專利名稱：基因組減少的細(xì)菌的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本專利申請(qǐng)是提交于2002年1月23日的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/057,582和提交于2002年9月6日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/409,080的后繼部分，它們都全部納入本文供參考。
關(guān)于聯(lián)邦贊助研究或發(fā)展的聲明本發(fā)明得到美國(guó)政府支持進(jìn)行，由下列機(jī)構(gòu)授予NIH GM35682美國(guó)對(duì)此發(fā)明有一些權(quán)利。
背景技術(shù)：
細(xì)菌用于生成廣泛范圍的商業(yè)產(chǎn)品。例如，許多鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株和桿菌屬(Bacillus)菌株用于生成抗生素；脫氮假單胞菌(Pseudomonas denitrificans)和許多丙酸菌屬菌株用于生成維生素B12；一些其它細(xì)菌用于生成維生素核黃素；黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)分別用于生成賴氨酸和谷氨酸作為食物添加劑；其它細(xì)菌用于生成其它氨基酸作為食物添加劑；真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophas)用于生成可生物降解的微生物塑料；許多醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡萄糖酸菌(Gluconobacter)菌株用于生成醋。近來(lái)，細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)更常被遺傳改造和用作宿主細(xì)胞以在實(shí)驗(yàn)室以及工業(yè)設(shè)置中生成生物制劑，如蛋白質(zhì)和核酸。制藥業(yè)支持了一些成功產(chǎn)品的例子，它們是在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的人類蛋白質(zhì)。
正常細(xì)菌蛋白質(zhì)不利影響所需蛋白產(chǎn)物從工程菌中生成或純化不是不普遍。例如，當(dāng)大腸桿菌用作宿主細(xì)胞以產(chǎn)生大量基因編碼的所需產(chǎn)物，基因通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，一些正常大腸桿菌基因產(chǎn)物可干擾質(zhì)粒DNA的導(dǎo)入和維持。更重要的是，由于細(xì)菌產(chǎn)生蛋白質(zhì)中的細(xì)菌培養(yǎng)經(jīng)濟(jì)，通常純化重組蛋白的成本可大于生成成本，細(xì)菌宿主生成的一些天然蛋白質(zhì)對(duì)于純化問題敏感。此外，許多細(xì)菌菌株產(chǎn)生的毒素必須從正生成的靶蛋白中純化出且一些菌株能同時(shí)產(chǎn)生大小與靶蛋白接近的天然蛋白質(zhì)，從而使大小分離不能用于純化過(guò)程。
然而同樣，發(fā)酵罐中用于生成重組蛋白的細(xì)菌基因組包括許多不必需基因。在自然環(huán)境中生長(zhǎng)的細(xì)菌有許多條件響應(yīng)基因以提供機(jī)制在溫度、壓力或缺乏食物來(lái)源的困難環(huán)境條件中生存。發(fā)酵罐中生長(zhǎng)的細(xì)菌沒有這些問題并因而不需要這些條件響應(yīng)基因。細(xì)菌宿主將各增殖循環(huán)的代謝能量用于復(fù)制這些基因。因此，用于生成重組蛋白的細(xì)菌宿主所產(chǎn)生的不必需基因和不需要蛋白導(dǎo)致系統(tǒng)缺乏效率，這可被改進(jìn)。
使微生物基因組產(chǎn)生缺失不是很困難?？珊?jiǎn)單通過(guò)缺失基因組區(qū)域在生物體中進(jìn)行隨機(jī)缺失研究以確定生物體的什么特性由于缺失基因而失去。然而，基因組DNA特定區(qū)域進(jìn)行靶缺失更困難，如果發(fā)明目標(biāo)之一是缺失后不在生物體留下插入DNA更加困難，這里插入DNA定義為“瘢痕”。如果插入DNA即瘢痕區(qū)域在基因組缺失過(guò)程后留下，這些區(qū)域可作為不需要重組的位置，能切除所需或產(chǎn)生基因組重排的基因組區(qū)域。在確立一系列多種缺失時(shí)，前面步驟留下的瘢痕可作為隨后缺失步驟的人工靶。當(dāng)方法重復(fù)用于從基因組產(chǎn)生一系列缺失時(shí)更是如此。換句話說(shuō)，如果留下插入DNA，生物體由于缺失過(guò)程變成遺傳不穩(wěn)定。
發(fā)明概述本發(fā)明提供方法用于優(yōu)選減少生物體基因組而不在基因組中留下瘢痕。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種細(xì)菌，所具有的基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小至少百分之二(2％)到百分之二十(20％)?；蚪M優(yōu)選比其天然親代基因組小至少百分之七(7％)?；蚪M更優(yōu)選比其天然親代菌株基因組小至少百分之十四(14％)到百分之二十(20％)。當(dāng)用于生成產(chǎn)品時(shí)，具較小基因組的細(xì)菌可有一個(gè)或多個(gè)下列優(yōu)勢(shì)。第一，生產(chǎn)過(guò)程在資源消耗或生產(chǎn)速度、最終產(chǎn)生百分比或所有三個(gè)方面效率更高。第二，可簡(jiǎn)化產(chǎn)品純化過(guò)程或能產(chǎn)生更純的產(chǎn)物。第三，以前由于天然蛋白質(zhì)干擾不能生成的產(chǎn)品可被制成。第四，所需產(chǎn)品的每細(xì)胞產(chǎn)量可增加。
本發(fā)明也涉及生物體，優(yōu)選細(xì)菌，改造成具有“干凈基因組”即沒有例如遺傳物質(zhì)如一些細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝不必要的基因、插入序列(轉(zhuǎn)座因子)、假基因、原噬菌體、內(nèi)源限制性-修飾基因、致病基因、毒素基因、菌毛基因、周質(zhì)蛋白基因、侵襲素基因、未知功能序列和相同天然親代細(xì)菌屬的2個(gè)菌株中沒有共同發(fā)現(xiàn)的序列。培養(yǎng)中對(duì)細(xì)胞生存和一些蛋白質(zhì)生成不必需的其它DNA序列可被缺失。本發(fā)明基因組減少的細(xì)菌可看作基本的遺傳構(gòu)架，可加入多種遺傳元件以表達(dá)有用產(chǎn)物以及遺傳控制元件以提供前所未有的機(jī)會(huì)來(lái)精調(diào)或最優(yōu)化所需產(chǎn)物的表達(dá)。
本發(fā)明也提供材料和方法用于從細(xì)菌基因組中靶缺失基因和其它DNA序列而不從操作中留下任何剩余DNA(無(wú)瘢痕缺失)。由于本發(fā)明方法很少在缺失位置周圍的基因組DNA序列中引入突變或留下剩余DNA，該方法可用于產(chǎn)生一系列細(xì)菌中的突變而不增加基因組內(nèi)不需要的同源重組的可能性。一些這種方法也用于產(chǎn)生類似缺失，例如在噬菌體、天然質(zhì)粒等中，以及在高等生物體中如哺乳動(dòng)物和植物。
第一種缺失方法是以線性DNA為基礎(chǔ)。為進(jìn)行此過(guò)程，首先，在細(xì)菌中提供線性DNA構(gòu)建且細(xì)菌基因組區(qū)域通過(guò)細(xì)菌系統(tǒng)協(xié)助的同源重組被線性DNA構(gòu)建取代，系統(tǒng)能增加同源重組頻率。其次，前面導(dǎo)入細(xì)菌的分離基因表達(dá)序列特異性核酸酶以在位于線性DNA構(gòu)建上的獨(dú)特識(shí)別位置切細(xì)菌基因組。隨后，改造DNA序列包含的DNA與線性DNA構(gòu)建一個(gè)末端基因組DNA中的靶同源，此DNA序列用位于線性DNA構(gòu)建另一個(gè)末端的類似基因組DNA序列進(jìn)行同源重組。凈所得是基因組區(qū)域的確切缺失。
第二種方法也以線性DNA為基礎(chǔ)。兩種DNA序列，一種與待缺失的細(xì)菌基因組區(qū)域一個(gè)末端側(cè)翼序列相同而另一種與待缺失的細(xì)菌基因組區(qū)域另一個(gè)末端側(cè)翼序列相同，兩種DNA序列改造到載體中，在其中兩種序列彼此相鄰。至少一個(gè)序列特異性核酸酶識(shí)別位置也改造到載體中，在兩種序列的一側(cè)。載體導(dǎo)入細(xì)菌且通過(guò)在細(xì)菌中表達(dá)核酸酶來(lái)細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生線性DNA，核酸酶識(shí)別序列特異性核酸酶識(shí)別位置并切割本文的載體。線性DNA與細(xì)菌基因組進(jìn)行同源重組，由細(xì)菌系統(tǒng)協(xié)助以增加同源重組頻率。因而產(chǎn)生的細(xì)菌具有靶缺失且基因組中沒有剩余人為影響。
上述第二種方法也能用于使所需DNA序列取代細(xì)菌基因組的選擇區(qū)域。在此情況中，所需DNA序列可與選擇區(qū)域進(jìn)行同源重組并因此取代所選區(qū)域，所需DNA序列被改造到載體中。對(duì)于缺失靶區(qū)域，所有其它方面相同。
第三種方法以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)。本發(fā)明所用特定質(zhì)粒包含啟動(dòng)子控制的復(fù)制起點(diǎn)和可選擇標(biāo)記如抗生素抗性基因。為缺失細(xì)菌基因組的靶區(qū)域，含兩種彼此相鄰DNA序列的DNA插入片段被插到質(zhì)粒中，兩種DNA序列一種與待缺失的細(xì)菌基因組區(qū)域一個(gè)末端側(cè)翼序列相同而另一種與細(xì)菌基因組區(qū)域另一個(gè)末端側(cè)翼序列相同。隨后質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌并整合到細(xì)菌基因組中。其次，活化啟動(dòng)子以誘導(dǎo)從引入細(xì)菌基因組的異位來(lái)源復(fù)制，從而選擇重組。在許多細(xì)菌中，重組導(dǎo)致細(xì)菌基因組靶區(qū)域的精確缺失且可鑒定這些細(xì)菌。另一種選擇重組的方法是將序列特異性核酸酶識(shí)別位置改造到特定質(zhì)粒并在質(zhì)粒整合到細(xì)菌基因組后用序列特異性核酸酶切細(xì)菌基因組。
上述以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法也可用于使所需DNA序列取代細(xì)菌基因組的選擇區(qū)域。在此情況中，DNA插入片段被插到質(zhì)粒中，DNA插入片段包含的所需DNA序列可與選擇區(qū)域進(jìn)行同源重組并因此取代所選區(qū)域。對(duì)于缺失靶區(qū)域，所有其它方面相同。
本發(fā)明方法用于改造基因組減少的細(xì)菌以生成重組基因產(chǎn)物。這種工程菌可改進(jìn)這些蛋白質(zhì)生成，通過(guò)增加所需基因產(chǎn)物的生成效率和產(chǎn)量以及通過(guò)去除不必需細(xì)菌基因產(chǎn)物更有效純化產(chǎn)品。本發(fā)明優(yōu)選的基因組減少細(xì)菌中缺失一個(gè)或多個(gè)天然基因，天然基因編碼周質(zhì)蛋白和/或膜蛋白。
本發(fā)明也涉及DNAs和載體用于完成本發(fā)明方法、制備DNAs的方法和含小瓶的試劑盒，小瓶包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明載體和任選適當(dāng)?shù)木彌_液、引物、核酸內(nèi)切酶、核苷酸和聚合酶。
本發(fā)明也涉及活疫苗，包括本發(fā)明基因組減少的細(xì)菌或所含本發(fā)明基因組減少的細(xì)菌中導(dǎo)入DNA編碼致病生物的抗原決定簇，與能表達(dá)所述抗原決定簇的表達(dá)控制序列可操作相連。同樣在本發(fā)明范圍內(nèi)的活疫苗包括本發(fā)明基因組減少的細(xì)菌，其中導(dǎo)入DNA獲得自致病生物且任選具有復(fù)制起點(diǎn)，所述活疫苗能誘導(dǎo)宿主抗致病生物的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。所述DNA優(yōu)選在甲基化位點(diǎn)被甲基化。發(fā)明也涉及產(chǎn)生自致病生物的活疫苗，這是通過(guò)從此生物中缺失用于致病的基因而保持其它抗原決定簇。
發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)通過(guò)下列詳細(xì)描述而明顯。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示大腸桿菌K-12細(xì)菌基因組上候選缺失的基因和其它DNA序列位置，以最外層環(huán)上黑色和更淡陰影線盒表示。
圖2闡述了本發(fā)明以線性DNA為基礎(chǔ)的無(wú)瘢痕遺傳修飾方法的特定例子。
圖3闡述了本發(fā)明另一個(gè)以線性DNA為基礎(chǔ)的方法的特定例子。
圖4顯示突變質(zhì)粒，能用于圖3所示以線性DNA為基礎(chǔ)的方法。
圖5A-C闡述了本發(fā)明以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法的特定例子。
圖6顯示3種質(zhì)粒，能用于圖5A-C所示以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法。
發(fā)明詳述在其自然環(huán)境中的細(xì)菌暴露于許多在標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)或?qū)嶒?yàn)室生長(zhǎng)中通常不經(jīng)歷的條件，因此攜帶大量條件-依賴、壓力-誘導(dǎo)的基因或者在工業(yè)或?qū)嶒?yàn)室使用生物中不需的另外非必要基因。本發(fā)明一開始意識(shí)到細(xì)菌菌株基因組中所含的許多遺傳信息能被缺失而不有害影響細(xì)菌培養(yǎng)在工業(yè)加工中的使用或?qū)嶒?yàn)室重要性。意識(shí)到基因組減少的天然菌株可能在許多工業(yè)或?qū)嶒?yàn)室應(yīng)用中相對(duì)天然菌株有優(yōu)勢(shì)。例如，基因組減少的細(xì)菌至少代謝要求有些降低并因此能更有效生成所需產(chǎn)物。此外，基因組減少可導(dǎo)致天然產(chǎn)物更少和一些天然蛋白水平更低，使從剩余細(xì)菌蛋白中純化所需蛋白更簡(jiǎn)單。另外，一些細(xì)菌遺傳序列與不穩(wěn)定相關(guān)，可干擾標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)或?qū)嶒?yàn)室實(shí)踐，可能涉及昂貴且繁重的質(zhì)量控制過(guò)程。
本發(fā)明也包括一些方法用于從基因組中缺失基因組DNA而不留下任何插入DNA(無(wú)瘢痕缺失)。如果從構(gòu)成細(xì)菌基因組的單個(gè)DNA分子中進(jìn)行一些連續(xù)缺失，不留下任何插入DNA序列是重要的。這種插入序列如果留下，會(huì)是不需要重組的候選位置，不需要重組從細(xì)菌剩余基因組中缺失特征未確定且也許重要的部分或引起有不利影響的未預(yù)期基因組重排。由于基因組減少努力的目標(biāo)之一是增加細(xì)菌的遺傳穩(wěn)定性，留下任何插入DNA會(huì)與目標(biāo)相反并應(yīng)避免。因此，用于從基因組缺失DNA的方法變得重要且復(fù)雜。
一方面，本發(fā)明涉及的細(xì)菌基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小。為了示范目的，本文所述工作集中在普通實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)細(xì)菌大腸桿菌。本文所述基因組減少工作開始用實(shí)驗(yàn)室大腸桿菌菌株K-12，它在本文所述工作前具有的基因組為4,639,221個(gè)核苷酸或堿基對(duì)。本發(fā)明細(xì)菌可具有的基因組比其天然親代菌株基因組小至少百分之二(2％)，優(yōu)選超過(guò)百分之五(5％)，更優(yōu)選超過(guò)百分之七(7％)到百分之八(8％)到百分之十四(14％)到百分之十八(18％)到百分之二十(20％)，到百分之四十(40％)到百分之六十(60％)。術(shù)語(yǔ)“天然親代菌株”指在科學(xué)界通常理解的自然或天然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌菌株(或其它生物體)，它們的基因組上可進(jìn)行一系列缺失以產(chǎn)生基因組較小的細(xì)菌菌株。計(jì)算一系列缺失后基因組變小的百分比通過(guò)將“所有缺失后刪除的堿基對(duì)總數(shù)”除以“所有缺失前基因組中堿基對(duì)總數(shù)”再乘以100。
本發(fā)明的另一方面包括基因組較小的細(xì)菌，詳細(xì)描述了其中約5％到約10％的蛋白質(zhì)編碼基因。優(yōu)選約10％到約20％的蛋白質(zhì)編碼基因被缺失。在發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，約30％到約40％)到約60％的蛋白質(zhì)編碼基因被缺失。
一般說(shuō)來(lái)，可缺失的基因和其它DNA序列類型是其缺失不會(huì)不利影響細(xì)菌在特定生長(zhǎng)條件下生存和增殖的速度。不利效果水平是否可接受取決于特定應(yīng)用。例如，增殖速度減少30％對(duì)于一種應(yīng)用可接受但另一種不能。此外，基因組缺失DNA序列的不利效果可通過(guò)調(diào)節(jié)如改變培養(yǎng)條件來(lái)降低。這種調(diào)節(jié)可能使一種不能接受的不利效果轉(zhuǎn)變成可接受的。增殖速度優(yōu)選和親代菌株大致相同。然而，比親代菌株低約5％、10％、15％、20％、30％、40％到約50％范圍的增殖速度在發(fā)明范圍內(nèi)。更特定的是，本發(fā)明細(xì)菌的優(yōu)選倍增時(shí)間范圍可從約30分鐘到約3小時(shí)。
