專利名稱：通過(guò)微小rna裝置進(jìn)行細(xì)菌介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)的制作方法
通過(guò)微小RNA裝置進(jìn)行細(xì)菌介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考該申請(qǐng)要求2007年6月四日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)60/947，311的優(yōu) 先權(quán)和權(quán)益，所述臨時(shí)專利申請(qǐng)的內(nèi)容完整引入作為參考。
背景技術(shù)：
盡管首先在秀麗新小桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)，但已經(jīng)在植物和 包括人的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了微小RNA(miRNA)。miRNA由從DNA轉(zhuǎn)錄但不翻譯成蛋白質(zhì)的基因 (非蛋白質(zhì)編碼RNA)編碼，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)高于30%的哺乳動(dòng)物基因。成熟的miRNA分子 與一個(gè)或多個(gè)信使RNA(mRNA)分子部分互補(bǔ)，并且相信其主要功能是調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA具有許多潛在的應(yīng)用用于治療目的，然而關(guān)鍵的障礙在于向靶細(xì)胞中遞送 miRNA或其前體。需要新的方法向動(dòng)物靶標(biāo)施用安全并可預(yù)測(cè)的miRNA。發(fā)明概述本發(fā)明提供細(xì)菌介導(dǎo)的系統(tǒng)，用于通過(guò)細(xì)菌感染向靶細(xì)胞內(nèi)引入miRNA。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述細(xì)菌含有編碼miRNA的DNA，并在所述細(xì)菌中通過(guò)原核啟動(dòng)子，或在靶細(xì)胞 中使用真核啟動(dòng)子表達(dá)所述miRNA。在可選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌含有編碼miRNA前體的 DNA，并在所述細(xì)菌中通過(guò)原核啟動(dòng)子，或在靶細(xì)胞中使用真核啟動(dòng)子表達(dá)所述前體。如果 前體在細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)，其可在細(xì)菌中或在靶細(xì)胞中加工為成熟的miRNA。一方面，本發(fā)明提供至少編碼微小RNA(miRNA)或miRNA前體的DNA載體。所述 miRNA能夠調(diào)節(jié)，即上調(diào)或下調(diào)真核、原核或病毒靶基因中至少一個(gè)表達(dá)。所述miRNA前體 可以是初級(jí)-miRNA(pri-miRNA)、miRNA前體(pre_miRNA)或miRNA雙鏈體。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述載體編碼具有基本互補(bǔ)區(qū)的兩個(gè)miRNA，當(dāng)表達(dá)時(shí)，所述兩個(gè)miRNA形成雙鏈體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miRNA是成熟miRNA或弓|導(dǎo)miRNA。所述載體還包括原核或真核啟 動(dòng)子，并還可編碼Hly基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，由miRNA靶向的至少一個(gè)基因是與癌相關(guān) 的。一方面，本發(fā)明提供含有微小RNA(miRNA)、miRNA前體或編碼所述miRNA或所述前 體的DNA分子的細(xì)菌，所述miRNA能夠調(diào)節(jié)真核、原核或病毒靶基因中至少一個(gè)表達(dá)。所述 細(xì)菌可以是活的侵入性細(xì)菌或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌還包含能夠?qū)⑺?miRNA前體加工成近于成熟miRNA的酶或核酶，如內(nèi)切核酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì) 菌還含有細(xì)菌核糖核酸酶III、切酶、切酶樣酶、Drosha和I^sha中的至少一種。所述細(xì)菌 還包括在遺傳物質(zhì)釋放到靶真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中后幫組轉(zhuǎn)運(yùn)其遺傳物質(zhì)的酶。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述酶是由Hly A基因編碼的利斯特氏菌溶素0。所述真核靶基因可以是動(dòng)物，例 如哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，由miRNA靶向的至少一個(gè)基因是與癌相關(guān)的。一方面，本發(fā)明提供通過(guò)用本發(fā)明的細(xì)菌感染動(dòng)物，向動(dòng)物細(xì)胞遞送miRNA或 miRNA前體的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。所述方法還包括在細(xì)菌感 染動(dòng)物細(xì)胞后，裂解細(xì)菌的步驟。一方面，本發(fā)明提供制備miRNA的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括用具有 至少編碼miRNA的原核載體的細(xì)菌感染的步驟?；蛘?，所述方法包括具有用至少編碼miRNA前體的第一個(gè)原核載體和編碼用于將所述miRNA前體加工成miRNA的至少一種酶的第二個(gè) 原核載體的細(xì)菌感染的步驟。所述方法還包括在細(xì)菌中分別表達(dá)miRNA或miRNA前體和所 述酶，并從所述細(xì)菌中收集miRNA的步驟。一方面，本發(fā)明提供在動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的方法。所述方法包 括步驟用本發(fā)明的細(xì)菌感染動(dòng)物細(xì)胞；并裂解所述細(xì)菌以釋放其內(nèi)容物，由此允許來(lái)自 所述內(nèi)容物的或從所述內(nèi)容物產(chǎn)生的miRNA與靶基因的mRNA相互作用，并由此調(diào)節(jié)所述基 因的表達(dá)。在一個(gè)特征中，調(diào)節(jié)的機(jī)制是翻譯阻抑、mRNA降解，或翻譯阻抑和mRNA降解。一方面，本發(fā)明提供在動(dòng)物中治療或預(yù)防病征的方法。所述方法包括包括通過(guò)用 包含微小RNA(miRNA)、miRNA前體或至少編碼所述miRNA或所述前體的DNA分子的細(xì)菌感 染動(dòng)物細(xì)胞，來(lái)調(diào)節(jié)已知參與病征的至少一個(gè)靶基因的表達(dá)，所述miRNA能夠調(diào)節(jié)至少所 述基因的表達(dá)。所述動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類。一方面，本發(fā)明提供在動(dòng)物中治療或預(yù)防癌或細(xì)胞增殖病征的方法。所述方法包 括用包含微小RNA(miRNA)、miRNA前體或至少編碼所述miRNA或所述前體的DNA分子的細(xì) 菌感染動(dòng)物細(xì)胞，來(lái)調(diào)節(jié)已知參與細(xì)胞增殖或癌的至少一個(gè)靶基因的表達(dá)，所述miRNA能 夠調(diào)節(jié)至少所述基因的表達(dá)。一方面，本發(fā)明提供在動(dòng)物中治療或預(yù)防由動(dòng)物中至少一個(gè)缺陷型miRNA引起的 病征的方法。所述方法包括用包含所述miRNA的功能版本(version)、所述功能性miRNA的 RNA前體或至少編碼所述功能性miRNA或所述前體的DNA分子的細(xì)菌感染動(dòng)物細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供在動(dòng)物中治療或預(yù)防由動(dòng)物中至少一個(gè)上調(diào)miRNA引起的病 征的方法。所述方法包括用包含所述miRNA的反義版本、miRNA所述反義版本的RNA前體， 或至少編碼所述反義版本或所述前體的DNA分子的細(xì)菌感染動(dòng)物細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供發(fā)現(xiàn)或確認(rèn)治療靶標(biāo)的方法。所述方法包括下述步驟用本 發(fā)明的細(xì)菌感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞；裂解所述細(xì)菌以釋放其內(nèi)容物；并研究底物與來(lái)自所述內(nèi) 容物的或從所述內(nèi)容物產(chǎn)生的miRNA之間的相互作用。所述底物可調(diào)節(jié)miRNA的活性或所 述miRNA可調(diào)節(jié)所述底物的活性。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)可顯而易見(jiàn)于本文提供的，包括于不同實(shí)施例中的額外 描述。提供的實(shí)施例闡明了用于實(shí)踐本發(fā)明的不同成分和方法。所述實(shí)施例不限于要求本 發(fā)明?；诒竟_(kāi)內(nèi)容，技術(shù)人員可鑒定并使用用于實(shí)踐本發(fā)明的其他成分和方法。附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示miRNA如何從其多種前體加工得到的示意圖。圖2是顯示質(zhì)粒pTiOR構(gòu)建的載體圖。圖3是顯示質(zhì)粒pTPIV構(gòu)建的載體圖。圖4顯示溴化乙錠染色的RT-PCR反應(yīng)(左)和化學(xué)發(fā)光western印跡(右)。發(fā)明詳述如本文所用，“調(diào)節(jié)”指升高或降低(例如沉默)，換言之，上調(diào)或下調(diào)。如本文所 用，向靶細(xì)胞“引入”或“遞送”微生物指用所述微生物(例如細(xì)菌)感染所述靶細(xì)胞的過(guò) 程，并且在某些情況下可能通過(guò)裂解所述微生物向靶細(xì)胞期望位置(例如細(xì)胞質(zhì))釋放該 微生物內(nèi)的遺傳物質(zhì)。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源的、單鏈或雙鏈的約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA分子，其調(diào)節(jié)約 30 % 的哺乳動(dòng)物基因(Czech，NEJM 354 :1194-1195(2006) ；Mack, Nature Biotech. 25 :631-638(2007) ；Eulalio，等，Cell 132 :9-14 Q008))。miRNA通過(guò)阻斷翻譯或 引起轉(zhuǎn)錄物降解來(lái)抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)生。miRNA可靶向250-500個(gè)不同的mRNA。miRNA是miRNA 前體進(jìn)行切酶消化的產(chǎn)物，而所述miRNA前體是初級(jí)miRNA (primary miRNA)的產(chǎn)物。切酶是核糖核酸酶III核糖核酸酶家族的成員。切酶將長(zhǎng)的雙鏈RNA(dsRNA)和短 發(fā)夾RNA (shRNA)切割成約20-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)的稱為小干擾RNA (siRNA)的短雙鏈RNA片段， 其通常在3'末端具有兩個(gè)堿基的突出端。切酶也將pre-微小RNA(miRNA)切割成miRNA 雙鏈體。切酶催化RNA干擾途徑中的第一步并起始RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的形成，所 述RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的催化組分argonaute是能夠降解信使RNA(mRNA)的內(nèi)切核酸酶， 所述信使RNA的序列與siRNA引導(dǎo)鏈的序列互補(bǔ)。參考圖1，編碼miRNA的基因比加工過(guò)的成熟miRNA分子長(zhǎng)的多；miRNA首先轉(zhuǎn)錄 成具有帽子和poly-Α尾的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或初級(jí)-miRNA，并在細(xì)胞核中加工成更短的70個(gè)核 苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，稱為miRNA前體。在動(dòng)物中通過(guò)稱為微處理機(jī)復(fù)合體的蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn) 行該加工，所述微處理機(jī)復(fù)合體由核酸酶Drosha和雙鏈RNA結(jié)合蛋白質(zhì)Pasha組成。然后 通過(guò)與內(nèi)切核酸酶切酶相互作用將這些miRNA前體在細(xì)胞質(zhì)中加工成成熟的miRNA，所述 內(nèi)切核酸酶切酶也起始RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的形成。該復(fù)合體負(fù)責(zé)因miRNA表達(dá) 和RNA干擾而觀察到的基因沉默。該途徑也不同于來(lái)自基因內(nèi)莖環(huán)的miRNA;這些是通過(guò) 切酶加工而非Drosha。DNA的正義鏈或反義鏈可作為模板起功能，產(chǎn)生miRNA。如圖1顯示，成熟miRNA具有至少三種形式的中間RNA前體(a)初級(jí)-miRNA，(b) miRNA前體和(c)由miRNA前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行切酶切割產(chǎn)生的miRNA雙鏈體。因此，一方面，本發(fā)明提供使用細(xì)菌向靶細(xì)胞遞送miRNA，或miRNA前體，或編碼 miRNA或miRNA前體的DNA，或任何上述的混合物的系統(tǒng)，以通過(guò)翻譯阻抑、mRNA降解或兩 者引起基因調(diào)控。所述細(xì)菌優(yōu)選為非致病性或治療性菌株，其具有進(jìn)入細(xì)胞的能力。所述 靶細(xì)胞可以是真核細(xì)胞。本發(fā)明的miRNA調(diào)節(jié)，例如下調(diào)靶細(xì)胞中的目的基因。所述真核 細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或鳥(niǎo)類細(xì)胞。所述目的基因可以是哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、真核、細(xì)菌或 病毒基因。如果遞送的分子是miRNA前體，其可在細(xì)菌內(nèi)或在靶細(xì)胞中使用細(xì)胞的現(xiàn)有加 工裝置加工成成熟的miRNA。在動(dòng)物細(xì)胞中，酶或核酶，如Drosha、Pasha和切酶是該裝置 的一部分，其將miRNA前體加工成可引導(dǎo)多酶復(fù)合體RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)靶向mRNA 的成熟形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供至少編碼miRNA或miRNA前體的原核載體。