線，混合搖勻，反應(yīng)20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對(duì)clorox溶液有抵抗能力的蟲卵，2500rpm離心3min，棄上清液，再加入無(wú)菌水至離心前相同的刻度，搖勻，2500rpm 離心;3min，棄上清液，重復(fù)該操作兩次，然后按照步驟B中的方法，以無(wú)菌K-溶液為稀釋液， 將4個(gè)離心管中的蟲卵濃度分別稀釋為每40 μ L含有400枚蟲卵，此批蟲卵為母代的子一代蟲卵，標(biāo)記為卵液F1，待用；重復(fù)步驟C獲得菌液，按照與步驟A相同的受試濃度梯度、重復(fù)步驟D、Ε，獲得標(biāo)記為F1的各指標(biāo)值；G，重復(fù)步驟F，獲得子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx的各指標(biāo)；H，依照Ε、F、G步驟中獲得的各代秀麗線蟲的指標(biāo)值之間的顯著性差異分析結(jié)果， 參照用秀麗線蟲測(cè)定藥品與個(gè)人護(hù)理品類物質(zhì)的世代毒性的方法將該可溶性重金屬的持久性毒性類別分為不具有明確的持久性毒性、有延遲性的持久性毒性、具有可被修復(fù)的毒性、具有明確并且不可修復(fù)的持久性毒性。本發(fā)明的效果和優(yōu)點(diǎn)是1.與先前采用秀麗線蟲測(cè)定藥品與個(gè)人護(hù)理品世代毒性的方法相比，本發(fā)明步驟更少、操作更簡(jiǎn)單，不僅保持了接近實(shí)際環(huán)境濃度的暴露水平，而且實(shí)現(xiàn)了暴露時(shí)間的連續(xù)性，使得多個(gè)連續(xù)世代的秀麗線蟲的整個(gè)生命周期都涵蓋在暴露時(shí)間中，尤其是涵蓋了秀麗線蟲對(duì)外界環(huán)境變化更加敏感的、從蟲卵到成蟲的發(fā)育階段，本發(fā)明的暴露時(shí)間更加接近實(shí)際環(huán)境條件下的暴露。2.與先前采用秀麗線蟲測(cè)定藥品與個(gè)人護(hù)理品世代毒性的方法相比，本發(fā)明考慮到食物能夠改變秀麗線蟲對(duì)重金屬響應(yīng)的研究，確定了不影響孵化的蟲卵起始濃度，以及能夠滿足其生長(zhǎng)發(fā)育所需的食物起始濃度，實(shí)現(xiàn)了食物與重金屬的共存，暴露情形更加接近實(shí)際環(huán)境條件下的暴露。3.該方法秉承了對(duì)秀麗線蟲行為學(xué)、發(fā)育學(xué)、神經(jīng)學(xué)等豐富指標(biāo)的可用性，秀麗線蟲個(gè)體水平、生理生化水平、分子水平等多層面的各項(xiàng)毒性指標(biāo)均可以與本方法相兼容。秀麗線蟲在經(jīng)過(guò)接近實(shí)際環(huán)境的有食物共存、低濃度、長(zhǎng)時(shí)間的暴露之后，不同世代(母代P。、 子一代F1、子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx)之間相同指標(biāo)的相互比較結(jié)果，不僅能夠獲得該重金屬的毒性是否傳遞給后代，此種毒性傳遞的強(qiáng)弱、傳遞的途徑，以及不同世代對(duì)該重金屬的敏感性是否發(fā)生變化等結(jié)果，使得所進(jìn)行的毒性研究更加系統(tǒng)、全面，對(duì)于判斷毒性產(chǎn)生作用的順序及機(jī)理提供明確的指導(dǎo)方向；而且能夠?yàn)樵撝亟饘俚脑u(píng)價(jià)與管理提供更為合理、更加接近實(shí)際環(huán)境暴露情形的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，進(jìn)而為評(píng)價(jià)該種重金屬的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供更加可靠的數(shù)據(jù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1配制LB(Luria Bertani)培養(yǎng)基、NGM(Nematode Growth Medium)固體培養(yǎng)基、 K-溶液和clorox溶液。