本發(fā)明細(xì)菌可通過(guò)本發(fā)明方法改造以最優(yōu)化它們對(duì)可用資源(如營(yíng)養(yǎng))的使用以生成所需產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可以是重組蛋白，非限制例子有胰島素、白介素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素、集落刺激因子、干擾素、抗體、抗體片段或任何其它有用的重組蛋白。重組產(chǎn)物可以是治療產(chǎn)品、疫苗成分、診斷產(chǎn)品或研究試劑。細(xì)菌也可能用作背景以表達(dá)工業(yè)有用的產(chǎn)品如商業(yè)有用的代謝中間物和末端產(chǎn)品如香草醛、莽草酸、氨基酸、微生物、有機(jī)酸等，以及不在細(xì)菌中天然產(chǎn)生但通過(guò)代謝途徑工程或其它遺傳操作生成的化學(xué)化合物-(參見例如美國(guó)專利號(hào)6,472,16和6,372,476，它們都納入本文供參考)。
下面大腸桿菌用作例子來(lái)闡明作為缺失候選的基因和其它DNA序列用于產(chǎn)生能更有效生成所需產(chǎn)物的細(xì)菌。所示一般原則和鑒定為缺失候選的基因和其它DNA序列類型可應(yīng)用于其它細(xì)菌屬或菌株。要理解的是下面鑒定為缺失候選的基因和其它DNA序列僅是例子。許多未鑒定的其它大腸桿菌基因和其它DNA序列也可缺失而不影響細(xì)胞生存和增殖到不能接受的水平。
假定在下述分析和方法中，靶細(xì)菌菌株噬菌體基因組或天然質(zhì)粒的至少部分DNA序列可用。優(yōu)選整個(gè)序列可用。這種完整或部分序列可獲得于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。當(dāng)然，現(xiàn)在發(fā)表了一些大腸桿菌菌株的完整基因組序列(例如Blattner等，Science，2771453-74，1997K-12菌株MG1655；也參見GenBank登錄號(hào)U00096；Pema等，Nature，409，529-533，2001；Hayashi等，DNA Res，8，11-22，2001和Welch等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA(2002)99(26)17020-17024和GenBank登錄號(hào)AE014075，所有都全部納入本文供參考)，如一些其它實(shí)驗(yàn)室常用細(xì)菌的序列。為開始缺失過(guò)程，分析細(xì)菌基因組以尋找作為好缺失候選的序列。當(dāng)然，這些技術(shù)也可應(yīng)用于基因組區(qū)域中部分測(cè)序的基因組，其序列數(shù)據(jù)可獲得或能確定。
在大腸桿菌、其它細(xì)菌以及高等生物中，可缺失的DNA序列類型包括一般會(huì)不利影響生物或此生物基因產(chǎn)物穩(wěn)定性的類型。這些引起不穩(wěn)定性的元件包括轉(zhuǎn)座因子、插入序列、可能在基因組不穩(wěn)定性中發(fā)揮作用的其它“自私DNA”因子。例如，插入序列(IS)元件和它們相關(guān)的轉(zhuǎn)座子通常發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌基因組，因此是缺失的靶。IS序列在大腸桿菌中普遍，它們都可被缺失。為了在此文獻(xiàn)中闡明，我們使用術(shù)語(yǔ)IS元件和轉(zhuǎn)座因子，一般稱為DNA元件，無(wú)論完整或缺陷都可從基因組一點(diǎn)移到另一點(diǎn)。IS元件在科學(xué)技術(shù)中有害效果的另一個(gè)例子是它們?cè)谟糜跍y(cè)序的增殖中從宿主大腸桿菌基因組跳到BAC質(zhì)粒。許多例子發(fā)現(xiàn)于人基因組和其它GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列。此現(xiàn)象可通過(guò)從宿主細(xì)胞中缺失所有IS元件來(lái)防止。對(duì)于特定應(yīng)用，其它與基因組不穩(wěn)定性相關(guān)的特定基因也可被缺失。
如圖1所示，闡明了在K-12菌株中大腸桿菌基因組天然包括4,639,221個(gè)堿基對(duì)。圖1顯示內(nèi)環(huán)上大腸桿菌K-12基因組(菌株MG1655)的堿基對(duì)位置刻度，沒有缺失(也參見Blattner等，同上)。下一個(gè)外面的環(huán)顯示K-12基因組區(qū)域，在相關(guān)菌株O157:H7中沒有或高度改變，因此能從K-12基因組中檢測(cè)。下一個(gè)外環(huán)顯示天然基因組中完整和部分的IS元件位置。其次的外環(huán)顯示RHS元件A到E和鞭毛和限制性區(qū)域位置，它們是缺失的特別靶。最外的環(huán)顯示實(shí)際對(duì)基因組進(jìn)行缺失的位置，也列于下表1和2。這些缺失組成原始K-12 MG1655基因組中約百分之14的堿基對(duì)。使用本發(fā)明方法，18％到20％到約40％基因組用本文所述設(shè)計(jì)范例來(lái)缺失。
另一個(gè)能缺失的大腸桿菌基因家族是限制性修飾系統(tǒng)基因和其它內(nèi)源核酸酶，其產(chǎn)物破壞外源DNA。這些基因?qū)τ诩?xì)菌在培養(yǎng)環(huán)境中存活和生長(zhǎng)不重要。這些基因也能通過(guò)破壞導(dǎo)入細(xì)菌的質(zhì)粒來(lái)干擾遺傳工程。限制性修飾系統(tǒng)基因在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其它DNA甲基化酶基因可再加入缺失大腸桿菌菌株以最優(yōu)化菌株用于一些使用，例如真核甲基化酶基因。
另外一個(gè)能缺失的大腸桿菌基因家族是鞭毛基因家族。鞭毛用于細(xì)菌運(yùn)動(dòng)。在天然環(huán)境中，細(xì)菌游泳以搜索營(yíng)養(yǎng)。在培養(yǎng)環(huán)境中，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)不重要且游泳行為在代謝上很昂貴，消耗超過(guò)1％的細(xì)胞能量而沒有益處。因此，可缺失鞭毛基因來(lái)產(chǎn)生基因組減小的細(xì)菌。鞭毛基因在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。
已提及的一類能缺失的大腸桿菌DNA元件是IS元件(或轉(zhuǎn)座因子)。IS元件對(duì)細(xì)菌在培養(yǎng)環(huán)境中存活和生長(zhǎng)不重要且已知干擾基因組穩(wěn)定性。因此，可缺失IS元件來(lái)產(chǎn)生基因組減小的細(xì)菌。IS元件在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。
另一類能缺失的大腸桿菌DNA元件是Rhs元件。所有Rhs元件共有3.7Kb Rhs核心，這是大同源重復(fù)區(qū)(在大腸桿菌K-12中有5個(gè)拷貝)，提供經(jīng)同源重組的基因組重排方法。Rhs元件是附加元件，主要在一些其它背景中進(jìn)化并在大腸桿菌作為屬分化后通過(guò)水平交換散布到大腸桿菌。Rhs元件在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。
一類能缺失的大腸桿菌基因組區(qū)域是非轉(zhuǎn)錄區(qū)，因?yàn)樗鼈兏豢赡軐?duì)細(xì)胞存活和增殖重要。另一類能缺失的大腸桿菌基因組區(qū)域是hsd區(qū)。hsd區(qū)編碼上述主要限制性修飾基因家族。非轉(zhuǎn)錄區(qū)和hsd區(qū)在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。
在本文所討論的基因選擇范例基礎(chǔ)上，原噬菌體、假基因、毒素基因、致病基因、周質(zhì)蛋白基因、膜蛋白基因也是能缺失的基因。大腸桿菌K-12序列(參見Blattner等，同上)與其近親O157:H7(參見Perna等，同上)序列比較后，論述22％(K-12)和46％(O157:H7)的蛋白質(zhì)編碼基因位于菌株特異島上，從1到約85kb隨機(jī)插入相對(duì)恒定的主鏈。
其它能缺失的基因是編碼噬菌體受體的基因，包括例如ton A(FhuA)和/或其完整操縱子fhu ABC，操縱子編碼裂解性噬菌體T1的受體。
鑒定另外基因和DNA序列作為缺失候選的一般方法是比較一個(gè)細(xì)菌菌株和一個(gè)或多個(gè)其它菌株的基因組。任何不存在于2或3個(gè)菌株的DNA序列是功能必需的可能性更小，因此可用于鑒定缺失候選。在下述例子中，比較2個(gè)大腸桿菌菌株O157:H7 EDL933和K-12 MG1655的完整基因組序列。在2個(gè)菌株中都沒有發(fā)現(xiàn)的DNA序列用于鑒定缺失靶。12個(gè)這樣從大腸桿菌菌株MG1655中鑒定的靶被缺失，產(chǎn)生的細(xì)菌菌株基因組小約8％?；蚪M減少的細(xì)菌生長(zhǎng)速度幾乎與天然親代MG1655菌株相同。
最近確定引發(fā)尿道疾病的大腸桿菌菌株CFT073H7(Welch等，同上)的DNA序列且其序列與K-12(MG1655)和O157:H7比較。結(jié)果顯示任意基因組中發(fā)現(xiàn)的所有編碼基因中僅約40％存在于所有基因組且CFT073、K-12和O157:H7包括67％、43％和68％菌株特異島基因。在此信息基礎(chǔ)上，多達(dá)約60％的蛋白編碼序列可從大腸桿菌中缺失。優(yōu)選至少5％或約90％或約15％或約21％的蛋白質(zhì)編碼基因被缺失。更優(yōu)選約30％的蛋白質(zhì)編碼基因被缺失。應(yīng)指出也許有些基因?qū)τ谝粋€(gè)菌株生長(zhǎng)必須而其它菌株生長(zhǎng)不需要。在這種情況中，菌株生長(zhǎng)必需基因不從此菌株中缺失或者如果缺失，用具互補(bǔ)功能的另一個(gè)基因取代以使此菌株能生長(zhǎng)。
在發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，序列信息用于從大腸桿菌基因組中選擇另外基因(用本發(fā)明方法)以產(chǎn)生約3.7兆堿基的基因組(比K-12小約20％)，基因組含73個(gè)缺失以去除約100個(gè)“島”且當(dāng)培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基時(shí)周圍DNAs仍使菌株能適當(dāng)生長(zhǎng)。設(shè)計(jì)也需要從基因組中完全去除任何剩余轉(zhuǎn)座因子(IS序列)。
周質(zhì)清除和蛋白質(zhì)表達(dá)由于本文所討論原因，本領(lǐng)域仍需要生成分泌到細(xì)菌周質(zhì)空間的重組蛋白且本發(fā)明方法提供細(xì)菌改造以最優(yōu)化周質(zhì)表達(dá)。
革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌有2層細(xì)胞膜，內(nèi)細(xì)胞膜和外細(xì)胞膜。2層膜通過(guò)周質(zhì)空間(PS)分離。有適當(dāng)信號(hào)序列的細(xì)菌蛋白經(jīng)內(nèi)細(xì)胞膜分泌到PS，通過(guò)至少2種不同系統(tǒng)Sec-系統(tǒng)和Tat-系統(tǒng)。(Danese等，Annu.Rev.Genet.(1998)3259-94；Fekes等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，(1999)63161-193；Pugsley，Microbiol.Rev.，(1993)5750-108[sic].Hynds等，(1998)J.Biol.Chem.27334868-34874；Santini等，(1998)EMBO J.17101-112；Sargent等，EMBO J.17101-112[TAT]，全部都納入本文供參考。
Sec-系統(tǒng)識(shí)別適當(dāng)信號(hào)肽和運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)以未折疊狀態(tài)到周質(zhì)，使用細(xì)胞質(zhì)ATP和電子原動(dòng)力。切割信號(hào)蛋白后，新蛋白通過(guò)伴侶肽基-脯氨酰異構(gòu)酶和硫氧還蛋白相關(guān)系統(tǒng)協(xié)助折疊，系統(tǒng)催化二硫鍵形成。參見例如Hynds等，(1998)J.Biol.Chem.27334868-34874；Santini等(1998)EMBO J.17101-112；Sargent等，EMBO J.17101-112[TAT]，全部都納入本文供參考。
與Sec-系統(tǒng)相反，Tat-系統(tǒng)運(yùn)輸充分折疊構(gòu)象的大蛋白且在識(shí)別適當(dāng)信號(hào)序列中更特異。我們選擇周質(zhì)，因?yàn)?1)它是表達(dá)異源重組蛋白的優(yōu)選位置，(2)對(duì)于控制條件中的工業(yè)使用，它有許多不需要蛋白，(3)它在許多不必需的適應(yīng)和控制系統(tǒng)中發(fā)揮作用，一些似乎有害。通過(guò)從周質(zhì)中去除天然蛋白質(zhì)，我們預(yù)期能大幅改進(jìn)生成蛋白質(zhì)的加工方法。在周質(zhì)中表達(dá)和分泌蛋白質(zhì)綜述于Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，1983，166(4)557-80頁(yè)；Hockney R.C，Trends Biotechnol.，1994，12(11)456-632頁(yè)；Hannig G.，等，Trends Biotechnol.，1998，16(2)54-60頁(yè)，全部都納入本文供參考。
有一些原因說(shuō)明周質(zhì)為何是蛋白質(zhì)生成的優(yōu)選位置；(1)它能生成氨基末端與天然蛋白相同的重組蛋白，而在細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)總是以氨基酸甲硫氨酸為起始；(2)許多蛋白質(zhì)能在周質(zhì)空間中正確折疊(3)正確的二硫鍵可在周質(zhì)氧化環(huán)境中形成；(4)周質(zhì)空間所含蛋白質(zhì)遠(yuǎn)少于細(xì)胞質(zhì)，簡(jiǎn)化純化(5)蛋白酶少于細(xì)胞質(zhì)，減少蛋白質(zhì)消化和損失；(6)通過(guò)破壞外膜，表達(dá)蛋白能和其它周質(zhì)蛋白容易釋放，幾乎沒有更豐富的細(xì)胞質(zhì)蛋白。周質(zhì)空間有天然酶系統(tǒng)，經(jīng)內(nèi)膜與細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)代謝相關(guān)以承擔(dān)這些加工任務(wù)，大概因?yàn)樵诖思?xì)胞器官中大部分內(nèi)和外膜蛋白被加工。相反，證明獲得細(xì)胞質(zhì)還原環(huán)境中表達(dá)的適當(dāng)折疊重組蛋白鏈很難。通常蛋白質(zhì)聚集成不溶的“內(nèi)含體”。初始內(nèi)含體純化可能較簡(jiǎn)單，蛋白質(zhì)需要再溶解和再折疊，此過(guò)程不能預(yù)期且難以控制，對(duì)于一些蛋白質(zhì)效率很低從而不能以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
重組蛋白一般通過(guò)表達(dá)融合蛋白在周質(zhì)中生成，其中它們附于導(dǎo)致分泌到周質(zhì)空間的信號(hào)肽。信號(hào)肽由特定信號(hào)肽酶很精確的切割。第二種重組人生長(zhǎng)因子生成由Genentech(Nutropin，所有指定信息)和Pharmacia通過(guò)此方法生產(chǎn)。不是所有的蛋白質(zhì)能通過(guò)此途徑成功生成，有證據(jù)表明分泌和分泌后加工系統(tǒng)有限制能力。同樣，仍有待處理的蛋白污染物。要注意的是對(duì)這種批準(zhǔn)產(chǎn)品有警告，它包含痕量大腸桿菌周質(zhì)蛋白，在一些病人中引起抗體生成(Gonotropin所有指定信息)。本發(fā)明材料和方法可減少或去除此問題。
本領(lǐng)域需要生成會(huì)分泌到PS的重組蛋白。完成此分泌可用Sec-或Tat-系統(tǒng)或各細(xì)菌中可用的任何其它分泌病原體。在任一情況中，適當(dāng)信號(hào)肽加入重組蛋白。如果使用Sec-系統(tǒng)，需要下列另外的實(shí)驗(yàn)。由于報(bào)導(dǎo)Sec-系統(tǒng)可通過(guò)高效表達(dá)構(gòu)建飽和，第1組實(shí)驗(yàn)是發(fā)展有最佳重組蛋白表達(dá)水平的系統(tǒng)，重組蛋白能在PS中適當(dāng)運(yùn)輸和折疊。
用于在本發(fā)明基因組減少細(xì)菌中周質(zhì)表達(dá)的重組DNA構(gòu)建包括編碼信號(hào)肽的第一個(gè)DNA序列，可操作連接于至少第二個(gè)編碼所需異源蛋白的DNA序列，信號(hào)肽能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)空間。信號(hào)序列可以是待表達(dá)蛋白固有的。運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)空間的蛋白質(zhì)優(yōu)選是生物活性。表達(dá)重組DNA構(gòu)建可在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型表達(dá)于宿主細(xì)菌的啟動(dòng)子控制下。當(dāng)使用已知可飽和的Sec系統(tǒng)時(shí)，使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有特定優(yōu)勢(shì)。例如，可使用以lac-為基礎(chǔ)的啟動(dòng)子/阻遏物，由非代謝半乳糖衍生物IPTG誘導(dǎo)。這種啟動(dòng)子可精調(diào)經(jīng)Sec系統(tǒng)的表達(dá)和分泌，從而最優(yōu)化周質(zhì)表達(dá)。
重組蛋白也可與伴侶/二硫鍵形成酶共表達(dá)以確保重組蛋白的適當(dāng)折疊。用于周質(zhì)表達(dá)重組蛋白的DNA序列包括但不限于美國(guó)專利號(hào)5,747,662；5,578,464；6,335,178和6,022,952、Thomas等，Mol-Micro，(2001)39(1)47-53；Weiner等，Cell，(1998)93，93-101；《分子生物的當(dāng)前操作》(Current Protocols in MolecularBiology)(1994)16.6.1-16.6.14(John Wiley等和Sons享有版權(quán)2000)所述，全部納入本文供參考。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，9個(gè)已知和3個(gè)推定周質(zhì)蛋白基因在構(gòu)建MDS40中成功缺失，沒有顯著影響生物在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力(見下表4和數(shù)據(jù))。這些突變影響一定范圍的功能，包括氨基酸吸收、無(wú)機(jī)代謝、細(xì)胞膜維持、糖代謝和粘附。