所 述miRNA可調(diào)節(jié)真核、原核或病毒靶基因中至少一個(gè)表達(dá)。所述miRNA前體可以是(a)初 級(jí)-miRNA，(b)miRNA前體和(c)miRNA雙鏈體。對(duì)于miRNA雙鏈體，可以是雙鏈環(huán)形質(zhì)粒的 載體編碼具有互補(bǔ)區(qū)以形成雙鏈體的兩個(gè)miRNA。所述質(zhì)?？删哂幸粋€(gè)或兩個(gè)啟動(dòng)子。根 據(jù)載體是否表達(dá)，所述啟動(dòng)子可以是原核啟動(dòng)子或真核啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，因?yàn)檩d 體旨在載體細(xì)菌內(nèi)表達(dá)，所以在所述載體上提供至少一個(gè)原核啟動(dòng)子，如T7。在另一實(shí)施方 案中，因?yàn)檩d體旨在靶真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所以在所述載體上提供至少一個(gè)真核啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，向真核細(xì)胞中遞送細(xì)菌攜帶的編碼miRNA前體的一個(gè)或多個(gè) DNA分子，其在所述真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，然后在所述真核細(xì)胞中加工以產(chǎn)生成熟的miRNA。所 述DNA分子可處于通常指導(dǎo)小核RNA(snRNA)轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶II相容啟動(dòng)子或RNA聚合酶 III 相容啟動(dòng)子(例如 U6、Hl)的控制下(P. J. Paddison, A. A. Caudiy, G. J. Hannon, PNAS 99，1443(2002)，T. R. Brummelkamp, R. Bernards,R. Agami，Science 296，550 (2002))。 雙"Trojan horse"技術(shù)可與攜帶真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的侵入性和營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌一起使用。該 質(zhì)粒依次通過(guò)靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，形成進(jìn)一步加工成成熟miRNA的miRNA前體，所述成熟miRNA引 發(fā)RNAi的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程。在一個(gè)有利方面，本發(fā)明提供通過(guò)用細(xì)菌，優(yōu)選細(xì)菌的非病原性或治療性菌株感 染真核細(xì)胞，向該真核細(xì)胞中遞送miRNA、miRNA前體或編碼所述miRNA或前體的DNA的方 法，以在真核細(xì)胞中引起基因調(diào)節(jié)。所述細(xì)菌包含(a)miRNA，(b)miRNA前體，或(c)編碼所 述miRNA或所述前體的DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌本身能夠合成并將miRNA前體加工為成熟的miRNA。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌具有加工或消化所述前體的酶或核酶。所述酶可以是內(nèi)切核酸酶。 所述內(nèi)切核酸酶可以是核糖核酸酶III家族的成員，如細(xì)菌核糖核酸酶III、切酶或切酶樣 酶。所述酶可以是Drosha或I^asha。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶對(duì)載體細(xì)菌是內(nèi)源的。在 另一實(shí)施方案中，所述酶對(duì)載體細(xì)菌是外源的并通過(guò)表達(dá)此類酶(例如切酶樣酶或Drosha 樣酶)的載體引入。所得miRNA可以調(diào)節(jié)(例如敲減或沉默)一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)，所述方法能 夠降低基因表達(dá)的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或高于90%。細(xì)菌遞送比病毒遞送更具吸引力，因?yàn)榭赏ㄟ^(guò)抗生素和不能復(fù)制的減毒細(xì)菌菌株 控制所述細(xì)菌遞送。同樣，細(xì)菌更易于進(jìn)行遺傳操作，其允許產(chǎn)生特異用于某些應(yīng)用的載體 菌株。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于產(chǎn)生細(xì)菌，其以組織特異性方式引起 基因調(diào)節(jié)。本發(fā)明的無(wú)毒菌可通過(guò)多種機(jī)制進(jìn)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。專門(mén)的吞噬細(xì)胞活性 吞入菌、侵入性細(xì)菌菌株具有侵入非吞噬宿主細(xì)胞的能力。此類細(xì)菌的天然實(shí)例是細(xì)胞 內(nèi)病原體如利斯特氏菌(Listeria)、志賀氏菌(Shigella)和沙門(mén)氏菌(Salmonella), 但該性質(zhì)也可通過(guò)轉(zhuǎn)移侵入相關(guān)基因轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌如大腸桿菌(E. coli)和雙歧桿 菌(Bifidobacteriae),包括益生菌(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, C. R. Acad. Sci. Paris 318,1207(1995))。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，用于向宿主細(xì)胞遞 送小 RNA 的細(xì)菌包括弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri) (D. R. Sizemore,A. A. Branstrom, J. C. Sadoff，Science 270，299 (1995))、侵入性大腸桿菌(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, C. R. Acad. Sci.Paris 318,1207 (1995), C. Grillot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D. Μ. Ojcius, P. Courvalin, Nat Biotechnol 16,862(1998))、 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)(A. Al-Mariri A, A. Tibor, P. Lestrate, P. Mertens, X. De Bolle, J. J. Letesson Infect Immim 70,1915(2002))禾口
tl Ifi±1 ^^1J T# K S‘ (Listeria monocytogenes) (M. Hense, E. Domann, S. Krusch, P. Wachholz, K. E. Dittmar, M. Rohde, J. ffehland, T. Chakraborty, S. Weiss, Cell Microbiol 3, 599 (2001), S. Pilgrim, J. Stritzker, C. Schoen, A. KoIb-Maurer, G. Geginat, M. J. Loessner, I. Gentschev, W. Goebel, Gene Therapy 10，2036 (2003))。任何侵入性細(xì) 菌用于 DNA 向真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)移(S.Weiss，Τ. Chakraborty, Curr Opinion Biotechnol 12， 467(2001))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建至少編碼微小RNA (miRNA)或miRNA前體的原核載體。所 述miRNA可調(diào)節(jié)真核、原核或病毒靶基因中至少一個(gè)表達(dá)。然后用載體轉(zhuǎn)化侵入性細(xì)菌。所 述細(xì)菌可以是活的細(xì)菌，或其衍生物，例如來(lái)自細(xì)菌的半失活細(xì)菌或功能顆粒。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述細(xì)菌能夠表達(dá)和/或加工所述miRNA或其前體。在可選實(shí)施方案中，所述細(xì)菌 不能夠表達(dá)和/或加工所述miRNA或其前體，而僅作為載體在靶真核細(xì)胞中用于進(jìn)一步的 表達(dá)和加工。所述miRNA前體可以是(a)初級(jí)-miRNA，(b)miRNA前體，(c)miRNA雙鏈體或 其混合物。此時(shí)，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌包含以下一個(gè)或多個(gè)微小RNA(miRNA)、miRNA前體、編碼所述 miRNA或所述前體的DNA分子，或任何上述的混合物。細(xì)菌的內(nèi)容物經(jīng)過(guò)細(xì)菌侵入(“細(xì)菌感染(bactofection) ”)向靶細(xì)胞中遞送，并 在通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型、內(nèi)含體或通過(guò)定時(shí)添加抗生素引發(fā)細(xì)菌裂解后在哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞內(nèi)釋 放，導(dǎo)致對(duì)所述靶基因的調(diào)節(jié)。細(xì)菌DNA和RNA從細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌中的釋放通過(guò)活性機(jī)制發(fā)生。所述細(xì)菌DNA和RNA 可包含miRNA、miRNA前體和/或其編碼質(zhì)粒的混合物。一種機(jī)制涉及鼠傷寒沙門(mén)氏菌 (S. typhimurium)中的III類輸出系統(tǒng)，其為橫跨細(xì)菌細(xì)胞膜的專門(mén)化多蛋白復(fù)合體，其功 能包括向細(xì)胞外分泌毒力因子，以允許向靶細(xì)胞發(fā)放信號(hào)，但其也可用于向靶細(xì)胞中遞送 抗原(Russmann H. Int J Med Microbiol, 293 :107-12(2003))或通過(guò)細(xì)菌裂解并向細(xì)胞 質(zhì)中釋放細(xì)菌內(nèi)容物。通過(guò)加入細(xì)胞內(nèi)活性抗生素(四環(huán)素)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的裂解，或 通過(guò)細(xì)菌代謝減毒(營(yíng)養(yǎng)缺陷型)或通過(guò)細(xì)胞內(nèi)體或溶酶體自然發(fā)生。釋放真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒 后，在靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生miRNA、miRNA前體，依次引發(fā)靶基因的基于miRNA的調(diào)節(jié)?？墒褂锰烊磺秩胄圆≡w鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)進(jìn)行 本發(fā)明。在該實(shí)施方案的一方面，鼠傷寒沙門(mén)氏菌的菌株包括SL 7207和VNP20009 (S. K. Hoiseth, B.A.D.Stacker, Nature 291,238(1981) ；Pawelek JM，Low KB, Bermudes D. Cancer Res. 57(20) :4537-44(1997 年 10 月 15 日))。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，使用減毒大腸桿菌進(jìn)行本發(fā)明。在該實(shí)施方案的 一個(gè)實(shí)例中，大腸桿菌的菌株是 BM 2710 (C. Grillot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D. M. Ojcius, P. Courvalin, Nat Biotechnol 16,862(1998))。在該實(shí)施方案的一個(gè)特征 中，通過(guò)侵入性質(zhì)粒例如編碼Inv基因的一個(gè)質(zhì)粒來(lái)改造所述BM 2710菌株，以具有細(xì)胞侵 入性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的另一特征，本發(fā)明的細(xì)菌含有具有Hly (利斯特氏菌溶素(listeria lysine)0)基因的載體，因?yàn)檎J(rèn)為Hly蛋白質(zhì)對(duì)遺傳物質(zhì)從輸入小泡中逃逸是重要的。顯 然，所述載體可以是相同的侵入質(zhì)粒。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌具有編碼Inv和 Hly基因的質(zhì)粒。在一個(gè)實(shí)例中，用于本發(fā)明的大腸桿菌菌株是BL21 (DE3) pLysE。在一個(gè)實(shí)施方案中，miRNA前體，例如miRNA前體在細(xì)菌中表達(dá)并加工成miRNA前 體，然后遞送至真核細(xì)胞中。在另一實(shí)施方案中，miRNA前體，例如miRNA前體在細(xì)菌中表 達(dá)，然后遞送至真核細(xì)胞中并在所述真核細(xì)胞中加工成miRNA。在可選實(shí)施方案中，編碼 miRNA前體，例如初級(jí)-miRNA的DNA分子遞送至真核細(xì)胞中，并且所述miRNA前體在所述真 核細(xì)胞中表達(dá)，然后加工成miRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，miRNA在細(xì)菌中表達(dá)，然后遞送至真核細(xì)胞中。在另一實(shí)施方 案中，編碼miRNA的DNA分子遞送至真核細(xì)胞中，并且所述miRNA在所述真核細(xì)胞中表達(dá)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)基因是一個(gè)基因，或多于2、4、8、16、32、64、100、200 或400個(gè)基因。本發(fā)明也提供通過(guò)用在適當(dāng)啟動(dòng)子控制下表達(dá)miRNA或前體的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌或 其他宿主細(xì)胞制備微小RNA的方法。在細(xì)菌的情況下，在載體中提供原核啟動(dòng)子，例如T7。 如果所述載體編碼miRNA前體，例如miRNA前體，表達(dá)上文討論的所需加工酶的載體也轉(zhuǎn)化 到細(xì)菌中。1.應(yīng)用1. 1研究和藥物開(kāi)發(fā)工具野生型miRNA在細(xì)胞中行使基因調(diào)節(jié)功能；一些已經(jīng)與多種類型的人類疾病， 包括癌相關(guān)。因此，miRNA可用于研究其調(diào)節(jié)的靶基因和它們本身怎樣被其他分子，例如 miRNA抑制劑靶向。本發(fā)明的方法可用于在體外和體內(nèi)研究基因功能。本發(fā)明的載體可用于轉(zhuǎn)染培養(yǎng) 的動(dòng)物細(xì)胞，作為藥物靶向/途徑鑒定和確認(rèn)中的研究工具。