①根據(jù)《分子克隆試驗(yàn)指南》(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾等)配制LB培養(yǎng)基 (IL) :10g胰蛋白胨、5g酵母浸膏、IOg氯化鈉，用lmol/L NaOH溶液將pH值調(diào)為7. 0，在 121°C、0. 105MPa 滅菌 20min。另配制 lmol/L NaOH 溶液(IOOmL) :4g 氫氧化鈉，IOOmL 水。②根據(jù)S. Brenner在1974年Genetics刊物上發(fā)表的論文(The genetics ofCaenorhabditis elegans)配制 NGM 固體培養(yǎng)基(IL) 17g 瓊脂粉、2. 5g 蛋白胨、3g 氯化鈉、25mL pH = 6. 0 的 K2HPO4-KH2PO4 溶液；121°C、0. 105MPa 高壓滅菌 20min，冷卻至 50°C 左右時(shí)，加入經(jīng)抽濾滅菌處理過(guò)的lmol/L MgS04、lmol/LCaCl2、5mg/mL膽固醇/乙醇溶液各lmL，混合均勻后倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，靜置冷卻至室溫凝固后，待接種。另配制 lmol/L K2HPO4-KH2PO4 緩沖液(pH = 6. 0，150mL) :11. 4g K2HPO4 · 3H20，50mL 蒸餾水；6. 8g KH2PO4, 50mL蒸餾水；按前者比后者為2 1比例配成pH = 6. 0的緩沖液。配制膽固醇溶液 (IOOmL) :0. 5g膽固醇，IOOmL無(wú)水乙醇溶解；抽濾滅菌。配制lmol/L MgSO4(IOOmL) :24. 6g MgSO4 · 7H20, IOOmL 蒸餾水；抽濾滅菌。配制 lmol/L CaCl2 :11. Ig CaCl2, IOOmL 蒸餾水；抽濾滅菌。抽濾除菌用無(wú)菌Φ 13mm孔徑0. 45 μ m的硝酸纖維素膜過(guò)濾菌類。將濾膜裝在高溫滅菌處理過(guò)的容量為5mL的玻璃注射器靠針管處，將待過(guò)濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，壓出液膜的溶液即抽濾除菌后的溶液。③根據(jù) P. L.Williams 等人在 1990 年 Environemtnal Toxicology and Chemistry 干丨J 物上發(fā)表的論文(Aquatic toxicity testing using the nematode, Caenorhabditiselegans)配制 K-溶液(IL) :3. OOg NaCl，2.36g KCl ；在 121°C、0. 105MPa 滅菌20min。(4) S. W. Emmons ^Λ 1979 Proceedings of the National Academyof Sciences 干^|物上發(fā)表白勺論文(An analysis of the constancy of DNA sequencesduring development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans)配fj^clorox溶液(30mL) :5mL NaOCl溶液(有效成分6% )，0. 6g NaOH，25mL蒸餾水。根據(jù)需要的量現(xiàn)用現(xiàn)配。將大腸桿菌0P50(E. coli 0P50)接種至滅菌后恢復(fù)至室溫的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)Mh即可使用。將培養(yǎng)好的0P50 E. coli接種至NGM培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h即可使用； 將秀麗線蟲接種至該NGM培養(yǎng)基上，20°C常規(guī)培養(yǎng)。本發(fā)明所用秀麗線蟲以及E. coli 0P50 均由復(fù)旦大學(xué)發(fā)育生物學(xué)研究所惠贈(zèng)。