缺失約85個(gè)編碼已知或推定膜蛋白的基因，通過(guò)它們的信號(hào)肽序列鑒定。其中33個(gè)參與鞭毛結(jié)構(gòu)或生物合成；9個(gè)參與菌毛結(jié)構(gòu)或生物合成；13個(gè)參與一般分泌途徑。剩余的具有多種細(xì)胞膜中已知或推定功能。認(rèn)為許多這些蛋白質(zhì)在周質(zhì)空間中加工。它們也在構(gòu)建MDS40中缺失，沒有顯著影響生物在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力。
通過(guò)在注釋MG1655數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索信號(hào)肽-類似序列，將這些與文獻(xiàn)相互關(guān)聯(lián)，我們鑒定了181個(gè)蛋白質(zhì)，大部分被認(rèn)為是固有(resident)周質(zhì)蛋白。一些這種蛋白根據(jù)功能分成幾組排除粘附和移動(dòng)；營(yíng)養(yǎng)和鹽吸收、痕量因子吸收；環(huán)境感覺；防御和保護(hù)；周質(zhì)蛋白分泌和加工。在缺失或待缺失的基因或完全操縱子中，編碼糖和氨基酸運(yùn)輸?shù)鞍椎幕蚧蛲耆倏v子不可能為了生物制藥生產(chǎn)需要用于成分明確的基本培養(yǎng)基。
為監(jiān)控重組蛋白運(yùn)輸?shù)絇S的效率，3種商業(yè)購(gòu)買標(biāo)記大腸桿菌堿性磷酸酶、水母(Aequoria)綠色熒光蛋白(GFP)或人生長(zhǎng)激素蛋白可根據(jù)上述方法使用。人生長(zhǎng)激素蛋白目前最優(yōu)選用于最終證明目的且用于ELISA和以基因芯片為基礎(chǔ)測(cè)量重組蛋白定位到PS。
可測(cè)試從基因組缺失一個(gè)或幾個(gè)基因或其它DNA序列的結(jié)果。例如，基因組的一個(gè)或幾個(gè)基因或其它DNA序列被缺失后，能可測(cè)量所得細(xì)菌的生存和增殖速度。盡管大部分上面鑒定的基因或其它DNA序列可沒有有害效果地缺失用于生成所需產(chǎn)物，缺失特定基因或其它DNA序列可能有不可接受的后果如細(xì)胞死亡或增殖速度減少水平不能接受。由于基因功能冗余和生物途徑間的相互作用，存在此可能性。一些缺失在沒有另外缺失的菌株中可存活，僅在結(jié)合其它缺失時(shí)會(huì)有害。由于用于鑒定缺失候選的一些方法，也存在此可能性。例如，用于鑒定缺失候選的一種方法是比較兩個(gè)大腸桿菌菌株并選擇不在兩個(gè)菌株中都存在的基因或其它DNA序列。盡管大部分這些基因和其它DNA序列不可能是功能必需，一些可能對(duì)獨(dú)特菌株重要。另一種用于鑒定缺失候選的方法是鑒定非轉(zhuǎn)錄區(qū)，可能一些非轉(zhuǎn)錄區(qū)對(duì)基因組穩(wěn)定性重要。
缺失一個(gè)或幾個(gè)基因或其它DNA序列的測(cè)試結(jié)果取決于應(yīng)用目的。例如，當(dāng)高生成效率是主要關(guān)注時(shí)，許多應(yīng)用也確實(shí)如此，缺失對(duì)增殖速度和培養(yǎng)基消耗速度的效果可以是測(cè)試結(jié)果。在此情況中，測(cè)試結(jié)果也可更特異作為特定產(chǎn)物的生成速度量和每細(xì)胞產(chǎn)量。當(dāng)去除天然蛋白污染物是主要關(guān)注時(shí)，更少的天然蛋白和更低的天然蛋白水平或缺乏特定天然蛋白可以是測(cè)試結(jié)果。
當(dāng)對(duì)于基因或其它DNA序列所知甚少時(shí)，測(cè)試缺失一個(gè)基因或其它DNA序列的結(jié)果是重要的。盡管艱苦，這是另一種鑒定缺失候選以產(chǎn)生基因組減少細(xì)菌的可行方法。當(dāng)通過(guò)其它方法鑒定的候選被缺失且正尋找另外候選時(shí)，此方法特別有用。
當(dāng)缺失一個(gè)基因或其它DNA序列對(duì)細(xì)菌在一組條件下存活有影響時(shí)，一種不缺失特定基因或其它DNA序列的另外選擇是確定是否有調(diào)節(jié)能減輕有害效果。例如，如果缺失脂多糖(LPS)基因?qū)е麓婊畈?，這是由于細(xì)胞膜缺乏LPS蛋白的擴(kuò)膜結(jié)構(gòu)域引起更多孔的細(xì)胞膜，可改變培養(yǎng)條件以適應(yīng)更多孔的細(xì)胞膜從而缺乏LPS基因的細(xì)菌能和攜帶LPS基因的細(xì)菌生存的一樣好。
從細(xì)菌基因組缺失DNA序列的方法對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，能用于產(chǎn)生基因組減少的細(xì)菌。這些方法的例子包括但不限于Posfai，G.等，J.Bacteriol.1794426-4428(1997)，Muyrers，J.P.P.等，Nucl.Acids Res.271555-1557(1999)，Datsenko，K.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.976640-6649(2000)和Posfai，G.等，Nucl.AcidsRes.274409-4415(1999)所述，全部納入本文供參考?；旧?，缺失方法可分成以線性DNAs為基礎(chǔ)和以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)。Muyrers，J.P.P.等，Nucl.AcidsRes.271555-1557(1999)和Datsenko，K.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.976640-6649(2000)所述方法是以線性DNAs為基礎(chǔ)的方法且Posfai，G.等，J. Bacteriol.1794426-4428(1997)和Posfai，G.等，Nucl.Acids Res.274409-4415(1999)所述方法是以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法。
一些從細(xì)菌基因組缺失DNA序列的已知方法在缺失過(guò)程中將外源DNA序列導(dǎo)入基因組，因此如果任何方法在細(xì)菌中使用超過(guò)一次，有產(chǎn)生不需要同源重組的潛在問題。為避免此問題，優(yōu)選無(wú)瘢痕的缺失方法。無(wú)瘢痕缺失指DNA從基因組精確缺失而不在缺失位置產(chǎn)生任何其它突變且不在生物基因組留下任何插入DNA。然而由于錯(cuò)誤如PCR擴(kuò)增和DNA修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生的，無(wú)瘢痕缺失中可偶爾引入一個(gè)或兩個(gè)核苷酸變化。下面描述一些新的無(wú)瘢痕缺失方法，或以線性DNA為基礎(chǔ)或以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)。這些新方法在下述例子中應(yīng)用于大腸桿菌菌株。要理解的是例子中用于大腸桿菌菌株的特定載體和條件可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員修改用于其它細(xì)菌。類似方法和質(zhì)粒能用于在高等生物中產(chǎn)生類似效果。在一些情況中，更適合修飾現(xiàn)有生產(chǎn)菌株而不是將生產(chǎn)轉(zhuǎn)移到最小基因組的大腸桿菌菌株。
本發(fā)明方法不限于使用基因組減少的細(xì)菌，例如本發(fā)明方法可用于從噬菌體中缺失DNA如P1、P2、λ和其它噬菌體。這些方法能改造噬菌體基因組以改進(jìn)它們的有用性質(zhì)和/或減少或去除一些有損這種噬菌體用于多種目標(biāo)的性質(zhì)。類似的，本發(fā)明方法用于修飾細(xì)菌中的質(zhì)粒以從質(zhì)粒中去除有害因子(如毒性基因)和改進(jìn)質(zhì)粒的其它有用性質(zhì)。
上述熟知的普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體P1用于將DNA片段轉(zhuǎn)導(dǎo)入受體大腸桿菌。然而，一些P1的基因特征最終限制用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的吸收和包裝基因組DNA的能力。特定的是，P1包裝位置(pac)位點(diǎn)是GATC豐富區(qū)，當(dāng)通過(guò)P1的dam甲基化酶甲基化時(shí)限制基因組DNA進(jìn)入噬菌體包被的量。然而缺乏dam相關(guān)的包裝位置甲基化時(shí)，包裝DNA變得“肥大”，即比包裝位置被甲基化時(shí)更易包裝基因組DNA部分。因此，用本發(fā)明方法改造P1基因組以去除dam基因有優(yōu)勢(shì)，從而提高吸收和包裝基因組物質(zhì)dam的能力。
另一個(gè)與使用P1轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的缺點(diǎn)是噬菌體攜帶兩個(gè)插入序列。在插入序列上發(fā)現(xiàn)IS1在P1基因組的ssb和prt基因座之間。另一個(gè)IS5在res基因中。結(jié)果，可能當(dāng)P1用于轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，一個(gè)或多個(gè)插入序列會(huì)最終跳到生物基因座中。因此，用本發(fā)明方法改造P1基因組以缺失IS序列有優(yōu)勢(shì)，從而防止P1用作轉(zhuǎn)導(dǎo)子時(shí)的基因組污染。
在上面描述中，本發(fā)明結(jié)合特定例子描述。要理解的是本發(fā)明不限于這些例子，而要構(gòu)建成在所附權(quán)利要求確定的精神和范圍內(nèi)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是基因組減少的費(fèi)氏志賀氏菌(Shigella flexner)。最近，確定費(fèi)氏志賀氏菌2a菌株2457T的完整基因組序列。(測(cè)序菌株重保存于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，登錄號(hào)ATCC 700930)。費(fèi)氏志賀氏菌基因組由4,599,354個(gè)堿基對(duì)(bp)的單環(huán)染色體組成，G+C含量為50.9％。由于細(xì)菌顯示廣泛的同源性，分配染色體的堿基對(duì)1與大腸桿菌K-12的堿基對(duì)一相應(yīng)?；蚪M顯示有約4082個(gè)預(yù)測(cè)基因，平均大小為873個(gè)堿基對(duì)。費(fèi)氏志賀氏菌基因組表現(xiàn)出大腸桿菌病原體的主鏈和島鑲嵌結(jié)構(gòu)，雖然水平轉(zhuǎn)移的DNA少很多且缺乏大腸桿菌中存在的357個(gè)基因。(參見Perna等，(2001)Nature，409，529-533。生物體的獨(dú)特在于在其大的插入序列補(bǔ)充、一些基因組重排、12個(gè)隱性原噬菌體、372個(gè)假基因和195個(gè)志賀氏菌特異基因。完整的費(fèi)氏志賀氏菌注釋序列保存于GenBank，登錄號(hào)AE014073，納入本文供參考。(也參見《費(fèi)氏志賀氏菌血清型2A菌株2457T的完整基因組序列和比較基因組學(xué)》(Complete Genome Sequence and ComparativeGenomics of shigella flexner Serotype 2A strain 2457T)，Wei等，提交待發(fā)表)。令人驚訝的是注意到在其DNA序列基礎(chǔ)上，志賀氏菌在系統(tǒng)發(fā)生上與大腸桿菌無(wú)法區(qū)別。
從此說(shuō)明中顯然有費(fèi)氏志賀氏菌序列，其基因組序列可用本文所討論方法和基因選擇范例來(lái)減少。由于本文所討論關(guān)于基因組減少的大腸桿菌(活疫苗)的原因，基因組減少的志賀氏菌能用于表達(dá)異源(重組)蛋白或其它有用營(yíng)養(yǎng)。另一種基因組減少的志賀氏菌使用或?qū)Υ巳魏沃虏〖?xì)菌易受本發(fā)明缺失方法影響的是作為載體用于展示或呈遞抗原以誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)。這種工程志賀氏菌能例如將用于毒性的基因從生物中缺失而維持其它基因如編碼抗原決定簇的基因，足以誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)和優(yōu)選在宿主腸壁中的粘膜免疫反應(yīng)。
費(fèi)氏志賀氏菌可能很適于此策略，因?yàn)槠涠拘詻Q定簇特征被確定且定位于210-kb“大毒性(侵入)質(zhì)?！保浜塑账嵝蛄斜淮_定并保存于GenBank，登錄號(hào)AE348706，納入本文供參考。(也參見Venkatesan等，Infection of Immunity(2001年5月)，3271-3285)。侵入質(zhì)粒中可能的缺失候選是編碼賴氨酸脫羧酶的cadA基因。
缺失的志賀氏菌侵入質(zhì)?？蓪?dǎo)入基因組減少的大腸桿菌，從而可有效表達(dá)一些志賀氏菌侵入質(zhì)?；?，在接種大腸桿菌的宿主中能引起免疫反應(yīng)。也能改造侵入質(zhì)粒以從質(zhì)粒中缺失有害基因如用于破壞液泡的基因。從侵入質(zhì)粒去除的優(yōu)選候選基因包括一個(gè)或多個(gè)選自ipaA、ipaB、ipaC、ipaD和virB的基因。本發(fā)明也可加入其它基因到基因組減少的大腸桿菌，侵入質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌以最優(yōu)化來(lái)自導(dǎo)入、修飾侵入質(zhì)粒的基因表達(dá)。
本發(fā)明也涉及活疫苗，包括例如基因組減少的大腸桿菌或例如導(dǎo)入編碼抗原基因的基因組減少大腸桿菌，在接種疫苗的宿主中能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)?；蚪M減少的疫苗可以是以DNA為基礎(chǔ)的疫苗，所含DNA已知能誘導(dǎo)宿主中的所需生理反應(yīng)(即免疫反應(yīng))。
根據(jù)本發(fā)明的基因組減少生物的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是提供干凈、最小遺傳背景，其中可導(dǎo)入DNA不僅能表達(dá)所需分子，也提供機(jī)會(huì)將另外的DNAs導(dǎo)入干凈背景以提供能最優(yōu)化所需產(chǎn)物表達(dá)的分子來(lái)源。
缺失方法構(gòu)建線性靶DNA構(gòu)建線性靶DNA的例子如下為產(chǎn)生引物a+b(圖1)，20pmol的引物a混合20pmol的引物b，PCR在總共50μl體積中進(jìn)行。循環(huán)參數(shù)為15×(94℃ 40秒/57℃或更低[取決于引物a和b間重疊程度]40秒/72℃ 15秒)。其次，1μl的此PCT產(chǎn)物混合各20pmol的引物a和c(圖1)、50ng pSG76-CS模板，第二輪PCR在2×50μl體積中進(jìn)行。循環(huán)參數(shù)為28×(94℃ 40秒/57℃ 40秒/72℃80秒)。所得PCR產(chǎn)生的線性DNA片段用Promega Wizard PCR purification試劑盒純化并懸浮于20μl水。不需要去除模板質(zhì)粒(如通過(guò)DpnI消化)。pSG76-CS作為模板質(zhì)粒通過(guò)PCR產(chǎn)生線性靶片段。它包含氯霉素抗性(CmR)基因和2個(gè)I-SceI位點(diǎn)，通過(guò)PCR-調(diào)節(jié)插入第二個(gè)I-SceI位點(diǎn)來(lái)獲得以及通過(guò)PCR-調(diào)節(jié)插入第二個(gè)I-SceI識(shí)別位點(diǎn)到pSG76-C的NotI位點(diǎn)下游來(lái)獲得。2個(gè)I-SceI位點(diǎn)方向相反。
新的以線性DNA為基礎(chǔ)的無(wú)瘢痕缺失方法I當(dāng)下列描述根據(jù)圖2閱讀時(shí)，可最好的理解本發(fā)明以DNA為基礎(chǔ)的新無(wú)瘢痕缺失方法。一般說(shuō)來(lái)，方法包括用人工DNA序列取代基因組片段，標(biāo)記缺失。人工序列包含一個(gè)或多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)用于序列特異性核酸酶如I-SceI，它切割的序列不在大腸桿菌K-12基因組任何地方天然出現(xiàn)。精確插入線性DNA分子到基因組通過(guò)系統(tǒng)協(xié)助的同源重組完成，系統(tǒng)可增加同源重組頻率。當(dāng)序列特異性核酸酶導(dǎo)入細(xì)菌時(shí)，它在獨(dú)特識(shí)別位點(diǎn)切割基因組DNA，僅發(fā)生同源重組的細(xì)菌會(huì)存活。
特別提到圖2，質(zhì)粒pSG76-CS用作模板以合成人工DNA插入片段。人工插入序列在圖2中命名為A、B和C的序列間延伸。CR表示抗生素抗性基因。插入DNA從質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增并電穿孔到大腸桿菌宿主。構(gòu)建插入從而序列A和B配對(duì)宿主基因組中跨計(jì)劃缺失的序列。隨后選擇抗生素抗性的細(xì)菌，選擇使只有發(fā)生同源重組的細(xì)菌會(huì)存活，其中人工DNA插入細(xì)菌基因組。此重組在序列A和C對(duì)間發(fā)生。插入DNA序列也包括現(xiàn)位于插入一個(gè)末端的序列B，設(shè)計(jì)成與插入另一個(gè)末端外的基因組序列同源，如圖2所示。然后在細(xì)菌生長(zhǎng)后，細(xì)菌用質(zhì)粒pSTKST轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒表達(dá)I-SceI序列特異性核酸酶。I-SceI酶切割細(xì)菌基因組，僅發(fā)生重組的個(gè)體會(huì)存活。10-100％的存活子是B到B重組存活子，可通過(guò)篩選步驟鑒定。B到B重組從基因組中缺失整個(gè)插入DNA，只留下缺失周圍的天然序列。