例如，在用本發(fā)明的細(xì)菌感染 宿主細(xì)胞并釋放細(xì)菌內(nèi)容物提供某些miRNA或可加工成miRNA的前體后，可觀察細(xì)胞的表 型或形態(tài)改變，其揭示了一些目的途徑已經(jīng)受到影響。此類表型改變可包括多種細(xì)胞核、細(xì) 胞核形態(tài)、細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖、DNA片段化、細(xì)胞表面標(biāo)記和有絲分裂指數(shù)等。在另一實(shí)例 中，可分離或鑒定宿主細(xì)胞中分子/底物與轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的miRNA之間的相互作用，以發(fā)現(xiàn) 潛在的治療靶標(biāo)。該靶標(biāo)可以處于上游并調(diào)節(jié)所述miRNA的活性，或者所述靶標(biāo)可以處于 下游，并且其活性受所述miRNA調(diào)節(jié)。在體內(nèi)應(yīng)用方面，因?yàn)閙iRNA可通過(guò)本發(fā)明的方法引入宿主體內(nèi)，在研究某些 miRNA對(duì)不同細(xì)胞類型和不同組織的影響中可采用系統(tǒng)生物學(xué)手段。這些體內(nèi)和體外方法使用具有期望性質(zhì)(侵入力、減毒、steerability)的細(xì)菌。 例如雙歧桿菌和利斯特氏菌用于進(jìn)行本發(fā)明細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi方法。使用質(zhì)粒賦予細(xì)菌侵 入力以及一個(gè)或幾個(gè)miRNA或miRNA前體的真核或原核轉(zhuǎn)錄。1. 2治療用途本發(fā)明細(xì)菌介導(dǎo)的miRNA組合物可用于治療和或預(yù)防多種疾病，包括總結(jié) T Dykxhoorn, Novina&Sharp· Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 :457-467(2003) ；Kim&Rossi， Nature Rev. Genet. 8 :173-184(2007) ；de Fougerolles,等 Nature Rev. Drug Discov. 6 443-453(2007)中的疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可通過(guò)靶向一個(gè)或多個(gè)癌相關(guān)基因作為癌治療 方法或用于預(yù)防癌。該方法受參與細(xì)胞增殖或其他癌表型的基因的沉默或敲減影 響。用于癌治療的本發(fā)明的細(xì)菌優(yōu)選為改造以安全搜出并殺死腫瘤的細(xì)菌(Forbes， Nature Biotechnology 24:1484-1485(2006)。所述細(xì)菌可以是專性厭氧菌，如梭菌 (Clostridium) novyi-NT，或兼性厭氧菌，如鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌(如上)。這些基因的實(shí)例是多種癌基因，例如k-Ras。例如，k_Ras已經(jīng)顯示受miRNA Let_7 的調(diào)節(jié)。這些癌基因是活化的并涉及大多數(shù)臨床病例。例如，k-Ras在大多數(shù)人結(jié)腸癌、胰 腺癌和非小細(xì)胞非癌中中異?；罨?。k-Ras突變賦予對(duì)化學(xué)治療和目前靶向治療的抗性。 本發(fā)明細(xì)菌介導(dǎo)的和基于miRNA的基因?qū)ぐ蟹椒蓱?yīng)用于達(dá)到腸道用于結(jié)腸癌治療和預(yù) 防。這些方法也用于治療攜帶異種移植腫瘤的動(dòng)物，以在腸的腫瘤發(fā)生的k-RasV12模型中治療并預(yù)防癌，并在腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC-min模型)中預(yù)防和治療腫瘤。本發(fā)明的方法也可用于產(chǎn)生用于待使用的癌預(yù)防性“益生菌”，其尤其具有GI道 或肝的靶標(biāo)。本發(fā)明的方法用作針對(duì)炎癥疾病，例如炎性腸病(IBD)，包括局限性腸炎、潰瘍 性結(jié)腸炎的治療。這些方法用于沉默或敲減非癌基因靶標(biāo)(病毒基因，用于治療和預(yù)防乙 肝、丙肝；炎性基因，用于治療和預(yù)防炎性腸病)和其他基因靶標(biāo)。本發(fā)明的方法可用于向消化道和結(jié)腸中遞送基因沉默(稱為結(jié)腸癌治療和預(yù) 防)，并在多種疾病的治療中用于經(jīng)口應(yīng)用。在該實(shí)施方案的另一方面，基因沉默的遞送是 經(jīng)腸外的，如局部的、靜脈內(nèi)的。細(xì)菌產(chǎn)生和/或遞送的dsRNA也可用于沉默或敲減非癌基因靶標(biāo)。本發(fā)明的RNA 分子也可用于治療或預(yù)防眼疾(例如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和糖尿病性視網(wǎng)膜病變 (DR))；感染性疾病(例如HIV/AIDS、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭瘤 病毒(HPV)、單純皰疹病毒(HSV)、RCV、巨細(xì)胞病毒(CMV)、登革熱、西尼羅病毒)；呼吸道疾 病(例如呼吸道合胞病毒、哮喘、囊性纖維化)；神經(jīng)疾病(例如亨廷頓舞蹈病(HD)、肌萎縮 性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、脊索損傷、帕金森疾病、阿爾茨海默氏疾病、疼痛)；心血管疾病；代 謝疾病(例如糖尿病)；遺傳??；和炎性疾病(例如炎性腸病(IBD)、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕病、自身免 疫性疾病)，皮膚病。因?yàn)閙iRNA是動(dòng)物細(xì)胞許多細(xì)胞途徑調(diào)節(jié)裝置的一部分，缺陷型miRNA本身可在 動(dòng)物中引起病征或疾病。因此，本發(fā)明的一個(gè)治療用途是簡(jiǎn)單地產(chǎn)生并向動(dòng)物中遞送miRNA 的功能拷貝或遺傳改造拷貝，以治療或預(yù)防此類病征或疾病。2.細(xì)菌遞送根據(jù)本發(fā)明，能夠如通過(guò)穿過(guò)細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，而向靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) 中遞送分子，例如miRNA分子的任何微生物可用于向此類細(xì)胞中遞送miRNA和其前體。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物是原核生物。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述原核生物 是細(xì)菌。也處于本發(fā)明范圍內(nèi)的是除可用于向細(xì)胞遞送RNA的細(xì)菌以外的微生物。例 如，所訴微生物可以是真菌，例如Cryptococciis neoformans,原生動(dòng)物，例如克魯茲錐 蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi)、鼠弓菜蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)、多氏禾丨」什曼蟲(chóng)(Leishmania donovani)禾口皰蟲(chóng)(Plasmodia)。如本文所用，當(dāng)指微生物，例如細(xì)菌時(shí)，術(shù)語(yǔ)“侵入性的”指能夠向靶細(xì)胞遞送至少 一種分子，例如RNA或編碼RNA的DNA分子的微生物。侵入性微生物可以是能夠穿過(guò)細(xì)胞 膜，由此進(jìn)入所述細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，并向靶細(xì)胞遞送至少一些其內(nèi)容物，例如RNA或編碼RNA 的DNA的微生物。向靶細(xì)胞遞送至少一種分子的過(guò)程優(yōu)選不顯著修飾侵入裝置。在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，所述微生物是細(xì)菌。優(yōu)選的侵入性細(xì)菌是能夠如通過(guò)進(jìn)入真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) 向靶細(xì)胞遞送至少一種分子，例如RNA或編碼RNA的DNA分子的細(xì)菌。優(yōu)選的侵入性細(xì)菌 是或的細(xì)菌，例如活的侵入性細(xì)菌。侵入性微生物包括天然能夠如通過(guò)穿過(guò)細(xì)胞膜，例如真 核細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而向靶細(xì)胞遞送至少一種分子的微生物，以及非天然侵入性的但 已經(jīng)被修飾，例如遺傳修飾而變得具侵入性的微生物。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過(guò)將細(xì) 菌連接到“侵入因子”，也稱為“進(jìn)入因子”或“細(xì)胞質(zhì)靶向因子”上來(lái)修飾非天然侵入性的 微生物，使其變得有侵入性。如本文所用，“侵入因子”是當(dāng)非侵入性細(xì)胞表達(dá)時(shí)致使細(xì)菌 具有侵入性的因子，例如蛋白質(zhì)或一組蛋白質(zhì)。如本文所用，“侵入因子”由“細(xì)胞質(zhì)靶向基因”編碼。天然侵入性微生物，例如細(xì)菌可具有某些向性，即趨向優(yōu)選的靶細(xì)胞?；蛘?，可修 飾，例如遺傳修飾微生物，例如細(xì)菌，以模擬第二種微生物的向性?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定至少一種分子向靶細(xì)胞的遞送。例如，可通過(guò)雜交 或PCR方法，或通過(guò)包括使用抗體的免疫方法檢測(cè)分子的存在，由此沉默的RNA或蛋白質(zhì)的 表達(dá)降低。測(cè)定微生物是否具有用于本發(fā)明的足夠的侵入性可包括測(cè)定相對(duì)于與宿主細(xì)胞 接觸的微生物數(shù)量，是否有足夠的RNAOniRNA或miRNA前體)或其編碼DNA向宿主細(xì)胞遞 送。如果RNA的量相對(duì)于所用微生物的數(shù)量較低，可期望進(jìn)一步修飾微生物以提高其侵入 性潛力?？赏ㄟ^(guò)多種方法測(cè)定細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌在氨基糖苷類抗生素處理下 存活，而細(xì)胞外細(xì)菌被快速殺死?？赏ㄟ^(guò)用抗生素慶大霉素處理單層細(xì)胞來(lái)滅活細(xì)胞 外細(xì)菌，然后在用溫和去污劑釋放存活的細(xì)胞內(nèi)生物并在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基上測(cè)定有 活力的數(shù)量前除去該抗生素，來(lái)完成對(duì)細(xì)菌吸收的定量評(píng)估。此外，例如通過(guò)細(xì)胞層的 thin-section-transmission電子顯微鏡或通過(guò)免疫熒光技術(shù)直接觀察細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞 O^alkow等(1992)Annual Rev. Cell Biol. 8 :333)。因此，多種技術(shù)可用于測(cè)定特定細(xì)菌是 夠能夠侵入特定類型的細(xì)胞，或用于如修飾細(xì)菌的向性以模擬第二種細(xì)菌的向性的細(xì)菌修 飾后，驗(yàn)證細(xì)菌的侵入。根據(jù)本發(fā)明方法遞送RNA的細(xì)菌優(yōu)選為非致病性的。然而，只要它 們的致病性已經(jīng)減毒，由此致使所述細(xì)菌對(duì)向其施用的受試者無(wú)害，也可使用病原菌。如本 文所用，術(shù)語(yǔ)“減毒的細(xì)菌”指已經(jīng)被修飾來(lái)顯著減少或消除其對(duì)受試者的損害的細(xì)菌?？?通過(guò)下文所述的多種方法減毒病原菌。不想受限于作用的特定機(jī)理，根據(jù)細(xì)菌類型，向真核細(xì)胞中遞送RNA或DNA的細(xì)菌 可進(jìn)入細(xì)胞的多個(gè)區(qū)室。例如，所述細(xì)菌可以在小泡中，例如吞噬小泡中。一旦進(jìn)入細(xì)胞， 細(xì)菌可被破壞或裂解，并且其內(nèi)容物可遞送到真核細(xì)胞中。也可改造細(xì)菌表達(dá)吞噬體降解 酶，以允許RNA從所述吞噬體中泄漏。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌在真核細(xì)胞中可保持活 力不同時(shí)間，并可繼續(xù)產(chǎn)生RNAOniRNA或miRNA前體)。RNA或編碼RNA的DNA然后可從細(xì) 菌中例如通過(guò)泄漏釋放到細(xì)胞中。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌也可以在真核細(xì) 胞中復(fù)制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌復(fù)制不殺死宿主細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性。本發(fā)明不限 于通過(guò)特定裝置遞送RNA或編碼RNA的DNA并且旨在包括允許通過(guò)不依賴的細(xì)菌遞送裝置 遞送RNA或編碼RNA的DNA的方法和組合物。下文所述的是在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述為天然侵入性的細(xì)菌(部分2. 1)，以及在文獻(xiàn)中 已經(jīng)描述為天然非侵入性的細(xì)菌(部分2. 2)，以及天然非致病性的或減毒的細(xì)菌的實(shí)例。 盡管已經(jīng)將一些細(xì)菌描述為非侵入性的(部分2.幻，這些根據(jù)本發(fā)明仍然是侵入性足夠使 用的。無(wú)論是否常規(guī)描述為天然侵入性的或非侵入性的，可修飾任何的細(xì)菌菌株以進(jìn)行調(diào) 節(jié)，尤其是增加其侵入性特征(例如在部分2. 3中所述)。2. 1天然侵入性細(xì)菌本發(fā)明使用的特定天然侵入性細(xì)菌并不是至關(guān)重要的。此類天然發(fā)生的侵入性細(xì) 菌的實(shí)例包括，但不限于志賀氏菌屬物種，沙門(mén)氏菌屬物種，利斯特氏菌屬物種，立克次氏 體屬物種(Rickettsia spp.)，和腸侵染性大腸桿菌。所用的特定志賀氏菌菌株對(duì)本發(fā)明并 非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的志賀氏菌株的實(shí)例包括弗氏志賀氏菌^(ATCC No. 29903),Shigella sonnet (ATCC No. 29930)，和 Shigella disenteriae (ATCCNo. 13313)。減毒志賀 氏菌株,如弗氏志賀氏菌2a 2457T aroA virG突變體CVD 1203 (Noriega等，上文)、弗氏志 賀氏菌 M90T icsA 突變體(Goldberg 等 Infect Immun.，62 :5664-5668 (1994))、弗氏志賀 氏菌 Y SFLl 14 aroD 突變體(Karnell 等 Vacc，10 167-174 (1992))和弗氏志賀氏菌 aroA aroD突變體(Verma等Vacc，9 :6-9(1991))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘?，可通過(guò)單獨(dú)引入減毒 突變或與其他一種或更多種額外減毒突變結(jié)合構(gòu)建新的減毒志賀氏菌屬物種菌株。志賀氏菌RNA疫苗載體的至少一個(gè)優(yōu)勢(shì)是其對(duì)結(jié)腸黏膜表面中淋巴組織的向 性。此外，認(rèn)為志賀氏菌復(fù)制的初始位點(diǎn)位于樹(shù)狀突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)，其通常見(jiàn)于黏膜