采用秀麗線蟲檢測(cè)可溶性重金屬持久性毒性的方法，具體步驟如下A，依照傳統(tǒng)急性毒性測(cè)試方法，以秀麗線蟲成蟲作為受試生物，測(cè)得該重金屬的急性LC5tl值，在急性LC5tl值的1/10下設(shè)置8個(gè)濃度梯度，其中包括7個(gè)重金屬濃度，1個(gè)空白對(duì)照；其中，測(cè)定LC5tl的具體步驟是按照B步驟獲得同步化的卵液，在覆有E. coli 0P50 并37°C培養(yǎng)Mh的NGM固體培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)48h，獲得同步化的秀麗線蟲成蟲，然后以 96孔板為染毒環(huán)境，向每孔中加入15條秀麗線蟲成蟲，染毒24h后采用體視顯微鏡對(duì)96 孔板中的秀麗線蟲進(jìn)行觀察，蟲體僵直且對(duì)輕微觸碰無(wú)反應(yīng)則認(rèn)定其死亡，分別記錄秀麗線蟲成蟲的總數(shù)與死亡數(shù)，計(jì)算死亡率；若所設(shè)定的濃度梯度沒(méi)有同時(shí)涵蓋30%至70%的死亡率，則根據(jù)情況調(diào)整重金屬的濃度梯度若所設(shè)定的濃度梯度所產(chǎn)生的死亡率均小于 70%，則保持空白對(duì)照不變，將重金屬濃度梯度中的最低濃度不變，增加所采用的等對(duì)數(shù)間距，設(shè)定較高的濃度梯度；若所設(shè)定的濃度梯度所產(chǎn)生的死亡率均大于30%，則保持空白對(duì)照不變，將重金屬濃度梯度中的最高濃度不變，增加所采用的等對(duì)數(shù)間距，設(shè)定較低的濃度梯度。然后再次以96孔板為染毒環(huán)境，向每孔中加入15條秀麗線蟲成蟲，染毒24h后采用體視顯微鏡對(duì)死亡率進(jìn)行觀察；重復(fù)此操作直至獲得的死亡率同時(shí)涵蓋30%至70%，然后以濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、死亡率為縱坐標(biāo)，采用直線內(nèi)插法獲得其急性LC5tl值；B，按照傳統(tǒng)方法，在20°C條件下，將秀麗線蟲常規(guī)培養(yǎng)三天后，用2mL無(wú)菌水將NGM培養(yǎng)基表面的秀麗線蟲沖洗至15mL具刻度的離心管中，靜置30min，去除上清液至蟲液小于1.5mL，根據(jù)傳統(tǒng)同步化方法，按照蟲液clorox溶液=1 7的體積比，將clorox溶液加入蟲液中，混合搖勻，反應(yīng)20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對(duì)clorox溶液有抵抗能力的蟲卵，2500rpm離心;3min，棄上清液，再加入無(wú)菌水至離心前相同的刻度，搖勻， 2500rpm離心3min，棄上清液，重復(fù)該操作兩次，然后向離心管中加入IOmL無(wú)菌K-溶液混勻，采用體視鏡觀察40 μ L該混合液的蟲卵數(shù)量，若蟲卵數(shù)量多于500枚，則向離心管中再加入2mL無(wú)菌K-溶液再混勻、觀察，若蟲卵數(shù)量少于300枚，則靜置沉淀lOmin，去除2mL上清液再混勻、觀察，直至將蟲卵濃度稀釋為每40 μ L含有約400枚蟲卵為止，該密度能夠不影響蟲卵的正常孵化，此批蟲卵為第一批進(jìn)行染毒的蟲卵，標(biāo)記為卵液Ptl，待用；C，采用按照傳統(tǒng)配方獲得的LB液體培養(yǎng)基在37°C、200rpm條件下將E. coli0P50 培養(yǎng)24h至48h，混勻后倒入已滅菌的15mL離心管中，4000rpm離心5min，棄上清液，保留沉于底部的菌體，加入8mL無(wú)菌K-溶液混勻，以M孔板為容器、以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為檢測(cè)儀器，測(cè)定每300 μ L該混合液在570nm處的吸光度，若吸光度值小于1. 1或大于1. 3，則將混合液重新離心，棄上清液，保留沉于底部的菌體，加入6mL或IOmL無(wú)菌K-溶液混勻，再次測(cè)定混合液在570nm處的吸光度，通過(guò)減少或增加無(wú)菌-K溶液的體積將吸光度值調(diào)整至1. 