為了重復(fù)，此方法的第一個(gè)步驟包括在細(xì)菌中提供線性DNA分子。線性DNA分子包含具下列特征的人工線性DNA序列線性DNA序列的一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域左側(cè)翼基因組序列相同的序列，接著是與待缺失基因組區(qū)域右側(cè)翼基因組序列相同的序列；線性DNA序列的另一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域中基因組序列相同的序列；線性DNA兩個(gè)末端間有一個(gè)不存在于細(xì)菌菌株基因組的識(shí)別位點(diǎn)和抗生素選擇基因。人工DNA序列可用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或定向DNA合成來(lái)產(chǎn)生。用于此目的的PCR模板包含獨(dú)特識(shí)別位點(diǎn)且人工線性DNA序列2個(gè)末端的基因組DNA序列是用于PCR反應(yīng)的部分引物。PCR模板可由質(zhì)粒提供。能用作模板的一個(gè)質(zhì)粒例子是pSG76-C(GenBank登錄號(hào)Y09893)，描述于Posfai，G.等，J. Bacteriol.1794426-4428(1997)。也可使用pSG76-CS(GenBank登錄號(hào)AF402780)，它獲得自pSG76-C。pSG76-CS包含氯霉素抗性(CmR)基因和2個(gè)I-SceI位點(diǎn)，通過(guò)PCR-調(diào)節(jié)插入第二個(gè)I-SceI識(shí)別位點(diǎn)到pSG76-C的NotI位點(diǎn)下游來(lái)獲得。2個(gè)I-SceI位點(diǎn)方向相反。
人工或構(gòu)建的DNA序列可提供給細(xì)菌，通過(guò)直接導(dǎo)入線性DNA分子到細(xì)菌，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法如電穿孔。在此情況中，選擇標(biāo)記如抗生素抗性基因改造到人工DNA序列中用于稍后選擇含插入DNA序列的菌落。另外，線性DNA分子能在細(xì)菌中提供，通過(guò)用攜帶人工線性DNA序列的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌并經(jīng)限制性酶切在細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生線性DNA分子。所用限制性酶應(yīng)僅切載體但不切細(xì)菌基因組。在此情況中，人工線性DNA序列不必須攜帶選擇標(biāo)記，因?yàn)檩d體轉(zhuǎn)化效率更高從而插入線性DNA的細(xì)菌可稍后直接通過(guò)PCR篩選。
無(wú)瘢痕缺失方法的第二個(gè)步驟包括通過(guò)插入人工DNA分子來(lái)取代基因組區(qū)域。改造細(xì)菌細(xì)胞以包含增加同源重組頻率的系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的一個(gè)例子是Red重組酶系統(tǒng)。系統(tǒng)能通過(guò)載體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。系統(tǒng)協(xié)助線性DNA分子取代含缺失靶的基因組區(qū)域。如下面例子所述，載體pBADαβγ攜帶可用于大腸桿菌的同源重組系統(tǒng)，描述于Muyrers，J.P.P.等，Nucl.Acids Res.271555-1557(1999)。也可使用另一個(gè)質(zhì)粒pKD46，描述于Datsenko，K.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.976640-6649(2000)。其它可用的質(zhì)粒包括pGPXX和pJGXX。PGPXX獲得自pBADαβγ，通過(guò)用pSC101復(fù)制起點(diǎn)取代pBADαβγ的復(fù)制起點(diǎn)。PJGXX是pSC101質(zhì)粒，在tet啟動(dòng)子控制下從噬菌體933W中編碼Red功能。
無(wú)瘢痕缺失方法的第三個(gè)步驟包括去除插入DNA序列。序列特異性核酸酶如I-SceI的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)菌，I-SceI識(shí)別插入DNA序列上的獨(dú)特識(shí)別位點(diǎn)。隨后表達(dá)序列特異性核酸酶并切割細(xì)菌基因組。切割后，僅發(fā)生同源重組導(dǎo)致插入線性DNA分子缺失的細(xì)胞可存活。因此，獲得細(xì)菌的靶DNA序列從基因組中缺失。能用于大腸桿菌的序列特異性核酸酶表達(dá)載體例子包括pKSUC1、pKSUC5、pSTKST、pSTAST、pKTSHa、pKTSHc、pBADSce1和pBADSce2。這些載體攜帶的序列特異性核酸酶是I-SceI。pKSUC1、pKSUC5、pSTKST和pSTAST描述于下面例子中。
上述方法可在細(xì)菌中反復(fù)使用以產(chǎn)生一系列缺失。當(dāng)用于同源重組系統(tǒng)的表達(dá)載體和用于獨(dú)特序列特異性核酸酶的表達(dá)載體彼此不相容時(shí)，如pBADαβγ和pKSUC1的情況，每個(gè)缺失循環(huán)必須進(jìn)行2個(gè)載體轉(zhuǎn)化。當(dāng)使用2個(gè)相容質(zhì)粒如pBADαβγ和pSTKST或pKD46和pKSUC5時(shí)，在另外缺失循環(huán)中可避免轉(zhuǎn)化2個(gè)載體。使用2個(gè)這些彼此不相容載體的例子描述于下面例子中。
可修改上面無(wú)瘢痕缺失方法以在細(xì)菌基因組上更有效產(chǎn)生一系列缺失(其例子是下面實(shí)施例的過(guò)程4)。修改方法的第一個(gè)步驟包括以平行方式在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生單獨(dú)線性DNA分子插入，優(yōu)選野生型細(xì)菌細(xì)胞，導(dǎo)致各攜帶單個(gè)插入的一組菌株。此步驟能如上所述完成。修改方法的第二個(gè)步驟包括將單個(gè)插入連續(xù)轉(zhuǎn)移到待減少基因組的靶細(xì)胞。P1轉(zhuǎn)導(dǎo)是可用于轉(zhuǎn)移插入的一個(gè)方法例子。修改方法的第三個(gè)步驟包括重組去除插入序列，能如上所述完成。
新的以線性DNA為基礎(chǔ)的無(wú)瘢痕缺失方法II在這個(gè)以線性DNA為基礎(chǔ)的新方法中，2個(gè)DNA序列改造到質(zhì)粒載體中，1個(gè)與待缺失細(xì)菌基因組區(qū)域一個(gè)末端序列相同且另1個(gè)與細(xì)菌基因組區(qū)域另一個(gè)末端序列相同，方向類似。本文的載體定義為靶載體。2個(gè)DNA序列在靶載體上彼此相鄰。至少一個(gè)僅切靶載體而不是細(xì)菌基因組的酶識(shí)別位點(diǎn)也在2個(gè)DNA序列外的位置改造到靶載體。識(shí)別位點(diǎn)可以是序列特異性核酸酶如I-SceI。識(shí)別位點(diǎn)也可用于僅切未甲基化序列的甲基化敏感限制性酶。由于細(xì)菌基因組上的識(shí)別位點(diǎn)(如果有)被甲基化，限制性酶僅能切靶載體。靶載體轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中且線性DNA分子在細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生，通過(guò)在細(xì)菌中表達(dá)識(shí)別和切割靶載體上識(shí)別位點(diǎn)的酶。其次，在細(xì)菌中活化可增加同源重組的系統(tǒng)以誘導(dǎo)線性DNA和待缺失區(qū)域側(cè)翼的細(xì)菌基因組同源序列間的同源重組。由于上面的同源重組可獲得靶基因組區(qū)域缺失的細(xì)菌。
這個(gè)以線性DNA為基礎(chǔ)的新方法也能用于使所需DNA序列取代細(xì)菌基因組區(qū)域。在此情況中，所需DNA序列改造到靶載體中，序列能與細(xì)菌基因組進(jìn)行同源重組以取代基因組區(qū)域。所有其它方面與上述用于缺失細(xì)菌基因組區(qū)域的相同。
無(wú)論方法是用于缺失或取代細(xì)菌基因組的靶區(qū)域，由于高結(jié)合效率不需要標(biāo)記基因，標(biāo)記基因選擇靶載體上攜帶的DNA結(jié)合到細(xì)菌基因組。通過(guò)PCR簡(jiǎn)單篩選30-100個(gè)菌落通?？设b定細(xì)菌基因組中有所需修飾的克隆。
作為特定例子，圖3和4闡明用此方法將琥珀終止密碼子導(dǎo)入基因中部。作為第一個(gè)步驟，產(chǎn)生的DNA片段具有位于基因中部或染色體區(qū)域的所需修飾。序列特異性核酸酶I-SceI識(shí)別位點(diǎn)引入DNA片段一側(cè)。這可通過(guò)包括PCR引物5’末端序列來(lái)簡(jiǎn)單完成，引物用于擴(kuò)增DNA片段。更長(zhǎng)的DNA片段(500-5,000個(gè)核苷酸)一般工作最佳。
DNA片段克隆到多拷貝的靶質(zhì)粒載體如pUC19(GenBank登錄號(hào)M77789)。由于此靶載體與下述突變載體一起使用，靶載體改造成與p15A起點(diǎn)質(zhì)粒(獲得自pACYC184)(GenBank登錄號(hào)X06403)相容且具有除了氯霉素的藥物抗性標(biāo)記。這些限制可容易用另外突變質(zhì)粒來(lái)避免。
如圖4所示，此例子所用突變質(zhì)粒包含序列特異性核酸酶I-SceI和λred基因exo、P-BAD啟動(dòng)子控制下的β和γ。質(zhì)粒也包含p15A ori和氯霉素抗性基因。
靶和突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到recA陽(yáng)性大腸桿菌。根據(jù)氯霉素抗性和靶質(zhì)粒上攜帶的抗性選擇細(xì)菌。隨后挑出單菌落并在1ml豐富的成分明確培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)約7.0小時(shí)(Neidhardt等，J.Bacteriol.119736-47，全部納入本文供參考)，培養(yǎng)基含0.2％阿拉伯糖和氯霉素。隨后連續(xù)稀釋(例如1∶1,000、1∶10,000等)的培養(yǎng)物平板培養(yǎng)于非選擇性培養(yǎng)基如LB。接著，篩選有所需突變的菌落。如果生長(zhǎng)表型已知，篩選可通過(guò)在適當(dāng)培養(yǎng)基上通過(guò)膜片形成來(lái)完成。否則，篩選用菌落PCR進(jìn)行，接著通過(guò)限制性消化和電泳或測(cè)序。
以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法本文所述以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法可用于無(wú)瘢痕基因缺失和基因取代。發(fā)明的基本要素包括名為聯(lián)鎖(Interlock)質(zhì)粒的質(zhì)粒載體，質(zhì)粒含抗生素抗性基因和啟動(dòng)子控制下的復(fù)制起點(diǎn)。聯(lián)鎖質(zhì)粒也包含一個(gè)或多個(gè)可插入DNA插入片段的位置。當(dāng)方法用于無(wú)瘢痕缺失時(shí)，DNA插入片段包括兩個(gè)彼此相鄰的DNA序列，方向類似，一個(gè)與待缺失細(xì)菌基因組區(qū)域一個(gè)末端側(cè)翼序列相同且另一個(gè)與細(xì)菌基因組區(qū)域另一個(gè)末端側(cè)翼序列相同。當(dāng)方法用于基因取代時(shí)，DNA插入片段包括取代細(xì)菌基因組片段的序列。當(dāng)控制復(fù)制起點(diǎn)的啟動(dòng)子被關(guān)閉時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制被關(guān)閉且抗生素壓力能用于選擇在側(cè)翼區(qū)域位置的染色體整合。染色體在側(cè)翼區(qū)域位置整合后，控制質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)的啟動(dòng)子可被打開，能存活的細(xì)菌僅是發(fā)生重組以去除所述復(fù)制起點(diǎn)、其啟動(dòng)子或兩者的細(xì)菌。當(dāng)DNA插入片段用于產(chǎn)生無(wú)瘢痕缺失時(shí)，整合插入和對(duì)應(yīng)基因組區(qū)域間的重組會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌在任何整合前具有所需取代或相同基因組。隨后可進(jìn)行篩選步驟以鑒定基因組中有所需修飾的細(xì)菌。
上面方法的變化包括相同的聯(lián)鎖質(zhì)粒，除了質(zhì)粒也包含細(xì)菌基因組中缺乏的序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。染色體整合后，改造細(xì)菌以表達(dá)序列特異性核酸酶用于切割細(xì)菌基因組和選擇重組，而不是活化復(fù)制起點(diǎn)控制啟動(dòng)子以選擇重組。
以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法也可以與上述線性DNA為基礎(chǔ)的新方法類似方式反復(fù)使用，以在細(xì)菌基因組上產(chǎn)生一系列缺失。
圖6顯示質(zhì)粒實(shí)施方案，能用于以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法。pIL-1是聯(lián)鎖質(zhì)粒且pBAD-Sce-1是表達(dá)序列特異性核酸酶I-SceI的質(zhì)粒。pIL-4是兩者的組合。pIL-1和pIL-4所用tet啟動(dòng)子被緊密調(diào)節(jié)并因此相對(duì)其它控制機(jī)制如溫度敏感元件具有優(yōu)勢(shì)，溫度敏感元件更加滲漏。使用pIL-4以取代基因的例子示于圖5A-C，用于闡明本發(fā)明以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法。圖5A顯示DNA插入片段pIL-4和pIL-4整合到細(xì)菌基因組。有了熱活化氯四環(huán)素(CTC)，tet阻遏物失活，O和P啟動(dòng)子有功能，質(zhì)粒復(fù)制。去除CTC后，tet阻遏物結(jié)合O啟動(dòng)子和P啟動(dòng)子并阻礙復(fù)制。氯霉素抗性可用于選擇整合子。圖5B顯示用異位起點(diǎn)誘導(dǎo)以選擇同源重組和同源重組的2個(gè)可能結(jié)果。圖5C顯示另一種選擇同源重組的方法和同源重組的2個(gè)可能結(jié)果。此另外方法包括誘導(dǎo)I-SceI表達(dá)以產(chǎn)生雙鏈斷裂。
以自殺性質(zhì)粒為基礎(chǔ)的方法的2個(gè)特定實(shí)施方案在下面描述為操作1和操作2。pIL-1和pIL-4能用于操作1，pIL-1結(jié)合pBAD-Sec-1能用于操作2。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可修改操作2，單獨(dú)使用pIL-4。
操作1(用λ起點(diǎn)反選擇)1.生成所需基因組修飾作為線性DNA片段。在產(chǎn)生琥珀突變體的情況中，修飾可用兆引物PCR進(jìn)行。為在基因組中進(jìn)行缺失，應(yīng)使用所需缺失終點(diǎn)的融合。應(yīng)磷酸化DNA片段末端用于克隆。
2.產(chǎn)生鈍克隆位點(diǎn)，通過(guò)用限制性酶Srf1消化pIL4載體(圖5A和6)。載體脫磷酸。
3.鈍端連接所需修飾和pIL4載體。
4.(注意此步驟可能在高通量實(shí)施中不是必要的)。將連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌克隆菌株(如JS5)中。轉(zhuǎn)化在LB+1ug/ml cTc中生長(zhǎng)1小時(shí)(cTc-在LB培養(yǎng)基中新高壓滅菌的氯四環(huán)素。100μg/ml貯存物高壓滅菌20分鐘，隨后在4℃暗處保存。它可使用直至5天。另外，可置換2ng/ml無(wú)水四環(huán)素溶液)。然后平板培養(yǎng)于LB+氯霉素(Cam 25μg/ml)+cTc(1μg/ml)，37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。在相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)菌落并準(zhǔn)備質(zhì)粒小量制備DNA。通過(guò)凝膠電泳分析且選擇有插入的克隆。
5.將確認(rèn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到recA陽(yáng)性大腸桿菌菌株(如MG1655)。在LB+1μg/mlcTc中生長(zhǎng)1小時(shí)。部分生長(zhǎng)物在含Cam和1μg/ml cTc的平板上培養(yǎng)。37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。
6.將菌落挑到1ml LB中，10μl在Cam平板上培養(yǎng)。37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。
7.在Cam平板上劃線菌落以確保每個(gè)存在的細(xì)胞包含整合質(zhì)粒。37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。
8.將菌落挑到1ml LB中，100μl的1∶100稀釋在Cam平板上培養(yǎng)，平板含5μg/ml cTc。37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。
9.(篩選突變)僅部分反選擇菌落包含所需突變，其它的回復(fù)成野生型。突變體與回復(fù)體的比例取決于修飾在克隆片段中的位置。必須進(jìn)行一些種類的篩選以鑒定所需突變。為生成琥珀突變體，所討論基因可通過(guò)PCR擴(kuò)增并用BfaI限制性酶消化(BfaI切前面是’C’的琥珀密碼子)。
操作2(用I.Sce1高通量反選擇)1-4與操作1相同。
5.攜帶插入的聯(lián)鎖質(zhì)粒和pBAD-Sce1共轉(zhuǎn)化到recA陽(yáng)性大腸桿菌菌株(如MG1655)。在LB+1μg/ml cTc中生長(zhǎng)1小時(shí)。(另外，攜帶插入的聯(lián)鎖質(zhì)?？勺陨磙D(zhuǎn)化到已攜帶pBAD-Sce1的感受態(tài)細(xì)胞)。
6.加入氯霉素到25μg/ml且卡那霉素到50μg/ml。37℃振蕩生長(zhǎng)1-2小時(shí)。