E^liRΦ M 白勺—/^ (McGhee, J. R.等 Reproduction, Fertility, &Development 6 :369(1994) ；Pascual, D. W.等 Immunomethods 5:56(1994)綜述)。像這樣，志賀氏菌 載體可提供手段以在這些專門(mén)抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)抗原的工具。志賀氏菌載體的另一優(yōu) 勢(shì)是減毒的志賀氏菌菌株在體外和體內(nèi)遞送核酸報(bào)告基因(Sizemore，D. R.等kience 270:299(1995) ；Courvalin, P.等 Comptes Rendus de 1 Academiedes Sciences Serie Ill-Sciences de Ia Vie-Life Sciences 318 :1207(1995) ；Powell,R. J.等在Molecular approaches to the control of infectiousdiseases(1996) ψ . , F. Brown, E. Norrby, D. Burton 禾口 J. Mekalanos,編著 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 183 ； Anderson,R. J.等Abstracts for the 97th General Meeting of the American Society forMicrobiology :E. (1997))。在實(shí)踐方面，志賀氏菌的嚴(yán)格限制的宿主特異性支持通 過(guò)中間宿主防止志賀氏菌載體擴(kuò)散到食物鏈中。此外，已經(jīng)在嚙齒類、靈長(zhǎng)類和自生自長(zhǎng) 型(植物)中開(kāi)發(fā)了高度減毒的減毒菌株(Anderson等(1997)上文；Li，A.等Vaccine 10 :395(1992) ；Li，Α.等 Vaccine 11:180(1993) ；Karnel 1, A.等 Vaccine 13:88(1995)； Sansonetti, P. J.禾口 J. ArondelVaccine 7:443(1989) ；Fontaine, Α.等 Research in Microbiology 141 :907(1990) ；Sansonetti, P.J.等(1991)Vaccine 9 416 ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 62:5168(1994) ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 64 :3055(1996) ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 64:23(1996) ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 64:3055(1996) ；Kotloff, K. L.等 Infection&Immunity 64: 4542(1996))。該近來(lái)的認(rèn)識(shí)將允許開(kāi)發(fā)用于人的良好耐受的志賀氏菌載體。可使用化學(xué)性非特異性誘變，如使用試劑如N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍；或 使用重組DNA技術(shù)、經(jīng)典的遺傳技術(shù)(如TnlO誘變、P22-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、λ噬菌體介導(dǎo)的交 換和接合轉(zhuǎn)移)的非特異性誘變；或使用定點(diǎn)誘變的重組DNA技術(shù)，將減毒突變引入細(xì)菌 性病原菌中。因?yàn)閷?duì)重組DNA技術(shù)構(gòu)建的菌株進(jìn)行了更明確的定義，所以優(yōu)選重組DNA技 術(shù)。此類減毒突變的實(shí)例包括，但不限于(i)營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變，如aroOtoiseth等Nature， 291 :238-239 (1981))、gua (McFarland 等 Microbiol. Path.，3 :129-141 (1987))、nad (Park 等 J. Bact, 170 :3725-3730(1988)、thy (Nnalue 等 Infect. Immun. ,55 :955-962(1987))和 asd(Curtiss，上文)突變；(ii)滅活球形調(diào)節(jié)功能的突變，如cya(Curtiss等Infect. Immun. ,55 3035-3043 (1987))、crp (Curtiss 等(1987)，上文)、phoP/phoQ (Groisman 等 Proc. Natl. Acad. Sci.，USA,86 :7077-7081 (1989)；禾口 Miller 等 Proc.Natl. Acad. Sci.，USA,86 5054-5058(1989))、phop (Miller 等 J. Bact, 172 :2485-2490 (1990))或 ompR(Dorman 等Infect. Immun. ,57 :2136-2140(1989))突變；(iii)修飾應(yīng)激應(yīng)答的突變，如 recA(Buchmeier 等 MoI. Micro.，7 933-936(1993))、htrA (Johnson 等 Mol. Micro.，5 :401-407 (1991) )、htpR(Neidhardt 等 Biochem.Biophys. Res. Com. ，100 :894-900(1981))、hsp (Neidhardt 等 Ann. Rev. Genet, 18 295-329(1984))和 groEL (Buchmeier 等 ki.，248 :730-732(1990))突變；(iv)特定毒力因子中的突變，如 IsyA (Libby 等 Proc. Natl. Acad. ki.，USA, 91 :489-493(1994))、pag 或 prg(Miller 等(1990)，上文；和 Miller 等(1989)，上文)、 iscA 或 virG(d ‘ Hauteville 等 Mol. Micro.，6 :833-841 (1992))、plcA(Mengaud 等 Mol Microbiol.，5 :367-72(1991) ；Camilli 等 J. Exp. MecU 173 :751-754 (1991))，和 act (Brundage 等 Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 90 11890-11894 (1993))突變；(ν)影響 DNA 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的突變，如 top A(Galan 等 hfect. Immun.，58 1879-1885 (1990))；(vi)阻斷或修飾細(xì)胞周期的突變，如 min(de Boer 等 Cell，56 :641-649 (1989))。(vii)引入編碼自殺系統(tǒng)的基因，如 sacB(Recorbet 等 App. Environ. Micro. ,59 1361-1366(1993) ；Quandt 等 Gene，127 :15-21 (1993) )、nuc (Ahrenholtz 等 App. Environ. Micro. ,60 :3746-3751(1994))、hok、gef、kil 或 phlA (Molin 等 Ann. Rev. Microbiol. ,47 139-166(1993))；(viii)改變脂多糖和/或脂類A的生物起源的突變，如rfMRaetz inEsherishia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt 等編著，ASMPress, Washington D. C.第 1035-1063 頁(yè)(1996))、galE(Hone 等 J. Infect. Dis.，156 :164-167(1987))和 htrB(Raetz， 上文)、msbB (Reatz，上文)(ix)引入噬菌體裂解系統(tǒng)，如P22編碼的溶源體(Rermell等Virol，143 280-289(1985))、λ 胞壁質(zhì)轉(zhuǎn)糖基酶(Bienkowskalzewczyk 等 Mol. Gen. Genet.，184 111-114(1981))或 S 基因(Reader 等 Virol，43 :623-6 (1971))；禾口減毒突變可組成型表達(dá)或處于誘導(dǎo)性啟動(dòng)子控制下，如啟動(dòng)子的溫度敏感型 熱激家族(Neidhardt等上文)，或厭氧誘導(dǎo)的nirB啟動(dòng)子(Harbome等Mol Micro.， 6 :2805-2813(1992))或抑制型啟動(dòng)子，如 uapA (Gorfinkiel 等 J. Biol. Chem.，268 23376-23381 (1993))或 gcv(Stauffer 等 J. Bact, 176 :6159-6164 (1994))。所用的特定利斯特氏菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的利斯特 氏菌菌株的實(shí)例包括單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(ATCC No. 15313)。減毒的利斯特氏菌株， 如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌actA突變體(Brundage等上文)或單核細(xì)胞增生利斯特氏菌 ρ IcA (Camilli等J.Exp. Med.，173 :751-754(1991))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘?，可通過(guò)引入上 文描述志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒利斯特氏 菌株。所用的特定沙門(mén)氏菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的沙門(mén)氏菌菌株的實(shí)例包括傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi) (ATCC No. 7251)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(ATCC No. 13311)。減毒的沙門(mén)氏菌株優(yōu)選用于本發(fā)明 并包括傷寒沙門(mén)氏菌(S. typhi) -aroC-aroD (Hone等Vacc. 9 :810 (1991)和鼠傷寒沙門(mén)氏 菌-axoA突變體(Mastroeni等Micro. Pathol. 13 :477 (1992))?；蛘?，可通過(guò)引入上文描 述志賀氏菌屬物種的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒沙門(mén)氏菌菌株。
所用的特定立克次氏體菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的立 克次氏體菌株的實(shí)例包括立氏立克次氏體(Rickettsia Rickettsiae) (ATCC No. VR149 和 VR891)、普氏立克次氏體(Ricketsia prowaseckii) (ATCC No. VR233)、恙蟲(chóng)熱立克次 氏體(Rickettsia tsutsugamuchi) (ATCCNo. VR312, VRl 50 和 VR609)、摩氏立克次氏體 (Rickettsia mooseri) (ATCCNo. VR144)、西伯利亞立克次氏體(Rickettsia s'ibirica ) (ATCC No. VR151)和五日熱立克次氏體(Rochalimaea qui tana) (ATCC No. VR358)。減毒的 立克次體菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過(guò)引入上文描述志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組 中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定腸侵染性大腸桿菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明 的腸侵染性大腸桿菌的實(shí)例包括大腸桿菌菌株4608-58、1184-68、53638-C-17、13-80和 6-81 (Sansonetti 等 Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur)，132A :351-355 (1982))。減毒的腸侵染性大腸桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明并可通過(guò)引入上文描述志賀氏菌 屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。此外，因?yàn)槌?xì)菌之外的某些微生物也可與整聯(lián)蛋白分子(其為某些侵入因子 的受體)相互作用用于細(xì)胞吸收，此類微生物也可用于向靶細(xì)胞中引入RNA。例如，病毒， 例如口蹄病病毒、艾柯病毒和腺病毒，和真菌病原體，例如莢膜組織孢漿菌(Histoplasma capsulatum)和碩大利什曼原蟲(chóng)(Leishmania major)與整聯(lián)蛋白分子相互作用。2. 2較低侵入性的細(xì)菌可用于本發(fā)明并已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述為非侵入性的或至少比前文部分(2. 1)中列 出的細(xì)菌侵入性弱的細(xì)菌的實(shí)例包括，但不限于耶爾森菌屬物種(Yersinia spp.)、大腸桿 菌屬物種(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌屬物種(Klebsiella spp.)、博德特氏菌屬物種 (Bordetella spp.)、奈瑟氏球菌屬物種(Neisseria spp.)、氣單胞菌屬物種(Aeromonas spp.)、ft禾中(Franciesella spp.)、_ 木干胃 M 禾中(Corynebacterium spp.)、檸檬酸細(xì)菌屬物種(CitrcAacter spp.)、衣原體屬物種(Chlamydia spp.)、嗜 血菌屬物種(Hemophilus spp.)、布魯氏菌屬物種(Brucella spp.)、分枝桿菌屬物種 (Mycobacterium spp.)、軍團(tuán)桿菌屬物種(Legionella spp.)、紅球菌屬物種(Rhodococcus spp.)、假單胞菌屬物種(Pseudomonas spp.)、纏繞桿菌屬物種(Helicobacter spp·)、 弧菌屬物種(Vibrio spp.)、芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)和丹毒絲菌屬物種 (Erysipelothrix spp.)。修飾這些細(xì)菌以增加它們的侵入潛力是必需的。所用的特定耶 爾森菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的耶爾森菌菌株的實(shí)例包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 (Y. enterocolitica) (ATCC No. 9610)或鼠疫耶爾森氏菌(Y. pestis) (ATCC No. 19428)。 