1 與1. 3之間，此時(shí)E. coli 0P50的總量約為IO8至IO9個(gè)，該數(shù)量條件下的菌個(gè)數(shù)能夠?yàn)锽 步驟所得秀麗線蟲蟲卵的正常生長(zhǎng)發(fā)育提供足夠的食物，標(biāo)記為菌液，待用；D，將M孔板劃分為4行、6列，采用兩個(gè)無(wú)菌透明的M孔板進(jìn)行染毒，先將C步驟獲得的菌液搖勻，向兩個(gè)M孔板共48孔中加入300 μ L該菌液，將B步驟稀釋好的卵液搖勻，向以每個(gè)M孔板的前三列共12孔、兩板共M孔中加入200 μ L該卵液，這些含有蟲卵的24孔，同一行的3孔作為一組、兩板共8組對(duì)應(yīng)于A步驟確定的8個(gè)濃度梯度，對(duì)秀麗線蟲進(jìn)行染毒；向每個(gè)M孔板的后三列共12孔、兩板共M孔中加入200 μ L無(wú)菌K-溶液作為補(bǔ)充液，這些無(wú)蟲卵的M孔，同一行的3孔作為一組、兩板共8組對(duì)應(yīng)于A步驟確定的 8個(gè)濃度梯度，用于提供菌液在此受試條件下變化的對(duì)照；然后將C步驟準(zhǔn)備好的重金屬以每行一個(gè)濃度梯度、兩板共8個(gè)濃度梯度，向兩板共48孔中分別加入500 μ L重金屬，混勻后立即利用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在570nm處的吸光度值，記為ODfe ；在M孔板的孔與孔之間加入ImL無(wú)菌K-溶液以減少染毒期間，蒸發(fā)對(duì)染毒體系的影響；將對(duì)孔板置于20°C條件下培養(yǎng)并開(kāi)始計(jì)時(shí)；E，在D步驟計(jì)時(shí)的后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在570nm處的吸光度值，記為0D#， 每一個(gè)孔OD值的變化值為Δ OD = ODfe-OD^ D步驟中含有卵液的8個(gè)梯度、共M孔的AOD 均要減去同一濃度梯度、不含有卵液的參照孔的Δ( ，記為飲食量抑制率(Ptl)；從每一濃度梯度中含有卵液的三孔中隨機(jī)移取1孔中的秀麗線蟲，測(cè)定秀麗線蟲的身體大小、身體彎曲頻率、逆向運(yùn)動(dòng)等指標(biāo)的檢測(cè)，具體實(shí)施步驟是用移液槍從8組濃度分別取少量秀麗線蟲至1.5mL離心管中，沉淀15min，采用移液槍去除上清液，再加入無(wú)菌蒸餾水清洗秀麗線蟲身上黏附的0P50E. coli以及重金屬，沉淀15min，將底部秀麗線蟲轉(zhuǎn)移至無(wú)0P50E. coli 的NGM培養(yǎng)基上，置于20°C培養(yǎng)箱中，池后，水分蒸發(fā)并且秀麗線蟲已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境之后，采用體視顯微鏡附帶的成像軟件對(duì)秀麗線蟲進(jìn)行照相并進(jìn)行60seC的錄像，根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)秀麗線蟲的體長(zhǎng)、身體彎曲頻率、逆向運(yùn)動(dòng)頻率等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。各項(xiàng)指標(biāo)均以其占空白對(duì)照組的秀麗線蟲相同指標(biāo)的比例表示。各項(xiàng)指標(biāo)分別標(biāo)記為“體長(zhǎng)(Ptl) ”、“身體彎曲頻率(Ptl) ”、“逆向運(yùn)動(dòng)頻率(P0)，，； F，將經(jīng)過(guò)E步驟后的2個(gè)M孔板中含有卵液的8個(gè)濃度梯度對(duì)應(yīng)的混合液分別吸取到8個(gè)無(wú)菌的15mL離心管中，并用ImL無(wú)菌K-溶液沖洗M孔板每一孔中殘留的蟲體， 