7.細(xì)胞在微離心機(jī)中沉淀30秒。去除培養(yǎng)基上清。
8.(整合步驟)細(xì)胞重懸浮于1ml LB+氯霉素(25μg/ml)+卡那霉素(50μg/ml)+葡萄糖(0.2％)，37℃振蕩生長(zhǎng)過(guò)夜。
9.過(guò)夜培養(yǎng)物在相同培養(yǎng)基中1∶10,000稀釋，37℃另外生長(zhǎng)16-24小時(shí)。
10.(反選擇步驟)10μl培養(yǎng)物稀釋到1ml 1×M9最少鹽(以最小化生長(zhǎng)速度)。將它分成2管，0.5ml每管。一管加入阿拉伯糖到0.2％，另一管加入葡萄糖到0.2％(作為負(fù)對(duì)照)。37℃振蕩生長(zhǎng)1-2小時(shí)。
11. 10μl阿拉伯糖管平板培養(yǎng)于LB+卡那霉素(50μg/ml)+阿拉伯糖(0.2％)，10μl葡萄糖管平板培養(yǎng)于LB+氯霉素(25μg/ml)+卡那霉素(50μg/ml)+葡萄糖(0.2％)。37℃生長(zhǎng)過(guò)夜。
12.(篩選突變)進(jìn)行原始操作的步驟9。
實(shí)施例質(zhì)粒用于PCR構(gòu)建人工插入DNA序列的質(zhì)粒命名為pSG76-CS(GenBank登錄號(hào)AF402780)，它通過(guò)插入第二個(gè)I-SceI位點(diǎn)從pSG76-C獲得(Posfai，G.等，J.Bacteriol.1794426-4428(1997))。第二個(gè)I-SceI位點(diǎn)通過(guò)PCR-調(diào)節(jié)插入第二個(gè)I-SceI識(shí)別位點(diǎn)到pSG76-C的NotI位點(diǎn)下游來(lái)獲得。2個(gè)I-SceI位點(diǎn)方向相反。
pBADαβγ質(zhì)粒用于提高線性DNA片段重組到基因組中。此質(zhì)粒描述于Muyrers，J.P.P.等，Nucl.Acids Res.271555-1557(1999)。
用于表達(dá)I-SceI的PKSUC1質(zhì)粒(GenBank登錄號(hào)AF402779)獲得自pSG76-K(Posfai，G.等，J.Bacteriol.1794426-4428(1997))和pUC19RP12(Posfai，G.等，Nucl.Acids.Res.274409-4415(1999))。pSG76-K的XbaI-NotI片段(攜帶Kan基因；NotI末端通過(guò)Klenow聚合酶變成鈍端)連接pUC19RP12的XbaI-DraI片段(攜帶I-SceI基因和pUC ori)。
pKSUC5質(zhì)粒獲得自pFT-K(Posfai，G.等，J.Bacteriol.1794426-4428(1997))和pKSUC1。pKSUC1的大XbaI-NcoI片段連接攜帶tet阻遏物的pFT-K的XbaI-NcoI片段。
PKD46質(zhì)粒用于提高線性DNA片段重組到基因組中，描述于Datsenko，K.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.976640-6649(2000)。
用于四環(huán)素-調(diào)節(jié)表達(dá)I-SceI的質(zhì)粒pSTKST(GenBank登錄號(hào)AF406953)是低拷貝數(shù)KanR質(zhì)粒，獲得自pFT-K(Posfai，G.等，J.Bacteriol.1794426-4428(1997))和pUC19RP12(Posfai，G.等，Nucl.Acids Res.274409-4415(1999))。攜帶I-SceI基因的pUC19RP12的XbaI-PstI片段連接pFT-K的大XbaI-PstI片段。當(dāng)由四環(huán)素誘導(dǎo)時(shí)，此質(zhì)粒表達(dá)I-SceI。質(zhì)粒復(fù)制是溫度-敏感的(Posfai，G.等，J.Bacteriol.1794426-4428(1997))。
質(zhì)粒pSTAST是用于四環(huán)素-調(diào)節(jié)表達(dá)I-SceI的低拷貝數(shù)ApR質(zhì)粒，獲得自pFT-A(Posfai，G.等，J.Bacterriol.1794426-4428(1997))和pUC19RP12(Posfai，G.等，Nucl.Acids Res.274409-4415(1999))。攜帶I-SceI基因的pUC19RP12的XbaI-PstI片段連接pFT-A的大XbaI-PstI片段。當(dāng)由四環(huán)素誘導(dǎo)時(shí)，此質(zhì)粒表達(dá)I-SceI。質(zhì)粒復(fù)制是溫度-敏感的(Posfai，G.等，J.Bacteriol.1794426-4428(1997))。
缺失過(guò)程1所述方法用于反復(fù)在大腸桿菌K-12基因組中產(chǎn)生缺失。此過(guò)程是無(wú)瘢痕的缺失方法。過(guò)程開始是通過(guò)PCR構(gòu)建線性靶片段。這通過(guò)混合20pmol引物A和20pmol引物B，在總共50μl體積中進(jìn)行PCR來(lái)完成。循環(huán)參數(shù)為15×(94℃ 40秒/57℃或更低(取決于A和B的重疊)40秒/72℃ 15秒)。取出μl上面PCR混合物，加入各20pmol的引物A和C，加入50ng pSG76-CS模板，在2×50μl體積中進(jìn)行PCR(用50μl管，組合2管以獲得更多DNA)。所用循環(huán)參數(shù)為28×(94℃ 40秒/57℃ 40秒/72℃80秒)。為從上面步驟中純化PCR混合物，使用Promega WizardPCR purification試劑盒。所得DNA片段懸浮于20μl水。
其次是通過(guò)插入人工DNA片段來(lái)取代基因組區(qū)域。這通過(guò)取攜帶pBADαβγ的靶細(xì)胞和制備所述電感受態(tài)細(xì)胞(Posfai，G.等，Nucl.Acids Res.274409-4415(1999))，除了在收集細(xì)胞前0.25-1小時(shí)加入0.1％阿拉伯糖到培養(yǎng)物。4μl DNA片段(100-200ng)電穿孔到40μl電感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞在Cam平板(25μg/ml)上培養(yǎng)且37℃孵育。通常的結(jié)果是過(guò)夜培養(yǎng)后獲得總共10到幾百個(gè)菌落。用引物D和E通過(guò)PCR檢查在正確位置插入片段的一些菌落。
接著是缺失插入序列。這是通過(guò)CaCl2方法從上面所選菌落制備感受態(tài)細(xì)胞來(lái)完成(Sambrook，J.等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA LaboratoryManual).Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))。質(zhì)粒pKSUC1(～100ng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中(Sambrook，J.等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))。細(xì)胞在Kan平板上培養(yǎng)且37℃孵育(pKSUC1和pBADαβγ不相容，因此在Kan平板上選擇使pBADαβγ從細(xì)胞中去除)。用引物D和E通過(guò)PCR檢查正確缺失的菌落。選擇攜帶正確缺失的菌落。在此點(diǎn)，細(xì)胞攜帶pKSUC1。下一步是缺失此質(zhì)粒。
缺失通過(guò)pBADαβγ取代pKSUC1完成。選擇來(lái)自前一步驟的菌落，在非選擇條件下37℃生長(zhǎng)于LB中，細(xì)胞再接種到新鮮培養(yǎng)基中2-3次。制備感受態(tài)細(xì)胞用于化學(xué)轉(zhuǎn)化或電穿孔。質(zhì)粒pBADαβγ(100-200ng)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，細(xì)胞在Amp平板上培養(yǎng)。用牙簽在Kan和Amp平板上挑出100個(gè)菌落來(lái)選擇Kan敏感/Amp抗性的菌落。
所選菌落可用于下一輪缺失，通過(guò)使用新的靶片段和重復(fù)上面步驟。如果不需要更多缺失，細(xì)胞在非選擇條件下(不加入Amp)生長(zhǎng)導(dǎo)致pBADαβγ從細(xì)胞長(zhǎng)片段中自發(fā)失去。
缺失過(guò)程1此過(guò)程與過(guò)程1類似，但pKSUC1被pSTKST取代。此質(zhì)粒與pBADαβγ相容，有溫度-敏感的復(fù)制子，表達(dá)I-SceI需要氯四環(huán)素(CTC)誘導(dǎo)。從細(xì)胞中去除pSTKST的優(yōu)勢(shì)是容易完成，通過(guò)培養(yǎng)物在42℃生長(zhǎng)。
通過(guò)PCR構(gòu)建線性靶片段和通過(guò)插入片段來(lái)取代基因組區(qū)域如過(guò)程1所述完成。
為缺失插入片段，感受態(tài)細(xì)胞從來(lái)自所選菌落的培養(yǎng)物制備，菌落有正確插入。細(xì)胞用pSTKST轉(zhuǎn)化，在Kan+Cam平板上培養(yǎng)且30℃孵育。來(lái)自此平板的菌落接種到10ml LB+Kan中，其中添加熱處理的誘導(dǎo)物CTC(終濃度25μg/ml)并在30℃生長(zhǎng)24小時(shí)。此步驟用于誘導(dǎo)I-SceI表達(dá)。稀釋培養(yǎng)物隨后在LB+Kan平板上鋪開且30℃過(guò)夜培養(yǎng)。檢查6-12個(gè)菌落，用引物D和E通過(guò)PCR檢查正確缺失。選擇攜帶正確缺失的菌落。
為從細(xì)胞中去除輔助質(zhì)粒，培養(yǎng)物在42℃生長(zhǎng)于LB中(沒有加入抗生素)。
過(guò)程3由于pBADαβγ和pSTKST攜帶相容復(fù)制子，當(dāng)在相同宿主中進(jìn)行連續(xù)缺失時(shí)，不需重復(fù)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。2個(gè)質(zhì)粒通過(guò)抗生素選擇(Kan+Amp)經(jīng)連續(xù)缺失構(gòu)建在宿主細(xì)胞中維持。重組酶和特定核酸酶功能僅當(dāng)需要時(shí)誘導(dǎo)。因?yàn)閜STKST復(fù)制是溫度-敏感的，細(xì)胞必須在30℃生長(zhǎng)。
此過(guò)程與過(guò)程2相同，除了pBADαβγ和pSTKST僅轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中1次，直到需要在細(xì)胞中維持2個(gè)質(zhì)粒，培養(yǎng)物在30℃生長(zhǎng)，Amp+Kan包括在培養(yǎng)基中。注意有時(shí)我們?cè)?(Amp+Kan)或3種(Amp+Kan+Cam)抗生素存在時(shí)30℃生長(zhǎng)細(xì)胞有困難。
過(guò)程4當(dāng)在相同細(xì)胞中進(jìn)行一些連續(xù)缺失時(shí)，這是優(yōu)選過(guò)程。插入(線性片段重組到攜帶pBADαβγ的宿主細(xì)胞基因組中)平行進(jìn)行，產(chǎn)生一系列重組細(xì)胞，各自攜帶單個(gè)插入。隨后這些插入通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)依次轉(zhuǎn)入細(xì)胞，細(xì)胞攜帶pSTKST且有前面全部缺失。通過(guò)誘導(dǎo)pSTKST在此最終宿主中去除所有外源序列。與前面方法相比，主要區(qū)別是插入步驟和去除插入序列在不同細(xì)胞中進(jìn)行。由于插入平行進(jìn)行，構(gòu)建連續(xù)缺失更迅速。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是細(xì)胞僅在第一次缺失構(gòu)建開始時(shí)通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
此過(guò)程在技術(shù)上與過(guò)程2相同，除了單獨(dú)插入通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)入已有pSTKST的缺失菌株。各P1轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟后，誘導(dǎo)I-SceI表達(dá)以去除插入序列。
結(jié)果對(duì)大腸桿菌菌株K-12 MG1655進(jìn)行12個(gè)連續(xù)基因組缺失。選擇12個(gè)缺失區(qū)域用于缺失，部分來(lái)自大腸桿菌菌株O157:H7 EDL933和菌株K-12 MG1655基因組DNA序列的比較結(jié)果。缺失列于下表1。序列編號(hào)方式取自發(fā)表的K-12序列。
第一個(gè)缺失MD1用Posfai，G.等，Nucl.Acids Res.274409-4415(1999)所述方法產(chǎn)生。用此方法產(chǎn)生MD1缺失，在染色體缺失位置留下114-bp pSG76-CS載體序列，包括FRT位點(diǎn)。MD2到MD6缺失用上述過(guò)程1產(chǎn)生。缺失MD7到MD12用過(guò)程4結(jié)合過(guò)程1或2產(chǎn)生。各新缺失的菌株命名和基因組坐標(biāo)是MD1263080-324632；MD2 1398351-1480278；MD3 2556711-2563500；MD4 2754180-278970；MD5 2064327-2078613；MD6 3451565-3467490；MD7 2464565-2474198；MD8 1625542-1650865；MD9 4494243-4547279；MD10 3108697-3134392；MD111196360-1222299；MD12 564278-585331。
在此階段總共去除378，180個(gè)堿基對(duì)，約為天然K-12 MG1655大腸桿菌基因組的8.1％。從基因組中去除這些區(qū)域不影響細(xì)菌存活或細(xì)菌生長(zhǎng)。
下表2列出大腸桿菌基因組的其它片段、基因和區(qū)域，鑒定為進(jìn)一步缺失的候選。片段也成功地從細(xì)菌基因組中去除。再次，產(chǎn)生這些缺失而對(duì)實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)用途細(xì)菌的有效性沒有明顯有害效果。序列命名也取自發(fā)表的K-12序列。2組缺失總計(jì)約為14％的原始細(xì)菌基因組。要指出的是基因本身能和側(cè)翼DNA一起缺失，只要側(cè)翼DNA不破壞宿主生長(zhǎng)和存活必需的基因。
在過(guò)程1中，插入線性片段的效率隨著特定基因座而變化。正確位點(diǎn)插入在1-100％(通常20-100％)菌落中發(fā)生。使用范圍從42到74bp的側(cè)翼同源物。更長(zhǎng)的同源物插入效率更好。重復(fù)序列間的正確位點(diǎn)切除在1-100％(通常10-100％)菌落中發(fā)生且取決于重復(fù)區(qū)域長(zhǎng)度。更長(zhǎng)的重復(fù)一般更有效。重復(fù)序列長(zhǎng)度范圍從42到50bp。表面上同樣重復(fù)的實(shí)驗(yàn)間插入和切除效率有變化且現(xiàn)在還未充分理解。
過(guò)程3通過(guò)再產(chǎn)生缺失MD2來(lái)測(cè)試。正確位點(diǎn)插入線性DNA片段在6.6％菌落中發(fā)生。缺失插入序列很有效。25個(gè)所得菌落影印培養(yǎng)到Cam+Amp+Kan和Amp+Kan平板上，19個(gè)證明是Cam敏感。隨后這些菌落中的5個(gè)通過(guò)PCR測(cè)試，5個(gè)全部顯示失去預(yù)計(jì)的插入片段。
表8和表9更精確描述缺失基因終點(diǎn)，基因從界標(biāo)中刪去或待刪。大腸桿菌菌株MDS12、MDS40和MDS73(表8和表9)是中間菌株的缺失終點(diǎn)，中間菌株用于購(gòu)建標(biāo)志菌株。表9所列基因由數(shù)字“b”標(biāo)識(shí)，以Blattner等，Science，同上和GenBank登錄號(hào)400096所述命名為基礎(chǔ)。表8的編號(hào)方式也以Blattner等同上為基礎(chǔ)。
確定缺失菌株特征轉(zhuǎn)化頻率需要將外源DNA結(jié)合到大腸桿菌缺失菌株基因組中，所用方式使宿主細(xì)菌細(xì)胞在分裂和生長(zhǎng)時(shí)維持整合DNA。將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主基因組的方法稱為轉(zhuǎn)化，有外源DNA的生物體稱為轉(zhuǎn)化生物。本領(lǐng)域需要有高轉(zhuǎn)化頻率的大腸桿菌菌株。
大腸桿菌菌株MDS39通過(guò)在親代大腸桿菌菌株中進(jìn)行39個(gè)缺失(約14.1％基因組)來(lái)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化效率高。此高效轉(zhuǎn)化延伸到吸收大尺寸BAC(細(xì)菌人工染色體)DNA，使菌株MDS39對(duì)廣泛范圍的應(yīng)用有特定價(jià)值。
為測(cè)試大腸桿菌菌株MDS39的轉(zhuǎn)化效率，MDS39有且穩(wěn)定維持外源DNA，三種菌株DH10B、MDS31和MDS39在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)至600nm光密度為0.5。旋轉(zhuǎn)離下細(xì)胞培養(yǎng)物，細(xì)胞沉淀用水洗幾次，最終重懸浮于水(以1/1000的原始培養(yǎng)體積)。25ng pBR322 DNA或甲基化BAC DNA或未甲基化BAC DNA加入100μl細(xì)胞懸浮液并用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔操作進(jìn)行電穿孔，如1.8kV和0.1cm電穿孔杯中的150ohms電阻，使用Invitrogen電穿孔儀IITM裝置。在EcoK位點(diǎn)甲基化的BAC DNA和pBR322 DNA用標(biāo)準(zhǔn)操作在大腸桿菌菌株MG1655中制備。未甲基化BAC DNA在大腸桿菌菌株DH10B中制備。
表3顯示菌株MDS31和MDS39都能被分子量為4,636個(gè)堿基對(duì)的pBR322DNA和分子量為100,000個(gè)堿基對(duì)的甲基化BAC DNA有效轉(zhuǎn)化。甲基化BACDNA對(duì)菌株MDS31和MDS39的轉(zhuǎn)化效率可與對(duì)菌株DH10B的轉(zhuǎn)化效率相比，DH10B是目前認(rèn)為轉(zhuǎn)化效率最佳的菌株之一。