減毒的耶爾森菌菌株如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌k03-R2(al-Hendy等hfect. Immun.， 60 :870-875 (1992))或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 aroA (0 ‘ Gaora 等 Micro. Path.，9 105-116(1990))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘撸赏ㄟ^(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i) 到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒耶爾森菌菌株。所用的特定大腸桿菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的大腸桿 菌菌株的實(shí)例包括大腸桿菌 H10407 (Elinghorst 等 hfect. Immun. ,60 :2409-2417(1992)) 和大腸桿菌 EFC4、CFT325 和 CPZ005 (Donnenberg 等 J. Infect. Dis.，169 :831-838 (1994))。減毒的大腸桿菌菌株，如減毒的火雞病原體大腸桿菌02 carAB突變體(Kwaga等Infect. Immun. ,62 :3766-3772(1994))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘?，可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌 屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒大腸桿菌菌株。所用的特定克雷伯氏菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的克雷伯氏菌菌株的實(shí)例包括肺炎雷伯氏菌(K. pneumoniae) (ATCC No. 13884)。減毒的克雷伯氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌 屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定博德特氏菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的博德特氏菌菌株的實(shí)例包括氣管炎博德特氏菌 (B. bronchiseptica) (ATCC No. 19395)。減毒的博德特氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過(guò) 引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定奈瑟氏球菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的奈瑟氏 球菌菌菌株的實(shí)例包括腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis) (ATCC No. 13077)和淋病奈 瑟氏球菌(N. gonorrhoeae) (ATCC No. 19424)。減毒的奈瑟氏球菌菌株，如淋病奈瑟氏球菌 MSll aro 突變體(Chamberlain 等Micro. Path. , 15 :51-63(1993))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘?， 可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建 新的減毒奈瑟氏球菌菌株。所用的特定氣單胞菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜?本發(fā)明的氣單胞菌菌株的實(shí)例包括A. euCren0phila(ATCC No. 23309)。或者可通過(guò)引入上 文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒氣單 胞菌菌株。所用的特定弗朗西絲氏菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的弗朗 西絲氏菌菌株的實(shí)例包括土拉熱弗朗西絲氏菌(F. tularensis) (ATCC No. 15482)。減毒的 弗朗西絲氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到 (vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定棒桿菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的棒桿菌菌株 的實(shí)例包括假結(jié)核病棒桿菌(C. pseudotuberculosis) (ATCC No. 19410)。減毒的棒桿菌菌 株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一 個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定檸檬酸細(xì)菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的檸檬酸 細(xì)菌菌株的實(shí)例包括弗氏檸檬酸細(xì)菌(C. freundii) (ATCC No. 8090)。減毒的檸檬酸細(xì)菌菌 株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一 個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定衣原體菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的衣原體菌株 的實(shí)例包括C. pneumoniae (ATCC No. VRl 310)。減毒的衣原體菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通 過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定嗜血桿菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的嗜血桿菌 菌株的實(shí)例包括H. sornmis (ATCC No. 43625)。減毒的嗜血桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可 通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定布魯氏菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的布魯氏菌菌株的實(shí)例包括流產(chǎn)布魯氏菌(B. abortus) (ATCC No. 23448)。減毒的布魯氏菌菌株優(yōu)選用 于本發(fā)明，并可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)
減毒突變構(gòu)建。所用的特定分枝桿菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的分枝桿 菌菌株的實(shí)例包括胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracelhilare) (ATCC No. 13950)和結(jié)核分枝桿菌 (M. tuberculosis) (ATCC No. 27294)。減毒的分枝桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過(guò)引入 上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定軍團(tuán)桿菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的軍團(tuán)桿菌 菌株的實(shí)例包括L. pneumophila (ATCC No. 33156)。減毒的軍團(tuán)桿菌菌株，如L. pneumophila mip突變體(0tt，F(xiàn)EMS Micro. Rev. ,14 :161-176(1994))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘撸赏ㄟ^(guò)引 入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒 軍團(tuán)桿菌菌株。所用的特定紅球菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的紅球菌菌株 的實(shí)例包括R.equi(ATCC No. 6939)。減毒的紅球菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過(guò)引入上 文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定假單胞菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的假單胞菌 菌株的實(shí)例包括銅綠假單胞菌(P. aeruginosa) (ATCC No. 23267)。減毒的假單胞菌菌株優(yōu) 選用于本發(fā)明，并可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或 多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定纏繞桿菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的纏繞桿菌 菌株的實(shí)例包括H. mustelae (ATCC No. 43772)。減毒的纏繞桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可 通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建。所用的特定沙門(mén)氏菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的沙門(mén)氏 菌菌株的實(shí)例包括傷寒沙門(mén)氏菌(ATCC No. 7251)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(ATCC No. 13311)。 減毒的沙門(mén)氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明并包括傷寒沙門(mén)氏菌aroC aroD (Hone等Vacc， 9 :810-816(1991))和鼠傷寒沙門(mén)氏菌 aroA 突變體(Mastroeni 等 Micro. Pathol，13 477-491(1992)))。或者，可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的 一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒沙門(mén)氏菌菌株。所用的特定弧菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至 關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的弧菌菌株的實(shí)例包括霍亂弧菌(Vibrio cholerae) (ATCC No. 14035)和辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis) (ATCC No. 35912)。減毒的弧菌 菌株優(yōu)選用于本發(fā)明并包括霍亂弧菌RSI毒力突變體(Taylor等J. hfect. Dis.，170 1518-1523(1994))和霍亂弧菌 ctxA、ace、zot、c印突變體(Waldor 等 J. Infect. Dis.，170 278483(1994))?；蛘撸赏ㄟ^(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的 一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒弧菌菌株。所用的特定桿菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的桿菌菌株的實(shí) 例包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) (ATCC No. 6051)。減毒的桿菌菌株優(yōu)選用于本 發(fā)明并包括 B. anthracis 突變體 pXOl (WeIkos 等 Micro. Pathol, 14 :381-388 (1993))和減 毒的BCG菌株(Mover等Nat，351 :456-460 (1991))?；蛘?，可通過(guò)引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(Vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒桿菌菌株。所用的特定丹毒絲菌菌株對(duì)本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的丹毒絲 菌菌株的實(shí)例包括豬丹毒丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae) (ATCC No. 19414) 和扁桃體丹毒絲菌(Erysipelothrix tonsillarum) (ATCCNo. 43339) 減毒的沙門(mén)氏菌菌 株優(yōu)選用于本發(fā)明并包括豬丹毒丹毒絲菌Kg-Ia和Kg-2 (ffatarai等J. Vet. Med. Sci.， 55 :595-600(1993))和豬丹毒丹毒絲菌 ORVAC 突變體(Markowska-Daniel 等 ht. J.Med. Microb. Virol. Parisit. Infect. Dis.，277 :547-553 (1992))?；蛘?，可通過(guò)引入上文所述 用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個(gè)或多個(gè)減毒突變構(gòu)建新的減毒丹毒絲菌菌 株。2. 3用于增加菌株侵入性性質(zhì)的方法無(wú)論已經(jīng)將生物常規(guī)描述為侵入性的還是非侵入性的，可改造這些生物以增加它 們的侵入性性質(zhì)，例如通過(guò)模擬志賀氏菌屬物種、利斯特氏菌屬物種、立克次體屬物種、傷 寒沙門(mén)氏菌屬物種或腸侵染性大腸桿菌屬物種的侵入性質(zhì)。例如，可向微生物中引入使微 生物能夠進(jìn)入細(xì)胞(例如所述非侵入性細(xì)菌的天然宿主中的細(xì)胞)的細(xì)胞質(zhì)中的一個(gè)或多 個(gè)基因。本文稱為“細(xì)胞質(zhì)靶向基因”的此類基因的實(shí)例包括編碼能夠通過(guò)志賀氏菌，或腸 侵染性大腸桿菌的類似侵入基因，或利斯特氏菌的利斯特氏菌溶素0侵入的蛋白質(zhì)的基因， 像已知此類技術(shù)產(chǎn)生廣泛的能夠侵襲并進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的侵入細(xì)菌一樣(Formal 等 Infect. Immun. ,46 :465(1984) ；Bielecke 等 Nature，345 175-176 (1990) ；Small 等 Microbiology-1986,第 121-124頁(yè)，Levine等編著，American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1986) ；Zychlinsky 等 Molec. Micro.