并將沖洗液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的離心管中，靜置沉淀15min，棄上清液保留沉淀，加入clorox溶液至12mL刻度線，混合搖勻，反應(yīng)20min，每五分鐘搖勻一次，殺死母體，留下對(duì)clorox溶液有抵抗能力的蟲卵，2500rpm離心;3min，棄上清液，再加入無(wú)菌水至離心前相同的刻度，搖勻， 2500rpm離心3min，棄上清液，重復(fù)該操作兩次，然后按照步驟B中的方法，以無(wú)菌K-溶液為稀釋液，將8個(gè)離心管中的蟲卵濃度分別稀釋為每40 μ L含有400枚蟲卵，此批蟲卵為母代的子一代蟲卵，標(biāo)記為卵液F1,待用；重復(fù)步驟C獲得菌液，按照與步驟A相同的受試濃度梯度、重復(fù)步驟D、E，獲得標(biāo)記為F1的各指標(biāo)值，包括“飲食量抑制率(F1) ”、“體長(zhǎng)(F1) ”、 “身體彎曲頻率(F1) ”、“逆向運(yùn)動(dòng)頻率(F1)，，;G，重復(fù)步驟F，獲得子二代F2的各指標(biāo)值，包括“飲食量抑制率(ig ”、“體長(zhǎng)(ig ”、 “身體彎曲頻率(F2) ”、“逆向運(yùn)動(dòng)頻率(F2)，，；子三代F3的各項(xiàng)指標(biāo)值，包括“飲食量抑制率 (F3) ”、“體長(zhǎng)(F3) ”、“身體彎曲頻率(F3) ”、“逆向運(yùn)動(dòng)頻率(F3) ” ；以及子四代F4的各指標(biāo)， 包括“飲食量抑制率(F4) ”、“體長(zhǎng)(F4) ”、“身體彎曲頻率(F4) ”、“逆向運(yùn)動(dòng)頻率(F4) ”等；H，依照用秀麗線蟲測(cè)定藥品與個(gè)人護(hù)理品類物質(zhì)的世代毒性的方法對(duì)重金屬的持久性毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用美國(guó)OriginLab公司推出的數(shù)據(jù)分析和制圖軟件Origin 7. 5以及滿足該軟件要求的電腦，對(duì)包括子一代F1、子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx等的毒性結(jié)果與秀麗線蟲母代Ptl的毒性結(jié)果進(jìn)行比較并進(jìn)行顯著性分析，具體實(shí)施步驟如下將 E、F、G步驟獲得的“飲食量抑制率(Ptl) ”、“飲食量抑制率(F1) ”、“飲食量抑制率(F2) ”、“飲食量抑制率(F3) ”的數(shù)據(jù)輸入Origin 7. 5數(shù)據(jù)列表，在statistics下打開(kāi)anova的下拉按鈕中的one-way anova，從候選列表中將“飲食量抑制率(Ptl) ”與“飲食量抑制率(F1)"的數(shù)據(jù)選擇，并將“顯著性參數(shù)”設(shè)定為0.05，點(diǎn)擊“計(jì)算”，即可獲得飲食量抑制率(F1)與飲食量抑制率(Pq)的顯著性差異結(jié)果；若計(jì)算結(jié)果顯示為“At the 0. 051evel,thepopulation means are not significantly different. ”，即“二者在 0. 05 的水平下，不存在顯著性差異，，；若結(jié)果顯不為 “At the 0. 051evel, the population means aresignificantIy different. ”，即“二者在0. 05的水平下，存在顯著性差異”。然后再次在statistics下打開(kāi)anova的下拉按鈕中的one-way anova,從候選列表中將“飲食量抑制率(I3tl)，，與“飲食量抑制率(ig，，的數(shù)據(jù)選擇，并將“顯著性參數(shù)”設(shè)定為0. 05，點(diǎn)擊“計(jì)算”，即可獲得飲食量抑制率(F2)與飲食量抑制率(Ptl)的顯著性差異結(jié)果；以此類推，獲得飲食量抑制率(F3)與飲食量抑制率(Ptl)的顯著性差異結(jié)果以及飲食量抑制率(F3)與飲食量抑制率(Ptl)的顯著性差異結(jié)果。