當(dāng)用未甲基化BAC DNA轉(zhuǎn)化時(shí)，菌株MDS39的轉(zhuǎn)化效率高于菌株DH10B的轉(zhuǎn)化效率(表3)，而菌株MDS31的轉(zhuǎn)化效率低于菌株MDS39和DH10B的轉(zhuǎn)化效率。菌株MDS31的轉(zhuǎn)化效率低是由于未甲基化DNA在菌株中受到限制，因?yàn)镸DS31是r+m+菌株，而菌株DH10B和MDS39是r-m-菌株。
最近MDS39的工作顯示可能在序列g(shù)b_ba:ecu 95365中存在剩余插入序列IS5。為確定從MDS39中缺失固有IS序列的效果，本文所述過(guò)程用于缺失此序列。MDS40中缺失的終點(diǎn)是表8和9的菌株。隨后測(cè)試所得菌株MDS40的轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)特征(結(jié)果)，如下所討論。
電穿孔-感受態(tài)細(xì)胞如Invitrogen電穿孔儀II手冊(cè)所述制備。簡(jiǎn)要地，200ml培養(yǎng)物生長(zhǎng)到OD550＝0.5，然后離心收集細(xì)胞，用冰水洗2次和冰的10％甘油洗1次，重復(fù)離心和懸浮。在最后步驟時(shí)，細(xì)胞沉淀懸浮于0.4ml 10％甘油，等分成40μl部分并保存于-80℃。
細(xì)胞通常用10-100ng量的質(zhì)粒DNA以1.8kV和0.1cm電穿孔杯中的150Ω電阻電穿孔，使用電穿孔儀II裝置(Invitrogen)。然后細(xì)胞用1ml LB稀釋，搖床中接種1小時(shí)，在選擇性培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)。
進(jìn)行一些試驗(yàn)，結(jié)果以數(shù)量級(jí)變化。2個(gè)典型、單獨(dú)實(shí)驗(yàn)(各2次平行)的平均值示于表5。
也使用MG1655、MDS40和DH10B的轉(zhuǎn)化效率，它們用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法。感受態(tài)細(xì)胞通過(guò)簡(jiǎn)單方法制備。冷凍50ml培養(yǎng)物并在OD550＝0.4離心收集，隨后用1/20體積的冰CaCl2溶液(10mM Tris pH7.5、15％甘油、60mM CaCl2)洗2次，重復(fù)離心和懸浮。接著細(xì)胞在冰上孵育1小時(shí)，等分成200μl部分并保存于-80℃。
對(duì)于轉(zhuǎn)化，細(xì)胞通?；旌?00ng質(zhì)粒DNA，冰上孵育30分鐘，42℃熱激2分鐘，然后加入0.8ml LB。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)0.5-1小時(shí)，接著稀釋物在選擇性培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)。結(jié)果示于表6。
生長(zhǎng)特征如上所討論，需要通過(guò)本發(fā)明方法制備的缺失菌株有很強(qiáng)能力在特定培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。生長(zhǎng)研究進(jìn)行如下。
比較37℃時(shí)大腸桿菌菌株細(xì)胞的倍增時(shí)間(？)，時(shí)間以分鐘計(jì)，用96孔板讀數(shù)器(SpectraMax plus，Molecular Devices)搖動(dòng)測(cè)量。生長(zhǎng)曲線的線性部分對(duì)數(shù)用于計(jì)算平均倍增時(shí)間和平板上6個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。盡管此裝置提供方便的方法進(jìn)行比較測(cè)量，它不產(chǎn)生很好的細(xì)胞從而生長(zhǎng)速度比搖瓶慢2倍。
證明了缺失菌株在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度與原始MG1655相同，但沒達(dá)到相同的終密度。在豐富的成分明確培養(yǎng)基中缺失生長(zhǎng)較慢，但達(dá)到相同終密度。檢測(cè)這些小差異的原因很有趣，但顯然完成目標(biāo)，即基因組顯著減少同時(shí)保持在基本培養(yǎng)基中強(qiáng)生長(zhǎng)的能力。
表1第一次完整的缺失
表2第二組完整缺失IS186缺失(3)保持dnaJ 14168，15298(+)*缺失GP1 15388，20563 IS186，gef，nhaAR，IS1[IS186 15388，16730][IS1 19797，20563]保持rpsT 20815，21078(-)保持pheP 601182，602558(+)*缺失GP2 602639，608573 ybdG，nfnB，ubdF，ybdJ，ybdK，IS186{IS186 607231，608573]保持entD 608682，609311(-)保持glk 25606481，2507446(-)*缺失GP3 2507650，2515969 b2389，b2390，b2391，b2392，nupC，IS186，yfeA[IS186 2512294，2513636]保持alaX 2516061，2516136(-)IS2缺失(3個(gè)沒有已缺失)保持yaiN 378830，379126(-)*缺失GP4 379293，387870 yaiO，b0359，IS2，b0362，yaiP，yaiS，tauABCD[IS2380484，381814]保持hemB 387977，388984(-)*缺失GP5 389121，399029b0370，yaiT，IS3，yaiU，yaiV，ampH，sbmA，yaiw，yaiY，yaiZ[IS3390933，392190]保持ddlA 399053，400147(-)保持ygeK 2992482，2992928(-)*缺失GP6 2992959，2996892 b2856，b2857，b2858，b2859，IS2，b2862，b2863[IS22994383，2995713]
保持glyU 2997006，2997079(-)保持ribB 3181829，3182482(-)*缺失GP7 3182796，3189712b3042，ygiL，IS2，yqiGHI(菌毛基因座)[IS23184112，3185442]保持glgS 3189755，3189955(-)IS5缺失(6個(gè)沒有已缺失)保持ybeJ 686062，686970(-)*缺失GP8 687074，688268IS5保持lnt 688566，690104(-)保持tpx 1386329，1386835(-)*缺失GP9 1386912，1396646ycjG，ycjI，ycjY，ycgZ，mppA，ynaI，IS5，ynaJydaA[IS51394068，1395262]保持fnr 1396798，1397550(-)保持gnd 2097884，2099290(-)*缺失GP10 2099418，2135739IS5加完整O抗原和莢膜異多糖酸簇[IS52099771，2100965]保持yegH 2135858，2137507(+)保持proL 2284231，2284307(+)*缺失GP11 2284410，2288200yejO和IS5[IS52286939，2288133]保持narP 2288520，2289167(+)保持gltF 3358811，3359575(+)*缺失GP12 3359747，3365277IS5加yhcADEF(K-質(zhì)粒)[IS53363191，3364385]保持yhcG 3365462，3366589(+)
保持arsC 3647867，3648292(+)*缺失GP13 3648921，3651343yhis和IS5(IS5 3640666，3650860]保持slp3651558，3652157(+)鞭毛區(qū)域I保持mviN 1127062，1128597(+)*缺失GP14 1128637，1140209 flgAMN flgBCDEFGHIJKL保持rne1140405，1143590(-)區(qū)域II保持yecT 1959975，1960484(+)*缺失GP15 1960605，1977294 flh，che，mot，tap，tar，IS1保持yecG 1977777，1978205(+)區(qū)域IIIa和IIIb嘗試一次缺失兩個(gè)保持sdiA 1994133，1994855(-)*缺失GP16 1995085，2021700fli，加amyA，yec和yed ORFs保持rcsA 2021990，2022613(+)hsd區(qū)域保持uxuR 4552145，4552918(+)*缺失GP17 4553059，4594581yji ORFS，加mcrBCD，hsdRMS，mrr，tsr保持mdoB 4594719，4596971(-)Rhs元件保持ybbP 519640，522054(+)*缺失GP18 522062，529348RhsD元件&相關(guān)ORFs保持ybbB 529356，530450(-)保持ybfA 728357，728563(+)
*缺失GP19 728616，738185RhsC元件&相關(guān)ORFs保持ybgA 738224，738733(+)保持yncH 1524964，1525176(+)*缺失GP20 1525914，1531648RhsE元件&相關(guān)ORFs保持nhoA 1532048，1532893(+)保持nikR 3616219，361662(+)*缺失GP21 3616623，3623309RhsB元件&相關(guān)ORFs#也許不需要在此留下一些東西以分離集中的ORFs？保持yhhJ 3623310，3624437(-)保持yibF 3758974，3759582(-)*缺失GP22 3759620，3767868RhsA元件&相關(guān)ORFs保持yibH 3767870，3769006(-)剩余IS元件保持appA 1039840，1041138(+)*缺失GP23 1041253，1049768yccZYC(EPS)，ymcDCBA(EPS？)，IS1[IS11049001，1049768]保持cspH 1050186，1050398(-)保持phoH 1084215，1085279(+)*缺失GP24 1085329，1096603ycdSRQPT(hms同源物)，IS3，ymdE，ycdU[IS31093468，1094725]保持serX 1096788，1096875(-)保持baeR 2162298，216302(+)*缺失GP25 2163172，2175230P2剩余，IS3，gat操縱子[IS32168193，2169450]保持fbaB 2175532，2176656(-)
保持yhhX 3577399，3578436(-)*缺失GP26 3578769，3582674 yhhYZ，IS1，yrhAB[IS13581059，3581826]保持ggt 3582712，3584454(-)保持cspA 3717678，3717890(+)*缺失GP27 3718262，3719704IS150[IS150 3718262，3719704]保持glyS 3719957，3722026(-)表3大腸桿菌菌株MDS31、MDS39和DH10B的轉(zhuǎn)化效率
表4缺失的周質(zhì)蛋白基因
表5大腸桿菌菌株MG1655、MDS40和DH10B的轉(zhuǎn)化效率
表6大腸桿菌菌株MG1655、MDS40和DH10B的轉(zhuǎn)化效率
表7培養(yǎng)基 菌株平均倍增時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)偏差最大ODMOPS基本 MG1655 120.41 0.63 0.82MOPS基本 MDS12 123.43 6.91 0.61MOPS基本 MDS39 129.57 2.30 0.62MOPS基本 MDS40 128.26 5.30 0.61MOPS基本 DH10B 無(wú)生長(zhǎng)豐富成分明確 MG1655 38.38 0.25 0.83豐富成分明確 MDS12 49.05 4.05 0.84豐富成分明確 MDS39 54.38 1.05 0.85豐富成分明確 MDS40 51.19 1.77 0.86豐富成分明確 DH10B 45.40 2.30 0.62
表8MSD12MDS40MDS73缺失 開始結(jié)束缺失 缺失 缺失 MD1 263080 324632缺失 缺失 缺失 MD2 13983511480278缺失 缺失 缺失 MD3 25567112563500缺失 缺失 缺失 MD4 27541802789270缺失 缺失 缺失 MD5 20643272078613缺失 缺失 缺失 MD6 34515653467490缺失 缺失 缺失 MD7 24645652474198缺失 缺失 缺失 MD8 16255421650785缺失 缺失 缺失 MD9 44942434547279缺失 缺失 缺失 MD10 31086973134392缺失 缺失 缺失 MD11 11963601222299缺失 缺失 缺失 MD12 564278 585331缺失 缺失 GP1 15388 20562缺失 缺失 GP2 602688 608572缺失 缺失 GP3 25076512515959缺失 缺失 GP4 379334 387870缺失 缺失 GP5 389122 399029缺失 缺失 GP6 29930142996890缺失 缺失 GP7 31827973189712缺失 缺失 GP8 687083 688267缺失 缺失 GP9 13869121396645缺失 缺失 GP10 20994182135738缺失 缺失 GP11 22844212288200缺失 缺失 GP12 33597973365277缺失 缺失 GP13 36489213651342缺失 缺失 GP14 11286201140209缺失 缺失 GP15 19605901977353缺失 缺失 GP16 19951352021700缺失 缺失 GP17 45530594594581缺失 缺失 GP18 522062 529349缺失 缺失 GP19 728588 738185缺失 缺失 GP20 15259161531650缺失 缺失 GP21 36166233623310缺失 缺失 GP22 37596203767869缺失 缺失 GP23 10412541049768缺失 缺失 GP24 10853301096545缺失 缺失 GP25 21631732175230缺失 缺失 GP26 35787693582673缺失 缺失 GP27 37182633719704缺失 缺失 MD40 167484 173447缺失 GP28 331595 376535缺失 GP29 15888781599265缺失 GP30 37945753805725缺失 GP31 38860643904195缺失 GP32 25991822612802缺失 GP33 37387383752058缺失 GP34 40559874073034缺失 GP35 13494311364839缺失 GP36 28765922885242缺失 GP37 149715 156883
表8(續(xù))MSD12 MDS40MDS73缺失 開始 結(jié)束缺失GP38 674793 682616缺失GP39 997082 1003880缺失GP40 23180632334712缺失gp41 35030003510000缺失gp42 43040004311000缺失gp43 557000 563000缺失gp44 764000 770000缺失gp45 15550001561000缺失gp46 23820002388000缺失gp47 24470002453000缺失gp48 45476004553000缺失gp50 747000 752000缺失gp51 17270001732000缺失gp52 28590002864000缺失gp53 44880004493000缺失gp54 25200002524000缺失gp55 40860004090000缺失gp56 12500001253000缺失gp57 16500001653000缺失gp58 21860002189000缺失gp59 24740002477000缺失gp60 33580003360000缺失gp61 38640003866000