，11 :619-627(1994) ；Gentschev 等 (1995) Infection&Immunity 63 4202 ；Isberg, R. R.禾口 S. Falkow (1985) Nature 317:262; 和Isberg，R.R.等(1987)Cell 50:769)。用于向細(xì)菌菌株中轉(zhuǎn)移上述細(xì)胞質(zhì)靶向基因的 方法為本領(lǐng)域所熟知?？上蚣?xì)菌引入另一優(yōu)選基因以增加其侵入特征，該基因編碼來(lái)自假 結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的侵染素蛋白質(zhì)，(Leong等EMBO J. ,9 1979(1990))。侵染素也可與listeriolysin組合引入，由此，相對(duì)于引入任一這些基因，進(jìn) 一步增加細(xì)菌的侵入特征。為說(shuō)明性目的，已經(jīng)對(duì)上述基因做了描述；然而，對(duì)于本領(lǐng)域技 術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是來(lái)自一種或更多種來(lái)源的任何基因或基因組合將足夠，所述基因或基 因組合參與將分子，尤其是RNA或編碼RNA的DNA分子從微生物遞送到細(xì)胞，例如動(dòng)物細(xì)胞 的細(xì)胞質(zhì)中。因此，此類基因不限于細(xì)菌基因，并包括病毒基因，如流感病毒血凝素HA-2，其 促進(jìn)胞內(nèi)體裂解作用(endosmolysis) (Plank 等 J. Biol. Chem.，269 12918-12924 (1994))。 也可通過(guò)例如PCR擴(kuò)增從DNA獲得上述靶向細(xì)胞質(zhì)的基因，從攜帶期望的靶向細(xì)胞質(zhì)的基 因的侵入性細(xì)菌中分離所述DNA?？蓮谋绢I(lǐng)域，例如上文列出的參考文獻(xiàn)和/或在因特網(wǎng) (www. ncbi. nlm. nih. gov/)上可公開(kāi)獲得的GenBank中獲得的核苷酸序列設(shè)計(jì)PCR的引物。 可設(shè)計(jì)PCR引物以擴(kuò)增細(xì)胞質(zhì)靶向基因、細(xì)胞質(zhì)靶向操縱子、細(xì)胞質(zhì)靶向基因簇或細(xì)胞質(zhì) 靶向基因調(diào)節(jié)子。所用的PCR策略將依賴于細(xì)胞質(zhì)靶向基因或靶侵入性細(xì)菌中基因的遺傳 結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)PCR引物，使其含有與靶DNA序列開(kāi)始和末端的DNA序列同源的序列。然后可以 例如通過(guò)使用 Hfr 轉(zhuǎn)移或質(zhì)?；顒?dòng)(Miller，A Short Course in BacterialGenetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1992) ；Bothwell 等上文；和Ausubel等上文)、噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(de Boer，上文；Miller，上文；和Ausubel等上文)、 化學(xué)轉(zhuǎn)化(Bottiwell等上文；Ausubel等上文)、電穿孔(Bottiwel等上文；Ausubel等上文； 禾口Sambrook,MolecularCloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)和物理轉(zhuǎn)化技術(shù)(Johnston 等上文；和 Bothwell，上 文)將細(xì)胞質(zhì)靶向基因引入靶細(xì)菌菌株中。細(xì)胞質(zhì)靶向基因可整合到可溶性噬菌體中(de Boer等Cell，56 :641-649 (1989))，質(zhì)粒載體s (Curtiss等上文)或剪接到靶菌株的染色體 中(Hone等上文)。如上所述，除了遺傳改造細(xì)菌提高其侵入性性質(zhì)外，也可通過(guò)將侵入因子與細(xì)胞 連接，以修飾細(xì)菌。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用侵入因子，例如具有足夠侵入力的蛋白 質(zhì)侵染素、侵染素衍生物或其片段共價(jià)或非共價(jià)包被細(xì)菌致使細(xì)菌更具侵入性。事實(shí)上，已 經(jīng)顯示用來(lái)自假結(jié)核耶爾森氏菌的純化侵染素包被非侵入性細(xì)菌細(xì)胞或侵染素的羧基末 端192個(gè)氨基酸能夠進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Leong等EMBO J. 9 :1979(1990))。此外，侵染素 的羧基末端區(qū)包被的乳膠球被哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效內(nèi)化，如用抗體固定的侵染素包被的金黃 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株(綜述見(jiàn)于 Isberg 禾口 Trail van Nhieu Ann. Rev. Genet. 27 :395(1994))。或者，也可用特異性結(jié)合細(xì)菌進(jìn)入因子識(shí)別的表面分子的抗 體、其變體或其片段包被細(xì)菌。例如，已經(jīng)顯示如果用針對(duì)整聯(lián)蛋白分子，例如α5β1(稱 作與細(xì)菌侵染素蛋白質(zhì)相互作用的表面分子)的單克隆抗體包被細(xì)菌，那么它們則被內(nèi)化 (Isberg和Tran van Nhieu，上文)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法制備此類抗體。通過(guò)例如用 抗體包被細(xì)菌，使細(xì)菌與具有抗體識(shí)別的表面受體的真核細(xì)胞接觸，并根據(jù)上述方法監(jiān)測(cè) 細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存在來(lái)檢測(cè)抗體在調(diào)節(jié)細(xì)菌侵入力中的功效。用于連接侵入因子與細(xì)菌表面 的方法為本領(lǐng)域所知，包括交聯(lián)。3.靶細(xì)胞本發(fā)明提供用于向任何類型的靶細(xì)胞遞送RNA(或RNA編碼DNA)的方法，其中所 述RNA是miRNA或miRNA前體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶細(xì)胞”指細(xì)菌侵入的細(xì)胞，即具有用 于細(xì)菌識(shí)別必需的表面受體的細(xì)胞。優(yōu)選地，靶細(xì)胞是真核細(xì)胞。甚至更優(yōu)選地，靶細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。將“動(dòng)物細(xì)胞” 定義為來(lái)自或存在于多細(xì)胞生物中的有核的，不含葉綠體細(xì)胞，所述多細(xì)胞生物的分類 (taxanomic)位置位于動(dòng)物國(guó)界。該細(xì)胞可以存在于完整動(dòng)物、原代細(xì)胞培養(yǎng)物、外植體培 養(yǎng)物或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中。該細(xì)胞的特定組織來(lái)源并非對(duì)本發(fā)明至關(guān)重要。用于本發(fā)明的受 體動(dòng)物細(xì)胞對(duì)其并非至關(guān)重要，并包括出現(xiàn)在動(dòng)物國(guó)界內(nèi)的所有生物中的或來(lái)自動(dòng)物國(guó)界 內(nèi)的所有生物，如哺乳類、魚(yú)類、鳥(niǎo)類、爬行類的那些生物。優(yōu)選的動(dòng)物細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人、牛、綿羊、豬、貓、犬、山羊、馬和靈長(zhǎng)類細(xì) 胞。最優(yōu)選的動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是黏膜表面。某些腸病原體，例如大腸桿菌、志賀氏 菌、利斯特氏菌和沙門(mén)氏菌自然適合用于該應(yīng)用，因?yàn)檫@些生物具有粘著并侵入宿主黏膜 表面的能力(Kreig等上文)。因此，在本發(fā)明中，此類細(xì)菌可向宿主黏膜區(qū)室中的細(xì)胞遞送 RNA分子(miRNA或前體)或編碼RNA的DNA。盡管某些類型的細(xì)菌具有某一向性，即趨向優(yōu)選的靶細(xì)胞，可通過(guò)選擇對(duì)期望的 細(xì)胞類型具有向性的細(xì)菌或被修飾以能夠侵入期望細(xì)胞類型的細(xì)菌完成RNA或編碼RNA的DNA向某一類型細(xì)胞的遞送。因此，如上討論，例如可遺傳改造細(xì)菌以模擬黏膜組織向性和 侵入性性質(zhì)，由此允許所述細(xì)胞侵入黏膜組織，并向這些位點(diǎn)中的細(xì)胞遞送RNA或編碼RNA 的 DNA。細(xì)菌也可靶向其他類型的細(xì)胞。例如，可通過(guò)修飾細(xì)菌以在其表面上表達(dá)間 日瘧蟲(chóng)(Plasmodium vivax)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白質(zhì)_1或_2，或-1和-2 (其特異性 結(jié)合人和靈長(zhǎng)類中的紅細(xì)胞)，而使細(xì)菌靶向人和靈長(zhǎng)類的紅細(xì)胞(felinski等Cell， 69 :1213-1226(1992)).在另一實(shí)施方案中，修飾細(xì)菌以在其表面上具有脫唾液酸血 清類黏蛋白，其為肝細(xì)胞上脫唾液酸糖蛋白受體的配體OVu等J. Biol. Chem.，263 14621-14624(1988))。在另一實(shí)施方案中，用已經(jīng)顯示靶向質(zhì)粒吸收到具有胰島素 受體的細(xì)胞的胰島素多聚L賴氨酸包被細(xì)菌(Rosenkranz等Expt. Cell Res.，199 323-329 (1992))。還在本發(fā)明范圍內(nèi)的是被修飾以在其表面上具有允許肝細(xì)胞具有向 性的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的p60 (Hess等Infect. Immun. ,63 :2047-2053(1995))或 來(lái)自通過(guò)結(jié)合肝素、硫酸肝素和膠原引起特異性結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)的克魯茲錐蟲(chóng) (Trypanosoma cruzi)的 60kD 表面蛋白(Ortega-Barria 等 Cell,67 :411-421 (1991))的 細(xì)菌。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞可被修飾以變成遞送RNA的細(xì)菌的靶細(xì)胞。因此，可修飾 細(xì)胞以表達(dá)細(xì)菌識(shí)別的表面抗原(即侵入因子的受體)，用于其靶向進(jìn)入細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)向細(xì) 胞中引入編碼侵入因子的受體的核酸修飾細(xì)胞，使得表面抗原在期望條件下表達(dá)?；蛘?，可 用侵入因子的受體包被細(xì)胞。侵入因子的受體包括屬于整聯(lián)蛋白受體超家族的蛋白質(zhì)。多 種細(xì)菌和其他微生物識(shí)別的整聯(lián)蛋白受體類型的列表可見(jiàn)于例如Isberg和TranVan Nhieu Ann. Rev. Genet. 27 :395 (1994)。用于整聯(lián)蛋白亞基的核苷酸序列可見(jiàn)于例如在因特網(wǎng)上可 公共獲得的GenBank。如上所述，其他靶細(xì)胞包括魚(yú)類、鳥(niǎo)類和爬行類動(dòng)物細(xì)胞。下文中描述了對(duì)魚(yú)類、 鳥(niǎo)類和爬行類動(dòng)物細(xì)胞具有天然侵入性的細(xì)菌的實(shí)例?？商烊贿M(jìn)入魚(yú)類細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的細(xì)菌的實(shí)例包括，但不限于氣單胞菌(Aeromonas salminocida) (ATCC No. 33658)和殺鮭氣單胞菌(Aeromonasschuberii) (ATCC No. 43700)。 減毒的細(xì)菌優(yōu)選用于本發(fā)明，并包括A. salmonicidia vapA (Gustafson等J. MoI. Biol.， 237 :452-463(1994))或 A. salmonicidia 芳香族依賴性突變體(Vaughan 等 hfect. Immun. ,61 :2172-2181 (1993))。可天然進(jìn)入鳥(niǎo)類細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的細(xì)菌的實(shí)例包括，但不限于雞沙門(mén)氏菌 (Salmonella galinarum) (ATCC No. 9184)、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteriditis) (ATCC No. 4931)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(ATCC No. 6994)。減毒的細(xì)菌優(yōu)選于本發(fā)明并包括減毒的沙 門(mén)氏菌菌株如雞沙門(mén)氏菌(S. galinarum) cya crp突變體(Curtiss等(1987)上文)或腸 炎沙門(mén)氏菌(S. enteritidis)aroA芳香族依賴性突變體CVL30 (Cooper等hfect. Immun.， 62 :4739-4746(1994))?？商烊贿M(jìn)入爬行類動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的細(xì)菌的實(shí)例包括，但不限于鼠傷寒沙門(mén)氏菌 (ATCC No. 6994)。減毒的細(xì)菌優(yōu)選用于本發(fā)明并包括減毒的菌株如鼠傷寒沙門(mén)氏菌芳香族 依賴性突變體(Hormaeche等上文)。本發(fā)明還提供向其他真核細(xì)胞例如植物細(xì)胞遞送RNAOniRNA或其前體)，只要具有天然或已被修飾變得具有侵入性后能夠侵入此類細(xì)胞的微生物?？汕秩胫参锛?xì)胞的微生 物的實(shí)例包括根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumerfacium)，其使用通過(guò)特異受體結(jié)合植物細(xì) 胞的菌毛樣結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)與細(xì)菌結(jié)合類似的過(guò)程向植物細(xì)胞中遞送至少一些其內(nèi)容物。下文說(shuō)明的是根據(jù)本發(fā)明方法可向其中遞送RNA的細(xì)胞系。人類細(xì)胞系的實(shí)例包括但不限于ATCC No. CCL 62, CCL 159、HTB151、HTB 22, CCL 2、CRL 1634、CRL 8155、HTB 61 和 HTBl04 牛細(xì)胞系的實(shí)例包括 ATCC No. CRL 6021、CRL 1733,CRL 6033,CRL 6023,CCL 44 和 CRL 1390。