若“飲食量抑制率”的比較結(jié)果包括"F1與P0”、“F2與P0”、“F3與P0”、“F4與 Po”，均未得到顯著差異的結(jié)果，則說(shuō)明該重金屬對(duì)該指標(biāo)不具有明確的持久性毒性；若"F1 與P0”、“F2與P0，，的比較結(jié)果為“不存在顯著性差異”，而"F3與P0”、“F4與P0，，的比較結(jié)果為“存在顯著性差異”，而且&、&表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的毒物抑制效應(yīng)，則說(shuō)明該重金屬對(duì)該指標(biāo)有延遲性的持久性毒性；若"F1與WF2與P?！钡谋容^結(jié)果為“存在顯著性差異”，而"F3 與Po”、"F4與P/的比較結(jié)果為“不存在顯著性差異”，而且F3、F4表現(xiàn)出較為輕微的毒物抑制效應(yīng)，則說(shuō)明該重金屬對(duì)該指標(biāo)具有可被秀麗線蟲修復(fù)或適應(yīng)的毒性；若"F1與ΡΛ“Ρ2 與P。”、“F3與P0”、“F4與Ptl”的比較結(jié)果均為“存在顯著性差異”，而且"F2與F/，、“F3與F/，、"F4與F,的比較結(jié)果，"F3與Π與F2"的比較結(jié)果，"F4與F,的比較結(jié)果也都為“存在顯著性差異”，而且Pp F1, F2, F3, F4受到的毒物抑制效應(yīng)也更加嚴(yán)重，則說(shuō)明該重金屬對(duì)該指標(biāo)具有明確的、不可修復(fù)的持久性毒性。 對(duì)其他的指標(biāo)進(jìn)行相同的顯著性差異分析，并對(duì)持久性毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。綜合考慮各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)持久性毒性的評(píng)價(jià)結(jié)果，判斷受到該重金屬的持久性暴露后，秀麗線蟲所表現(xiàn)的毒性效應(yīng)的先后順序，飲食首先受到影響、行為學(xué)活性進(jìn)而受到影響，或者行為學(xué)活性首先受到影響、飲食繼而受到影響，或者其他順序，根據(jù)不同的毒性效應(yīng)的先后順序，可以推斷該重金屬是通過(guò)飲食、體表或是其他途徑產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，為研究產(chǎn)生該持久性毒性的致毒機(jī)理提供方向。
權(quán)利要求
1.采用秀麗線蟲檢測(cè)可溶性重金屬持久性毒性的方法，包括A，依照急性毒性測(cè)試方法，以秀麗線蟲成蟲作為受試生物，測(cè)得該重金屬的急性LC5tl值，在急性LC5tl值的1/10下設(shè)置3個(gè)重金屬濃度和1個(gè)空白對(duì)照，其特征是B，利用無(wú)菌具刻度的15mL離心管，采用同步化方法獲得秀麗線蟲蟲卵，然后向15mL 離心管中加入IOmL無(wú)菌K-溶液，混勻，采用體視鏡觀察40 μ L該混合液的蟲卵數(shù)量，若蟲卵數(shù)量多于500枚，則向離心管中再加入2mL無(wú)菌K-溶液后再混勻、觀察；若蟲卵數(shù)量少于300枚，則靜置沉淀lOmin，去除2mL上清液后再混勻、觀察；直至將蟲卵濃度稀釋為每 40 μ L含有400枚蟲卵為止，此批蟲卵為第一批進(jìn)行染毒的蟲卵，標(biāo)記為卵液Ptl，待用；C，采用LB液體培養(yǎng)基在37°C、200rpm條件下將E. coli 0P50培養(yǎng)24h至48h，混勻后倒入已滅菌的15mL離心管中，4000rpm離心5min，棄上清液，保留沉于底部的菌體，加入SmL 無(wú)菌K-溶液混勻，以M孔板為容器、以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為檢測(cè)儀器，測(cè)定每300 μ L該混合液在570nm處的吸光度，若吸光度值小于1. 1或大于1. 3，則將混合液重新離心，棄上清液， 保留沉于底部的菌體，加入6mL或IOmL無(wú)菌K-溶液混勻，再次測(cè)定混合液在570nm處的吸光度，通過(guò)減少或增加無(wú)菌-K溶液的體積將吸光度值調(diào)整至1. 1與1. 