表9從各個(gè)缺失菌株刪除的基因(用數(shù)字b標(biāo)識(shí))MD1 b0247，b0248，b0249，b0250，b0251，b0252，b0253，b0254，b0255，b0256，b0257，b0258，b0259，b0260，b0261，b0262，b0263，b0264，b0265，b0266，b0267，b0268，b0269，b0270，b0271，b0272，b0273，b0274，b0275，b0276，b0277，b0278，b0279，b0280，b0281，b0282，b0283，b0284，b0285，b0286，b0287，b0288，b0289，b0290，b0291，b0292，b0293，b0294，b0295，b0296，b0297，b0298，b0299，b0300，b0301，b0302，b0303，b0304，b0305，b0306，b0307，b0308，b0309，b0310MD2 b1337，b1338，b1339，b1340，b1341，b1342，b1343，b1344，b1345，b1346，b1347，b1348，b1349，b1350，b1351，b1352，b1353，b1354，b1355，b1356，b1357，b1358，b1359，b1360，b1361，b1362，b1363，b1364，b1365，b1366，b1367，b1368，b1369，b1370，b1371，b1372，b1373，b1374，b1375，b1376，b1377，b1378，b1379，b1380，b1381，b1382，b1383，b1384，b1385，b1386，b1387，b1388，b1389，b1390，b1391，b1392，b1393，b1394，b1395，b1396，b1397，b1398，b1399，b1400，b1401，b1402，b1403，b1404，b1405，b1406，b1407，b1408，b1409，b1410，b1411MD3 b2442，b2443，b2444，b2445，b2446，b2447，b2448，b2449，b2450MD4 b2622，b2623，b2624，b2625，b2626，b2627，b2628，b2629，b2630，b2631，b2632，b2633，b2634，b2635，b2636，b2637，b2638，b2639，b2640，b2641，b2642，b2643，b2644，b2645，b2646，b2647，b2648，b2649，b2650，b2651，b2652，b2653，b2654，b2655，b2656，b2657，b2658，b2659，b2660MD5 b1994，b1995，b1996，b1997，b1998，b1999，b2000，b2001，b2002，b2003，b2004，b2005，b2006，b2007，b2008MD6 b3323，b3324，b3325，b3326，b3327，b3328，b3329，b3330，b3331，b3332，b3333，b3334，b3335，b3336，b3337，b3338MD7 b2349，b2350，b2351，b2352，b2353，b2354，b2355，b2356，b2357，b2358，b2359，b2360，b2361，b2362，b2363MD8 b1540，b1541，b1542，b1543，b1544，b1545，b1546，b1547，b1548，b1549，b1550，b1551，b1552，b1553，b1554，b1555，b1556，b1557，b1558，b1559，b1560，b1561，b1562，b1563，b1564，b1565，b1566，b1567，b1568，b1569，b1570，b1571，b1572，b1573，b1574，b1575，b1576，b1577，b1578，b1579MD9 b4271，b4272，b4273，b4274，b4275，b4276，b4277，b4278，b4279，b4280，b4281，b4282，b4283，b4284，b4285，b4286，b4287，b4288，b4289，b4290，b4291，b4292，b4293，b4294，b4295，b4296，b4297，b4298，b4299，b4300，b4301，b4302，b4303，b4304，b4305，b4306，b4307，b4308，b4309，b4310，b4311，b4312，b4313，b4314，b4315，b4316，b4317，b4318，b4319，b4320MD10b2969，b2970，b2971，b2972，b2973，b2974，b2975，b2976，b2977，b2978，b2979，b2980，b2981，b2982，b2983，b2984，b2985，b2986，b2987MD11b1138，b1139，b1140，b1141，b1142，b1143，b1144，b1145，b1146，b1147，b1148，b1149，b1150，b1151，b1152，b1153，b1154，b1155，b1156，b1157，b1158，b1159，b1160，b1161，b1162，b1163，b1164，b1165，b1166，b1167，b1168，b1169，b1170，b1171，b1172MD12b0538，b0539，b0540，b0541，b0542，b0543，b0544，b0545，b0546，b0547，b0548，b0549，b0550，b0551，b0552，b0553，b0554，b0555，b0556，b0557，b0558，b0559，b0560，b0561，b0562，b0563，b0564，b0565GP1 b0016，b0017，b0018，b0019，b0020，b0021，b0022GP2 b0577，b0578，b0579，b0580，b0581，b0582GP3 b2389，b2390，b2391，b2392，b2393，b2394，b2395GP4 b0358，b0359，b0360，b0361，b0362，b0363，b0364，b0365，b0366，b0367，b0368GP5 b0370，b0371，b0372，b0373，b0374，b0375，b0376，b0377，b0378，b0379，b0380GP6 b2856，b2857，b2858，b2859，b2860，b2861，b2862，b2863GP7 b3042，b3043，b3044，b3045，b3046，b3047，b3048GP8 b0656GP9 b1325，b1326，b1327，b1328，b1329，b1330，b1331，b1332，b1333GP10b2030，b2031，b2032，b2033，b2034，b2035，b2036，b2037，b2038，b2039，b2040，b2041，b2042，b2043，b2044，b2045，b2046，b2047，b2048，b2049，b2050，b2051，b2052，b2053，b2054，b2055，b2056，b2057，b2058，b2059，b2060，b2061，b2062GP11b2190，b2191，b2192GP12b3215，b3216，b3217，b3218，b3219GP13b3504，b3505GP14b1070，b1071，b1072，b1073，b1074，b1075，b1076，b1077，b1078，b1079，b1080，b1081，b1082，b1083GP15b1878，b1879，b1880，b1881，b1882，b1883，b1884，b1885，b1886，b1887，b1888，b1889，b1890，b1891，b1892，b1893，b1894GP16b1917，b1918，b1919，b1920，b1921，b1922，b1923，b1924，b1925，b1926，b1927，b1928，b1929，b1930，b1931，b1932，b1933，b1934，b1935，b1936，b1937，b1938，
b1939，b1940，b1941，b1942，b1943，b1944，b1945，b1946，b1947，b1948，b1949，b1950GP17b4325，b4326，b4327，b4328，b4329，b4330，b4331，b4332，b4333，b4334，b4335，b4336，b4337，b4338，b4339，b4340，b4341，b4342，b4343，b4344，b4345，b4346，b4347，b4348，b4349，b4350，b4351，b4352，b4353，b4354，b4355，b4356，b4357，b4358GP18b0497，b0498，b0499，b0500，b0501，b0502GP19b0700，b0701，b0702，b0703，b0704，b0705，b0706GP20b1456，b1457，b1458，b1459，b1460，b1461，b1462GP21b3482，b3483，b3484GP22b3593，b3594，b3595，b3596GP23b0981，b0982，b0983，b0984，b0985，b0986，b0987，b0988GP24b1021，b1022，b1023，b1024，b1025，b1026，b1027，b1028，b1029，b1030，b1031GP25b2080，b2081，b2082，b2083，b2084，b2085，b2086，b2087，b2088，b2089，b2090，b2091，b2092，b2093，b2094，b2095，b2096GP26b3441，b3442，b3443，b3444，b3445，b3446GP27b3557，b3558MD40b0150，b0151，b0152，b0153GP28b0315，b0316，b0317，b0318，b0319，b0320，b0321，b0322，b0323，b0324，b0325，b0326，b0327，b0328，b0329，b0330，b0331，b0333，b0334，b0335，b0336，b0337，b0338，b0339，b0340，b0341，b0342，b0343，b0344，b0345，b0346，b0347，b0348，b0349，b0350，b0351，b0352，b0353，b0354GP29b1507，b1508，b1509，b1510，b1511，b1512GP30b3622，b3623，b3624，b3625，b3626，b3627，b3628，b3629，b3630，b3631，b3632GP31b3707，b3708，b3709，b3710，b3711，b3712，b3713，b3714，b3715，b3716，b3717，b3718，b3719，b3720，b3721，b3722，b3723GP32b2481，b2482，b2483，b2484，b2485，b2486，b2487，b2488，b2489，b2490，b2491，b2492GP33b3573，b3574，b3575，b3576，b3577，b3578，b3579，b3580，b3581，b3582，b3583，b3584，b3585，b3586，b3587GP34b3871，b3872，b3873，b3874，b3875，b3876，b3877，b3878，b3879，b3880，b3881，b3882，b3883，b3884GP35b1289，b1290，b1291，b1292，b1293，b1294，b1295，b1296，b1297，b1298，b1299，b1300，b1301，b1302GP36b2754，b2755，b2756，b2757，b2758，b2759，b2760，b2761GP37b0135，b0136，b0137，b0138，b0139，b0140，b0141GP38b0644，b0645，b0646，b0647，b0648，b0649，b0650GP39b0938，，b0939，b0940，b0941，b0942，b0943，b0944，b0945GP40b2219，b2220，b2221，b2222，b2223，b2224，b2225，b2226，b2227，b2228，b2229，b2230gp41b3376，b3377，b3378，b3379，b3380，b3381，b3382，b3383gp42b4084，b4085，b4086，b4087，b4088，b4089，b4090gp43b0530，b0531，b0532，b0533，b0534，b0535gp44b0730，b0731，b0732gp45b1483，b1484，b1485，b1486，b1487gp46b2270，b2271，b2272，b2273，b2274，b2275gp47b2332，b2333，b2334，b2335，b2336，b2337，b2338gp48b4321，b4322，b4323，b4324gp50b0716，b0717，b0718，b0719gp51b1653，b1654，b1655gp52b2735，b2736，b2737，b2738，b2739，b2740gp53b4265，b4266，b4267，b4268，b4269gp54b2405，b2406，b2407，b2408，b2409gp55b3897，b3898，b3899，b3900，b3901gp56b1201gp57b1580，b1581gp58b2108，b2109，b2110，b2111，b2112gp59b2364，b2365gp60b3213，b3214gp61b3686，b3687，b3688，b3689，b3690
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)菌的基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小至少5％。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其特征在于，其基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小至少8％，其中缺失不導(dǎo)致基因組有瘢痕。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其特征在于，其基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小至少14％。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其特征在于，其天然親代菌株是大腸桿菌菌株。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其特征在于，細(xì)菌基因組被遺傳改造以從細(xì)菌基因組中缺失一個(gè)或多個(gè)DNA，該DNA選自天然親代菌株基因組中的鞭毛基因、限制性修飾系統(tǒng)基因、脂多糖表面基因、插入序列、rhs元件、毒素基因、致病基因、菌毛基因、侵襲素基因、周質(zhì)蛋白基因、膜蛋白基因、原噬菌體、假基因、K島、噬菌體受體、非轉(zhuǎn)錄區(qū)以及不在天然親代菌株相同或相關(guān)屬的任意兩個(gè)細(xì)菌菌株中都存在的基因或其它DNA序列。
6.一種大腸桿菌，其特征在于，其基因組被遺傳改造成小于4.27Mb。
7.一種大腸桿菌菌株，其特征在于，其基因組被遺傳改造成小于4.00Mb。
8.一種在細(xì)菌基因組中已知序列的所選基因組區(qū)域產(chǎn)生缺失而不引入瘢痕的方法，其特征在于，所述方法包括步驟產(chǎn)生人工DNA序列，所述人工DNA序列包括一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域左側(cè)翼基因組序列相同的1號(hào)序列，接著是與待缺失基因組區(qū)域右側(cè)翼基因組序列相同的2號(hào)序列；另一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域中基因組序列相同的3號(hào)序列；以及線性DNA分子一個(gè)末端的1和2號(hào)序列與線性DNA分子另一個(gè)末端的3號(hào)序列之間的序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，所述識(shí)別位點(diǎn)不存在于細(xì)菌基因組中；在有利于第一和第三序列與細(xì)菌基因組中序列同源重組的條件下將人工DNA序列導(dǎo)入細(xì)菌；將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)菌，細(xì)菌基因組包含正確位置插入的線性DNA分子，表達(dá)載體用于識(shí)別識(shí)別位點(diǎn)的序列特異性核酸酶；在細(xì)菌中表達(dá)序列特異性核酸酶；以及收集細(xì)菌，細(xì)菌在序列特異性核酸酶表達(dá)時(shí)存活且包含正確缺失。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，人工DNA序列通過(guò)攜帶人工DNA序列的載體導(dǎo)入細(xì)菌。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述人工DNA序列直接導(dǎo)入細(xì)菌。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述人工DNA序列進(jìn)一步包括在人工DNA序列一個(gè)末端的1和2號(hào)序列與人工DNA序列另一個(gè)末端的3號(hào)序列間可選擇標(biāo)記。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述序列特異性核酸酶是I-SceI。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括一個(gè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能增加線性DNA分子和細(xì)菌基因組間同源重組的頻率，所述系統(tǒng)是噬菌體Red重組酶系統(tǒng)。
14.一種從細(xì)菌基因組中缺失已知序列的DNA而不引入瘢痕的方法，其特征在于，所述方法包括步驟提供細(xì)菌，所述細(xì)菌包含用于系統(tǒng)的表達(dá)載體和用于序列特異性核酸酶的表達(dá)載體，所述系統(tǒng)能增加同源重組頻率，所述序列特異性核酸酶識(shí)別細(xì)菌基因組中不存在的識(shí)別位點(diǎn)，序列特異性核酸酶的表達(dá)在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下且兩個(gè)表達(dá)載體相容；將人工DNA序列導(dǎo)入細(xì)菌，人工DNA序列包括一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域左側(cè)翼基因組序列相同的1號(hào)序列，接著是與待缺失基因組區(qū)域右側(cè)翼基因組序列相同的2號(hào)序列；另一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域中基因組序列相同的3號(hào)序列；以及線性DNA分子一個(gè)末端的1和2號(hào)序列與線性DNA分子另一個(gè)末端的3號(hào)序列間的識(shí)別位點(diǎn)，識(shí)別位點(diǎn)不存在于細(xì)菌天然基因組中；表達(dá)序列特異性核酸酶；和收集含正確缺失的細(xì)菌。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述線性DNA分子進(jìn)一步包括在人工DNA一個(gè)末端的1和2號(hào)序列與人工DNA另一個(gè)末端的3號(hào)序列間的可選擇標(biāo)記。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，能增加同源重組頻率的系統(tǒng)是噬菌體λRed重組酶系統(tǒng)。
17.一種在細(xì)菌基因組中已知序列的所選基因組區(qū)域產(chǎn)生缺失而不引入瘢痕的方法，其特征在于，所述方法包括步驟提供載體，所述載體包括四環(huán)素啟動(dòng)子、四環(huán)素啟動(dòng)子控制的λ復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因；將DNA插入片段插入載體，所述DNA插入片段包括兩個(gè)彼此相鄰的DNA序列，其中一個(gè)DNA序列與待缺失細(xì)菌基因組一側(cè)側(cè)翼序列相同，另一個(gè)DNA序列與待缺失細(xì)菌基因組另一側(cè)側(cè)翼序列相同；用含DNA插入片段的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌；使四環(huán)素啟動(dòng)子失活并使細(xì)菌暴露于抗生素以選擇載體整合到細(xì)菌基因組的細(xì)菌；在載體整合到基因組的細(xì)菌中活化四環(huán)素啟動(dòng)子；和鑒定待缺失基因組區(qū)域被缺失的細(xì)菌。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，活化和失活四環(huán)素啟動(dòng)子通過(guò)加入和去除四環(huán)素誘導(dǎo)物來(lái)完成。