綿羊細(xì)胞系的實(shí)例包括 ATCC No. CRL6540、 CRL 6538、CRL 6548 和 CRL 6546。豬細(xì)胞系的實(shí)例包括ATCC No. CL 184、CRL 6492 和 CRL 1746。貓細(xì)胞系的實(shí)例包括CRL 6077,CRL 6113,CRL 6140,CRL 6164,CCL 94,CCL 150、 CRL 6075 和 CRL 6123。水牛細(xì)胞系的實(shí)例包括CCL 40和CRL 6072。犬細(xì)胞系的實(shí)例包括ATCC No. CRL 6213, CCL 34, CRL 6202、CRL6225、CRL 6215、 CRL 6203 和 CRL 6575。山羊來(lái)源細(xì)胞系的實(shí)例包括ATCC No. CCL 73和ATCC No. CRL6270。馬來(lái)源細(xì)胞系的實(shí)例包括ATCC No. CCL 57和CRL 6583。鹿細(xì)胞系的實(shí)例包括ATCC No. CRL 6193-6196。靈長(zhǎng)類來(lái)源細(xì)胞系的實(shí)例包括來(lái)自黑猩猩的那些細(xì)胞系，如ATCC No. CRL 6312、CRL 6304 和 CRL 1868 ；猴細(xì)胞系如 ATCC No. CRL 1576、CCL 26 禾口 CCL 161 ；猩猩 (orangautan)細(xì)胞系 ATCC No. CRL 1850 ；和大猩猩細(xì)胞系 ATCC No. CRL 1854。4.藥物組合物在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有miRNA或其前體分子，和/或編碼此類分子的 DNA的侵入性細(xì)菌通過(guò)靜脈、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)口、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、骨內(nèi)、口 腔、浸入和尿道內(nèi)灌輸途徑弓I入動(dòng)物內(nèi)。本發(fā)明的細(xì)菌可凍干或加工成其孢子形式。待向受試者施用的本發(fā)明的活的侵入性細(xì)菌的量根據(jù)受試者的類別，以及待治療 的疾病或病征不同而不同。通常，所用的劑量將是每個(gè)受試者約IO3到IO15活菌，優(yōu)選約IO4 到IO12活菌。本發(fā)明的侵入性細(xì)菌通常與可藥用載體和/或稀釋劑一起施用。所用的特定可 藥用載體和/或稀釋劑對(duì)本發(fā)明并非至關(guān)重要。稀釋劑的實(shí)例包括磷酸緩沖鹽水、緩沖 胃中胃酸的緩沖液，如含有蔗糖的檸檬酸鹽緩沖液(PH7. 0)、單獨(dú)的碳酸氫鹽緩沖液(pH 7.0) (Levine 等 J. Clin. Invest, 79 :888-902(1987)；和 Black 等 J. Infect. Dis.，155 1260-1^5(1987))，或含抗壞血酸、乳糖和任選地天冬苯丙二肽酯的碳酸氫鹽緩沖液(pH 7. 0) (Levine等Lancet，11 :467-470 (1988))。載體的實(shí)例包括例如在脫脂牛奶中發(fā)現(xiàn)的蛋 白質(zhì)、糖(例如蔗糖)或聚乙烯吡咯烷酮。通常將以約0. 1-30% (w/v)，但優(yōu)選1-10% (w/ ν)范圍內(nèi)的濃度內(nèi)使用這些載體。下文所示是可用于遞送特異途徑的其他可藥用載體或稀釋劑。任何此類載體或 稀釋劑可用于施用本發(fā)明的細(xì)菌，只要所述細(xì)菌仍然能夠侵入靶細(xì)胞?？蛇M(jìn)行體外或體內(nèi) 測(cè)試侵入力來(lái)確定適當(dāng)?shù)南♂寗┖洼d體?？膳渲票景l(fā)明的組合物用于多種類型的施用，包括全身和局部施用或定域施用。也可包括凍干形式，只要細(xì)菌在接觸靶細(xì)胞或向受試者施 用后具有侵入性。技術(shù)禾口配制通常可見(jiàn)于Remmington' s Pharmaceutical Sciences, MeadePublishing Co.，Easton, Pa。對(duì)于全身施用，優(yōu)選注射，包括肌內(nèi)、靜脈、腹膜內(nèi)和 皮下施用。對(duì)于注射，可在液體溶液中，優(yōu)選在生理學(xué)相容的緩沖液如Hank' s溶液或 Ringer' s溶液中配制本發(fā)明的組合物，例如細(xì)菌。對(duì)于口服給藥，藥物組合物可以采取例如通過(guò)利用可藥用賦形劑，如結(jié)合劑(例 如預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素 或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉 羥乙酸鈉)；或濕潤(rùn)劑(例如十二烷基硫酸鈉)的常規(guī)手段制備的片劑或膠囊劑形式。可通 過(guò)本領(lǐng)域所熟知的方法包被所述片劑。用于口服給藥的液體制劑可采取例如溶液、糖漿劑 或懸浮液的形式，或者它們可呈現(xiàn)為干產(chǎn)品，在使用前用水或其他合適的載體構(gòu)建?？赏ㄟ^(guò) 利用可藥用添加劑如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(例 如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如杏仁油、油酯類(oily esters)、乙醇或分餾的植 物油)；和防腐劑(例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸)，用常規(guī)方法制 備此類液體制劑。所述制劑也含有緩沖鹽、增味劑、著色劑，適當(dāng)時(shí)還含有甜味劑?？蛇m當(dāng)?shù)嘏渲朴糜诳诜┯玫闹苿?，以給出活性化合物的可控釋放。對(duì)于口腔施 用，所述組合物可采取常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。對(duì)于吸入施用，使用合適的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙 烷、二氧化碳或其他合適氣體，以呈現(xiàn)自加壓包裝或噴霧器的噴霧劑形式常規(guī)遞送根據(jù)本 發(fā)明使用的藥物組合物。在加壓氣霧劑的情況下，可通過(guò)提供閥門(mén)遞送測(cè)定量來(lái)確定劑量 單元。可配制用于吸入器或吹出器中例如明膠的膠囊和藥筒，所述吸入器或吹出器含有組 合物的粉劑混合物，例如細(xì)菌和合適的粉劑基質(zhì)，如乳糖或淀粉。可配制藥物組合物用于通過(guò)注射，例如通過(guò)快速濃注或連續(xù)輸注來(lái)進(jìn)行腸胃外施 用?？梢詥挝粍┝啃问?，例如在安瓿或含有添加防腐劑的多劑量容器中提供用于注射的制 劑。所述組合物可采取這樣的形式，如油載體或水載體中的懸浮液、溶液或乳劑，并可含有 配制劑(formulatory agent)，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸钚猿煞挚梢允窃谑?用前用合適載體，例如滅菌注射用水構(gòu)建的粉劑形式。也可在直腸、陰道內(nèi)或尿道內(nèi)組合物中配制藥物組合物，例如含有常規(guī)栓劑基質(zhì) 如可可脂或其他甘油酯類的栓劑或保留灌腸劑。全身施用也可通過(guò)經(jīng)黏膜或經(jīng)皮途徑。對(duì) 于經(jīng)黏膜或經(jīng)皮施用，在制劑中使用適合于待滲透屏障的滲透劑。此類滲透劑通常為本領(lǐng) 域所知，并包括例如用于經(jīng)黏膜施用膽汁鹽和夫西地酸衍生物。此外，去污劑也用于促進(jìn)滲 透。經(jīng)黏膜施用可通過(guò)鼻腔噴霧或使用栓劑。對(duì)于局部施用，本發(fā)明細(xì)菌可配制成本領(lǐng)域 通常已知的軟膏劑、藥膏、凝膠或膏狀物，只要所述細(xì)菌在接觸靶細(xì)胞后仍然具有侵入性。如果需要，可在含有一個(gè)或多個(gè)單位劑量形式的包裝或分配裝置和/或藥盒中提 供組合物，所述單位劑量形式含有活性成分。所述包裝例如包含金屬或塑料薄片，如泡罩包 裝。所述包裝或分配裝置可具有用于施用的說(shuō)明書(shū)。含有待引入的miRNA/前體或編碼RNA的DNA的侵入性細(xì)菌可用于感染在體外培 養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞，如從受試者獲得的細(xì)胞。然后可將這些體外感染的細(xì)胞經(jīng)過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、 皮內(nèi)或腹膜內(nèi)，或通過(guò)允許細(xì)胞進(jìn)入宿主組織的任何灌輸途徑引入動(dòng)物，例如所述細(xì)胞最初來(lái)源的受試者。當(dāng)向個(gè)體細(xì)胞中遞送RNA時(shí)，所施用的活生物的劑量是每個(gè)細(xì)胞約0. 1 到106，優(yōu)選約IO1到IO4細(xì)菌的多重性感染。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，細(xì)菌也可向細(xì)胞，例如然后可從中收集或純化蛋白 質(zhì)的動(dòng)物細(xì)胞中遞送編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。例如，可在組織培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。通過(guò)以下不應(yīng)以任何形式解釋為限制的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。包括該 申請(qǐng)全文中引用的文獻(xiàn)、授權(quán)的專利、公開(kāi)的專利申請(qǐng)的所有引用參考文獻(xiàn)的內(nèi)容因此 明確地引入作為參考，但不認(rèn)為它們是本發(fā)明之前的現(xiàn)有技術(shù)。除非另行說(shuō)明，本發(fā)明 的實(shí)踐將使用本領(lǐng)域技術(shù)中的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生 物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。在參考文獻(xiàn)中詳細(xì)解釋了此類技術(shù)。參閱，例如 由 Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis 編著的 Molecular Cloning A LaboratoryManual, 第 2 版(Cold Spring Harbor Laboratory Press :1989) ；DNACloning,第 I 卷和第 II 卷(D. 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實(shí)施例材料和方法質(zhì)粒對(duì)于單個(gè)啟動(dòng)子質(zhì)粒，如下(圖2)構(gòu)建transkingdom miRNA(TMIR)質(zhì)粒。簡(jiǎn) 言之，含有多克隆位點(diǎn)(MCQ的退火寡核苷酸、T7啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(Qiagen合成)連接到 KSIK+)的平端BssHII位點(diǎn)中。編碼人Let-7miRNA(Let-7a)或其一個(gè)前體的DNA序列插 入MCS的BamHI和Mil位點(diǎn)中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pT7miRNA。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Let_7miRNA家族調(diào)節(jié)fcis 基因(Johnson, S.等，Cell，第 120 卷，635-64792005))。利用以下引物通過(guò)PCR (Pfx DNA 聚合酶，Invitrogen Inc.)從 pGB2Winv_hly (C. Grillot-Courvalin提供)擴(kuò)增Hly A基因并將其克隆到KSII (+)的EcoRV位點(diǎn)中hly-Ι :5，-CCCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTA-3' (SEQ IDNO :1)，和hly-2 :5，-AAGCTTTTAAATCAGCAGGGGTCTTTTTGG-3，(SEQID NO :2)。含有pGB2 Ω inv-hly 的 inv 基因座的 PstI 片段插入 KSII (+)/Hly ^ PstI 位點(diǎn)。 用BamHI和Mil切割Hly-Inv片段。補(bǔ)平后，將其連接到pT7miRNA的T7終止子中整合的 EcoRV位點(diǎn)中。所得編碼Let-7a miRNA或一個(gè)其前體的TiOR轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(BL21(DE3)PLysE)細(xì)胞中。過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞以允許表達(dá)和miRNA加工。對(duì)于兩個(gè)啟動(dòng)子的質(zhì)粒，構(gòu)建 T7-Therapeutic Pathway Identificationand ValidationCTPIV )質(zhì)粒，以包括具有兩個(gè)T7啟動(dòng)子的RNAi，盒(圖3)。使用標(biāo)準(zhǔn)的分 子克隆技術(shù)通過(guò)兩個(gè))(bal位點(diǎn)將所獲DNA分子克隆至質(zhì)粒中。所述質(zhì)粒還包括與TiOR質(zhì) 粒類似的Inv基因座和Hly基因座。對(duì)于載體構(gòu)建，按照標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將T7終止子復(fù)性，并用BamHIAbaI或 Xbal/Sall消化。隨后使用以下引物將終止子克隆至TPIV 載體的BamHlAbaI或)(baI/ Sail位點(diǎn)BamHI 正向5 ‘ ACGGATCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGTCTAGAGGATCCAC 3，(SEQ ID NO 3)BamHI 反向5’ GTGGATCCTCTAGACCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGATCCGT 3，(SEQ ID NO 4)SalI 正向5 ’ GCGTCGACTCTAGACCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGTCGACCG 3，(SEQ ID NO 5)SalI 反向:5 ’ CGGTCGACTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGTCTAGAGTCGACGC 3，(SEQ ID NO 6)miRNA 測(cè)定在37°C，MOI為1000時(shí)用大腸桿菌(BL21 (DE3)pLysE)細(xì)胞感染Hela細(xì)胞2小 時(shí)。感染M小時(shí)后，用TRIZOL(Invitrogen)收獲細(xì)胞RNA并在裂解緩沖液中提取蛋白質(zhì)。 使用OneSt印RT-PCR kit (Invitrogen)并用以下引物通過(guò)RT-PCR進(jìn)行k_Ras mRNA的擴(kuò) 增，以擴(kuò)增k-Ras mRNA的278堿基對(duì)片段5，-AGTACAGTGCAATGAGGGACCAGT(SEQ ID NO 7)禾口5' -AGCATCCTCCACTCTCTGTCTTGT(SEQ ID NO :8)。對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行染色并在瓊脂糖凝膠上電泳，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法 (包括RT-PCR、western印記和/或northern印記分析)觀察(圖4，左)。具體地，使用在12% SDS-PAGE凝膠上分離的50ug細(xì)胞提取物進(jìn)行western印記 分析以測(cè)定k-Ras蛋白質(zhì)水平。通過(guò)與單克隆k-Ras抗體(SantaCruz)孵育測(cè)定k-Ras蛋 白質(zhì)水平并通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(GEBiosciences)進(jìn)行觀察(圖4，右)。針對(duì)k-Ras的細(xì)菌介導(dǎo)的基于miRNA的基因調(diào)節(jié)實(shí)施例1 :miRNA前體的細(xì)菌表達(dá)如上述，將購(gòu)自 Integrated DNA Technologies, Inc.的人 Let_7miRNA (Let_7a) 的片段克隆至TiOR質(zhì)粒中。側(cè)接限制性酶切位點(diǎn)(BamHI/Sall)的Let_7a DNA具有以下序列(SEQID NO 9)5’ -GCGGATCCTGGGATGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTTAGGGTCACACCC
ACCACTGGGAGATAACTATACAATCTACTGTCTTTCCTAGTCGACCG-3，mRNA測(cè)定的結(jié)果示于圖4中。當(dāng)與對(duì)照(左)相比，k_Ras mRNA水平在用Let_7a miRNA處理的細(xì)胞中顯示僅稍微降低時(shí)，k-Ras蛋白質(zhì)水平中的降低不相稱地增加(右)，提 示了當(dāng)可能已經(jīng)發(fā)生了一些mRNA降解時(shí)，Let-7a miRNA引起的大多數(shù)基因調(diào)節(jié)很可能通 過(guò)翻譯阻抑(其為miRNA裝置的標(biāo)志)。這些數(shù)據(jù)清楚地顯示細(xì)菌可通過(guò)合成和加工miRNA 前體的miRNA裝置介導(dǎo)基因調(diào)節(jié)。實(shí)施例2 初級(jí)-miRNA的細(xì)菌表達(dá)將編碼人miR-155miRNA的初級(jí)-miRNA序列的DNA序列克隆至TiOR質(zhì)粒中。利用 質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)例中，初級(jí)-miRNA加工成miRNA前體在細(xì)胞中發(fā)生，伴隨在 與初級(jí)-miRNA序列相同的TMIR質(zhì)粒中或在不同的細(xì)菌表達(dá)載體上人Drosha的表達(dá)。在 另一實(shí)例中，初級(jí)-miRNA加工在感染的真核細(xì)胞中發(fā)生，而不需要細(xì)菌Drosha的表達(dá)。然后用轉(zhuǎn)化的細(xì)菌感染Hela細(xì)胞并使用所述測(cè)定分析Bachl mRNA和蛋白質(zhì)的水 平。miR-155 初級(jí)-miRNA 序列如下5’ -GTGGCACAAACCAGGAAGGGGAAATCTGTGGTTTAAATTCTTTATGCCTCATCCTCTGAGTGCTGAAGGCTTGCTGTAGGCTGTATGCTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTTTTTGCCTCCAACTGACTCCTACATATTAGCATTACAGTGTATGATGCCTGTTACTAGCATTCACATGGAACAAATTGCTGCCGTGGGAGGATGACAAAGAAGCATGAGTCACCCTGCTGGATAAACTTAGACTTCAGGCTTTATCATTTTTCAATCTGTTAATCATAATCTGGTCACTGGGATGTTCAACCTTAAACTAAGTTTTGAAAGTAAGG-3 ‘ (SEQ ID NO 10)實(shí)施例3 =HiiRNA雙鏈體的細(xì)菌表達(dá)將編碼人miR_155miRNA雙鏈體的兩條鏈的DNA序列克隆至TPIV 質(zhì)粒中。利 用質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化。然后用轉(zhuǎn)化的細(xì)菌感染Hela細(xì)胞并使用所述測(cè)定分析k-Ras mRNA 水平。所述miR_155miRNA雙鏈體序列如下FOR 5，-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3，(SEQ ID NO :11)REV 5，-CCCCTATCACGATTAGCATTAA-3，(SEQ ID NO :12)實(shí)施例4 :miRNA的細(xì)菌表達(dá)將編碼人miR-155miRNA序列的DNA序列克隆至TiOR質(zhì)粒中。利用質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)菌 轉(zhuǎn)化。然后用轉(zhuǎn)化的細(xì)菌感染Hela細(xì)胞并使用所述測(cè)定分析BachlmRNA和蛋白質(zhì)水平。所述miR_155miRNA 序列如下5，-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3，(SEQ ID NO :11)其他實(shí)施方案在以下的權(quán)利要求中。盡管已顯示并描述了若干實(shí)施方案，在不背 離本發(fā)明精神和范圍的情況下可進(jìn)行不同的修飾。
權(quán)利要求
1.至少編碼微小RNA(miRNA)或miRNA前體的DNA載體，其中所述miRNA能夠調(diào)節(jié)真 核、原核或病毒靶基因中至少一個(gè)的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的載體，其中所述miRNA前體是初級(jí)-miRNA。
3.權(quán)利要求1的載體，其中所述miRNA前體是miRNA前體。
4.權(quán)利要求1的載體，其中所述載體編碼雙鏈體miRNA，其中所述兩條miRNA鏈包含基 本互補(bǔ)的區(qū)域。
5.權(quán)利要求1的載體，其中所述miRNA是成熟的miRNA。
6.權(quán)利要求1的載體，其還包含原核啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求1的載體，其還包含真核啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求1的載體，其中所述至少一個(gè)靶基因是癌相關(guān)基因。
9.權(quán)利要求1的載體，其還編碼Hly基因。
10.細(xì)菌，其包含微小RNA(miRNA)、miRNA前體或至少編碼所述miRNA或所述前體的 DNA分子，其中所述miRNA能夠調(diào)節(jié)真核、原核或病毒靶基因中至少一個(gè)的表達(dá)。
11.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述前體是miRNA前體。
12.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述前體是初級(jí)-miRNA。
13.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是活的侵入性細(xì)菌。
14.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是活的侵入性細(xì)菌的衍生物。
15.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是非致病性且無(wú)毒性的。
16.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是選自利斯特氏菌、志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、大腸 桿菌和雙歧桿菌的減毒菌株。
17.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌選自耶爾森菌屬物種、大腸桿菌屬物種、克雷伯 氏菌屬物種、博德特氏菌屬物種、奈瑟氏球菌屬物種、氣單胞菌屬物種、弗朗西絲氏菌屬物 種、棒桿菌屬物種、檸檬酸細(xì)菌屬物種、衣原體屬物種、嗜血菌屬物種、布魯氏菌屬物種、分 枝桿菌屬物種、軍團(tuán)桿菌屬物種、紅球菌屬物種、假單胞菌屬物種、纏繞桿菌屬物種、沙門(mén)氏 菌屬物種、弧菌屬物種、芽孢桿菌屬物種、利什曼蟲(chóng)屬物種和丹毒絲菌屬物種，所述細(xì)菌已 經(jīng)經(jīng)過(guò)遺傳改造，以模擬志賀氏菌屬物種、利斯特氏菌屬物種、立克次體屬物種和腸侵染性 大腸桿菌屬物種的侵入性質(zhì)。
18.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其還包含能夠?qū)⑺銮绑w加工成接近成熟miRNA的酶或核酶。
19.權(quán)利要求18的細(xì)菌，其中所述酶是內(nèi)切核酸酶。
20.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其還包含細(xì)菌核糖核酸酶III、切酶、切酶樣酶、Drosha和 Pasha中的至少一種。
21.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其還包含酶，所述酶從所述細(xì)菌中釋放到靶真核細(xì)胞的細(xì)胞 質(zhì)后幫助轉(zhuǎn)運(yùn)遺傳物質(zhì)。
22.權(quán)利要求21的細(xì)菌，其中所述酶是Hly蛋白質(zhì)。
23.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其還包含控制所述DNA分子表達(dá)的原核啟動(dòng)子。
24.權(quán)利要求23的細(xì)菌，其中所述啟動(dòng)子是T7啟動(dòng)子。
25.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其還包含控制所述DNA分子表達(dá)的真核啟動(dòng)子。
26.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述DNA分子還編碼Hly基因。
27.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述真核基因是動(dòng)物基因。
28.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述真核基因是哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類基因。
29.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述至少一個(gè)靶基因是癌相關(guān)基因。
30.向動(dòng)物細(xì)胞遞送微小RNA(miRNA)或miRNA前體的方法，所述方法包括用權(quán)利要求 10-29中任一項(xiàng)的所述細(xì)菌感染所述動(dòng)物細(xì)胞。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
32.權(quán)利要求30的方法，其還包括在感染后裂解所述細(xì)菌。
33.在動(dòng)物細(xì)胞中調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的方法，所述方法包括步驟用權(quán)利要求10的所述細(xì)菌感染動(dòng)物細(xì)胞；和裂解所述細(xì)菌以釋放其內(nèi)容物，由此允許來(lái)自所述內(nèi)容物的miRNA或從所述內(nèi)容物產(chǎn) 生的miRNA與靶基因的mRNA相互作用，并由此調(diào)節(jié)所述基因的表達(dá)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述mRNA通過(guò)翻譯阻抑、mRNA降解或其兩者調(diào)節(jié)所述基 因表達(dá)。
35.在動(dòng)物中治療或預(yù)防病征的方法，所述方法包括通過(guò)用包含微小RNA(miRNA)、 miRNA前體，或至少編碼所述miRNA或所述前體的DNA分子的細(xì)菌感染動(dòng)物細(xì)胞，來(lái)調(diào)控所 述病征中已知涉及的至少一個(gè)靶基因的表達(dá)，其中所述miRNA能夠調(diào)節(jié)至少所述靶基因的表達(dá)。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類。
37.在動(dòng)物中治療或預(yù)防癌的方法，所述方法包括通過(guò)用包含微小RNA(miRNA)、miRNA 前體，或至少編碼所述miRNA或所述前體的DNA分子的細(xì)菌感染動(dòng)物細(xì)胞，來(lái)調(diào)控所述癌中 已知涉及的至少一個(gè)靶基因的表達(dá)，其中所述miRNA能夠調(diào)節(jié)至少所述靶基因的表達(dá)。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類。
39.在動(dòng)物中治療或預(yù)防由動(dòng)物中至少一個(gè)缺陷型微小RNA(miRNA)引起的病征的方 法，所述方法包括通過(guò)用包含所述miRNA的功能版本、所述功能性miRNA的RNA前體，或至 少編碼所述功能性miRNA或所述前體的DNA分子的細(xì)菌感染動(dòng)物細(xì)胞。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類。
41.在動(dòng)物中治療或預(yù)防由動(dòng)物中至少一個(gè)上調(diào)的微小RNA(miRNA)引起的病征的方 法，所述方法包括通過(guò)用包含所述miRNA的反義版本、所述miRNA反義版本的RNA前體，或 至少編碼所述反義版本或所述前體的DNA分子的細(xì)菌感染動(dòng)物細(xì)胞。
42.權(quán)利要求37的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類。
43.發(fā)現(xiàn)或確認(rèn)治療靶標(biāo)的方法，所述方法包括以下步驟用權(quán)利要求10的細(xì)菌感染動(dòng)物細(xì)胞；裂解所述細(xì)菌以釋放其內(nèi)容物；和研究底物與來(lái)自所述內(nèi)容物或從所述內(nèi)容物產(chǎn)生的miRNA之間的相互作用。
44.權(quán)利要求39的方法，其中所述底物調(diào)節(jié)所述miRNA。
45.權(quán)利要求39的方法，其中所述miRNA調(diào)節(jié)所述底物。
46.制備微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括以下步驟用至少編碼miRNA的原核載體感染至少一種細(xì)菌；在所述細(xì)菌中表達(dá)所述miRNA ；和從所述細(xì)菌中收集所述miRNA。
47.制備微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括以下步驟用至少編碼miRNA前體的第一個(gè)原核載體和編碼將所述miRNA前體加工成miRNA的至 少一種酶的第二個(gè)原核載體感染至少一種細(xì)菌； 在所述細(xì)菌中表達(dá)所述miRNA前體和所述酶；和 從所述細(xì)菌中收獲所述miRNA。
全文摘要
本發(fā)明提供合成、加工和/或使用細(xì)菌，優(yōu)選細(xì)菌的非致病性或治療性菌株向真核細(xì)胞中遞送miRNA或其前體，以在真核細(xì)胞中引起基因調(diào)節(jié)的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102149826SQ200880104973
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日
發(fā)明者C·李 申請(qǐng)人:波士頓生物醫(yī)藥公司