3之間，此時(shí)E. coli 0P50的總量為IO8至IO9個(gè)，該數(shù)量條件下的菌個(gè)數(shù)能夠?yàn)锽步驟所得秀麗線蟲蟲卵的正常生長(zhǎng)發(fā)育提供足夠的食物，標(biāo)記為菌液，待用；D，采用無(wú)菌透明的M孔板進(jìn)行染毒，先將C步驟獲得的菌液搖勻，向M孔板的每孔中加入300 μ L該菌液，將B步驟稀釋好的卵液搖勻，向M孔板的每孔中加入200 μ L該卵液， 將M孔板劃分為4行、6列，這些含有蟲卵的M孔，每行作為一組、4行共4組對(duì)應(yīng)于A步驟確定的4個(gè)濃度梯度，對(duì)秀麗線蟲進(jìn)行染毒；在M孔板的孔與孔之間加入ImL無(wú)菌K-溶液以減少染毒期間，蒸發(fā)對(duì)染毒體系的影響；可根據(jù)實(shí)際需要對(duì)所采用的M孔板的個(gè)數(shù)及相關(guān)布局進(jìn)行調(diào)整；將M孔板置于20°C條件下培養(yǎng)并開(kāi)始計(jì)時(shí)；E，在D步驟計(jì)時(shí)的后，從每行中隨機(jī)移取1孔中的秀麗線蟲用于測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，均標(biāo)記為Ptl的各指標(biāo)值；F，將M孔板中4個(gè)濃度梯度對(duì)應(yīng)的混合液分別吸取到4個(gè)無(wú)菌的15mL離心管中，用 ImL無(wú)菌K-溶液沖洗M孔板每一孔中殘留的蟲體，并將沖洗液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的離心管中，靜置沉淀15min，棄上清液保留沉淀，采用同步化方法，獲得4個(gè)濃度梯度對(duì)應(yīng)的4組蟲卵，然后依照步驟B中的方法，以無(wú)菌K-溶液為稀釋液，將4個(gè)離心管中的蟲卵濃度分別稀釋為每40 μ L含有400枚蟲卵，此批蟲卵為母代的子一代蟲卵，標(biāo)記為卵液F1，待用；重復(fù)步驟C 獲得菌液，按照與步驟A相同的受試濃度梯度、重復(fù)步驟D、Ε，獲得標(biāo)記為F1的各指標(biāo)值； G，重復(fù)步驟F，獲得子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx的各指標(biāo)； H，依照E、F、G步驟中獲得的各代秀麗線蟲的指標(biāo)值之間的顯著性差異分析結(jié)果，參照傳統(tǒng)方法將該可溶性重金屬的持久性毒性類別分為不具有明確的持久性毒性、有延遲性的持久性毒性、具有可被修復(fù)的毒性、具有明確并且不可修復(fù)的持久性毒性。
全文摘要
采用秀麗線蟲檢測(cè)可溶性重金屬持久性毒性的方法，涉及一種采用秀麗線蟲對(duì)可溶性重金屬進(jìn)行涵蓋多個(gè)連續(xù)世代的持久性暴露，從而檢測(cè)該重金屬在長(zhǎng)期、低濃度條件下的毒性效應(yīng)的方法。本發(fā)明確定了無(wú)重金屬存在下、不影響蟲卵正常孵化的蟲卵起始濃度，以及能夠滿足其生長(zhǎng)發(fā)育所需的食物起始濃度，在暴露時(shí)間、暴露劑量尤其是食物與重金屬共存等方面更加貼近實(shí)際環(huán)境暴露情形，不同世代之間相同指標(biāo)的相互比較，獲得該重金屬在長(zhǎng)期實(shí)際環(huán)境暴露情形下的毒性傳遞的強(qiáng)弱、傳遞的途徑等。本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有采用秀麗線蟲進(jìn)行毒性測(cè)試方法的不足，具有明確的針對(duì)性，對(duì)模擬實(shí)際環(huán)境暴露情形下的毒性研究方法進(jìn)行了補(bǔ)充和擴(kuò)展。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102183627SQ20111004576
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者于振洋, 尹大強(qiáng), 張晶 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)