19.一種在細(xì)菌基因組中已知序列的所選基因組區(qū)域產(chǎn)生缺失而不引入瘢痕的方法，其特征在于，所述方法包括步驟提供載體，所述載體包括四環(huán)素啟動(dòng)子、四環(huán)素啟動(dòng)子控制的λ復(fù)制起點(diǎn)、抗生素抗性基因和序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)；將DNA插入片段插入載體，所述DNA插入片段包括兩個(gè)彼此相鄰的DNA序列，其中一個(gè)DNA序列與待缺失細(xì)菌基因組一側(cè)側(cè)翼序列相同，另一個(gè)DNA序列與待缺失細(xì)菌基因組另一側(cè)側(cè)翼序列相同；用含DNA插入片段的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌；使四環(huán)素啟動(dòng)子失活并使細(xì)菌暴露于抗生素以選擇載體整合到細(xì)菌基因組的細(xì)菌；將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)菌，其中所述載體整合到細(xì)菌基因組，表達(dá)載體用于識(shí)別位點(diǎn)的序列特異性核酸酶；在細(xì)菌中表達(dá)序列特異性核酸酶；以及鑒定待缺失基因組區(qū)域被缺失的細(xì)菌。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述序列特異性核酸酶是I-SceI。
21.一種用DNA序列取代細(xì)菌基因組選擇區(qū)域的方法，其特征在于，所述DNA序列和選擇區(qū)域可進(jìn)行同源重組，所述方法包括步驟提供載體，所述載體包括四環(huán)素啟動(dòng)子、四環(huán)素啟動(dòng)子控制的λ復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因；將DNA插入片段插入載體，DNA插入片段包括用于取代細(xì)菌基因組選擇區(qū)域的DNA序列；用含DNA插入片段的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌；使四環(huán)素啟動(dòng)子失活并使細(xì)菌暴露于抗生素以選擇載體整合到細(xì)菌基因組的細(xì)菌；在載體整合到基因組的細(xì)菌中活化四環(huán)素啟動(dòng)子；以及鑒定所選基因組區(qū)域被DNA序列取代的細(xì)菌。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，活化和失活四環(huán)素啟動(dòng)子通過(guò)加入和去除四環(huán)素誘導(dǎo)物來(lái)完成。
23.一種用DNA序列取代細(xì)菌基因組選擇區(qū)域的方法，其特征在于，所述DNA序列和選擇區(qū)域可進(jìn)行同源重組，所述方法包括步驟提供載體，載體包括四環(huán)素啟動(dòng)子、四環(huán)素啟動(dòng)子控制的λ復(fù)制起點(diǎn)、抗生素抗性基因和序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)；將DNA插入片段插入載體，DNA插入片段包括用于取代細(xì)菌基因組選擇區(qū)域的DNA序列；用含DNA插入片段的載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌；使四環(huán)素啟動(dòng)子失活并使細(xì)菌暴露于抗生素以選擇載體整合到細(xì)菌基因組的細(xì)菌；將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)菌，其中載體整合到細(xì)菌基因組，表達(dá)載體用于識(shí)別位點(diǎn)的序列特異性核酸酶；在細(xì)菌中表達(dá)序列特異性核酸酶；以及鑒定所選基因組區(qū)域被DNA序列取代的細(xì)菌。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述序列特異性核酸酶是I-SceI。
25.一種在細(xì)菌基因組中已知序列的所選基因組區(qū)域產(chǎn)生缺失的方法，其特征在于，所述方法包括步驟提供載體，載體包括序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)和兩個(gè)DNA序列，一個(gè)與待缺失細(xì)菌基因組一側(cè)側(cè)翼序列相同且另一個(gè)與細(xì)菌基因組另一側(cè)側(cè)翼序列相同，其中兩個(gè)DNA序列在載體上彼此相鄰，其中序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)在載體上位于兩個(gè)DNA序列外；將載體導(dǎo)入細(xì)菌；將表達(dá)載體導(dǎo)入相同細(xì)菌，表達(dá)載體用于識(shí)別位點(diǎn)的序列特異性核酸酶；將能增加同源重組頻率的系統(tǒng)導(dǎo)入相同細(xì)菌并在細(xì)菌中同時(shí)表達(dá)序列特異性核酸酶；以及鑒定待缺失基因組區(qū)域被缺失的細(xì)菌。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述序列特異性核酸酶是I-SceI。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述能增加同源重組頻率的系統(tǒng)是噬菌體λRed重組酶系統(tǒng)。
28.一種用DNA序列取代細(xì)菌基因組選擇區(qū)域的方法，其特征在于，DNA序列和選擇區(qū)域可進(jìn)行同源重組，所述方法包括步驟提供載體，載體包括序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)和用于取代細(xì)菌基因組選擇區(qū)域的DNA序列，其中序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)在載體上位于DNA序列外；將載體導(dǎo)入細(xì)菌；將能增加同源重組頻率的系統(tǒng)導(dǎo)入相同細(xì)菌；將表達(dá)載體導(dǎo)入相同細(xì)菌，表達(dá)載體用于識(shí)別位點(diǎn)的序列特異性核酸酶；在細(xì)菌中表達(dá)序列特異性核酸酶；以及鑒定待取代基因組區(qū)域被取代的細(xì)菌。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述序列特異性核酸酶是I-SceI。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述能增加同源重組頻率的系統(tǒng)是噬菌體λRed重組酶系統(tǒng)。
31.一種細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)菌用權(quán)利要求14、17、19、21、23、25或28所述的方法制造。
32.如權(quán)利要求31所述的細(xì)菌，其特征在于，其基因組比其天然親代菌株基因組小至少5％。
33.如權(quán)利要求31所述的細(xì)菌，其特征在于，其基因組比其天然親代菌株基因組小至少7％。
34.如權(quán)利要求31所述的細(xì)菌，其特征在于，其基因組比其天然親代菌株基因組小至少8％。
35.如權(quán)利要求31所述的細(xì)菌，其特征在于，其基因組比其天然親代菌株基因組小至少14％。
36.如權(quán)利要求31所述的細(xì)菌，其特征在于，其基因組比其天然親代菌株基因組小至少20％。
37.一種細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)菌基因組中一個(gè)或多個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因被缺失，所述蛋白分泌到其周質(zhì)或在周質(zhì)中加工。
38.如權(quán)利要求37所述的細(xì)菌，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)基因選自fliY、yedO、nfnB、tauA、mppA、tynA、chiA、fimC、fecB、ygiH、yagP和yhcA。
39.一種在細(xì)菌中表達(dá)重組蛋白的改進(jìn)方法，其特征在于，所述方法包括將載體導(dǎo)入權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36或37所述的細(xì)菌，所述載體包括編碼蛋白質(zhì)的DNA，具有與表達(dá)控制序列操作相連的信號(hào)序列；使細(xì)菌在適于表達(dá)蛋白編碼DNA的營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。
40.一種在細(xì)菌中表達(dá)重組蛋白的改進(jìn)方法，其特征在于，所述方法包括將載體導(dǎo)入權(quán)利要求31所述的細(xì)菌，載體包括編碼蛋白質(zhì)的DNA，具有與表達(dá)控制序列操作相連的信號(hào)序列，使細(xì)菌在適于表達(dá)蛋白編碼DNA的營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)控制序列組成型表達(dá)。
42.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)控制序列組成型表達(dá)。
43.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)控制序列是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
44.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)控制序列是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
45.一種用DNA序列取代細(xì)菌基因組選擇區(qū)域的方法，其特征在于，所述DNA序列和選擇區(qū)域可進(jìn)行同源重組，所述方法包括步驟提供載體，載體包括序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)和用于取代細(xì)菌基因組選擇區(qū)域的DNA序列，其中序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)在載體上位于DNA序列外；將載體導(dǎo)入細(xì)菌；將能增加同源重組頻率的系統(tǒng)導(dǎo)入相同細(xì)菌；將表達(dá)載體導(dǎo)入相同細(xì)菌，表達(dá)載體用于識(shí)別位點(diǎn)的序列特異性核酸酶；在細(xì)菌中表達(dá)序列特異性核酸酶；以及鑒定待取代基因組區(qū)域被取代的細(xì)菌。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述序列特異性核酸酶是I-SceI。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述能增加同源重組頻率的系統(tǒng)是噬菌體λRed重組酶系統(tǒng)。
48.一種線性DNA序列，其特征在于，所述序列包括一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域左側(cè)翼基因組序列相同的1號(hào)序列，相鄰的是與待缺失基因組區(qū)域右側(cè)翼基因組序列相同的2號(hào)序列；另一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域中基因組序列相同的3號(hào)序列；線性DNA分子一個(gè)末端的1和2號(hào)序列與線性DNA分子另一個(gè)末端的3號(hào)序列間的序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，其中序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)不存在于細(xì)菌基因組中。
49.如權(quán)利要求45所述的線性DNA，進(jìn)一步包括位于線性DNA一個(gè)末端的1和2號(hào)序列和線性DNA另一個(gè)末端的3號(hào)序列之間的可選擇標(biāo)記。
50.如權(quán)利要求45所述的線性DNA，其特征在于，所述序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)是I-SceI識(shí)別位點(diǎn)。
51.如權(quán)利要求45所述的線性DNA，其特征在于，所述可選擇標(biāo)記是抗生素抗性基因。
52.如權(quán)利要求51所述的線性DNA，其特征在于，所述抗生素抗性基因賦予氯霉素抗性。
53.一種細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)菌包括用于系統(tǒng)的表達(dá)載體和用于序列特異性核酸酶的表達(dá)載體，所述系統(tǒng)能增加同源重組頻率，所述序列特異性核酸酶識(shí)別細(xì)菌基因組中不存在的識(shí)別位點(diǎn)，序列特異性核酸酶的表達(dá)在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下，其中兩個(gè)表達(dá)載體相容，并進(jìn)一步包括線性DNA序列，所述線性DNA序列包括一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域左側(cè)翼基因組序列相同的1號(hào)序列，接著是與待缺失基因組區(qū)域右側(cè)翼基因組序列相同的2號(hào)序列；另一個(gè)末端是與待缺失基因組區(qū)域中基因組序列相同的3號(hào)序列；線性DNA分子一個(gè)末端的1和2號(hào)序列與線性DNA分子另一個(gè)末端的3號(hào)序列間的序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，識(shí)別位點(diǎn)不存在于細(xì)菌天然基因組中。
54.如權(quán)利要求52所述的細(xì)菌，其特征在于，所述線性DNA分子進(jìn)一步包括在人工DNA一個(gè)末端的1和2號(hào)序列與人工DNA另一個(gè)末端的3號(hào)序列之間的可選擇標(biāo)記。
55.如權(quán)利要求52所述的細(xì)菌，其特征在于，所述能增加同源重組頻率的系統(tǒng)是噬菌體λRed重組酶系統(tǒng)。
56.如權(quán)利要求53所述的細(xì)菌，其特征在于，所述可選擇標(biāo)記是抗生素抗性基因。
57.如權(quán)利要求56所述的細(xì)菌，其特征在于，所述抗生素抗性基因賦予氯霉素抗性。
58.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述序列特異性核酸酶是I-SceI。
59.一種載體，其特征在于，所述載體包括可選擇標(biāo)記基因、啟動(dòng)子控制下的復(fù)制起點(diǎn)、插入DNA，所述插入DNA包含第一個(gè)DNA，與第二個(gè)DNA相鄰且方向相同，一個(gè)與待缺失細(xì)菌基因組一個(gè)末端側(cè)翼序列相同且另一個(gè)與待缺失細(xì)菌基因組另一個(gè)末端側(cè)翼序列相同。
60.如權(quán)利要求59所述的載體，其特征在于，所述載體進(jìn)一步包括位于所述第一和第二個(gè)DNA序列間的第三個(gè)DNA序列。
61.如權(quán)利要求59所述的載體，其特征在于，所述可選擇標(biāo)記是抗生素抗性基因。
62.如權(quán)利要求61所述的載體，其特征在于，所述可選擇標(biāo)記賦予氯霉素抗性。
63.如權(quán)利要求59所述的載體，其特征在于，所述載體進(jìn)一步包括序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。
64.如權(quán)利要求59所述的載體，其特征在于，所述序列特異性核酸酶識(shí)別位點(diǎn)是I-SceI。
65.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)小瓶，所述小瓶含一個(gè)或多個(gè)選自權(quán)利要求48、49、51、52和53所述的DNA，以及任選的緩沖液、核苷酸、限制性內(nèi)切酶和聚合酶。
66.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)小瓶，所述小瓶含選自權(quán)利要求59、60、61、62、63和64所述的載體以及任選的緩沖液、核苷酸、限制性內(nèi)切酶和聚合酶。
67.一種大腸桿菌，其特征在于，當(dāng)與其天然親代相比時(shí)，缺乏9％的蛋白質(zhì)編碼基因。
68.一種大腸桿菌，其特征在于，當(dāng)與其天然親代相比時(shí)，具有約15.6％的蛋白質(zhì)編碼基因。
69.一種大腸桿菌，其特征在于，當(dāng)與其天然親代相比時(shí)，具有約21.5％的蛋白質(zhì)編碼基因。
70.一種細(xì)菌，其特征在于，所述細(xì)菌缺乏一個(gè)或多個(gè)DNA，所述DNA選自天然親代菌株基因組中的鞭毛基因、限制性修飾系統(tǒng)基因、脂多糖表面基因、插入序列、rhs元件、毒素基因、致病基因、菌毛基因、侵襲素基因、周質(zhì)蛋白基因、膜蛋白基因、原噬菌體、假基因、K島、噬菌體受體、非轉(zhuǎn)錄區(qū)以及不在天然親代菌株相同或相關(guān)屬的任意兩個(gè)細(xì)菌菌株中都存在的基因或其它DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種細(xì)菌，所具有的基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小至少2到約20％。具較小基因組的細(xì)菌可更有效生成商業(yè)產(chǎn)品。本發(fā)明也提供從細(xì)菌基因組缺失基因和其它DNA序列的方法。此方法提供精確的缺失且很少引入突變到缺失位置周圍的基因組DNA序列。因此，該方法可用于產(chǎn)生一系列細(xì)菌中的突變而不增加基因組內(nèi)不需要的同源重組的可能性。此外，本發(fā)明提供的一些方法也能用于使所需DNA序列取代細(xì)菌基因組區(qū)域。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1620497SQ03802545
公開日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月23日
發(fā)明者F·R·布拉特納, G·波斯發(fā), C·D·赫林, G·普倫基特, J·D·格蘭斯納, T·M·托斯 申請(qǐng)人:威斯康星校友研究基金會(huì)