專(zhuān)利名稱(chēng)：：涉及編碼核苷二磷酸激酶(ndk)多肽及其同源物的基因的用于修改植物根構(gòu)造的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明領(lǐng)域涉及植物育種和遺傳學(xué)以及具體地講涉及用于改變植物根構(gòu)造的重組DNA構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
：在所有(除了非常少的幾個(gè)之外)自然生態(tài)系統(tǒng)中，水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可用性限制了植物生長(zhǎng)。它們?cè)诖蠖鄶?shù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中限制產(chǎn)量。植物根部起到重要作用，如水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取、在土壤中固定植物以及在根圍建立生物相互作用。因此闡明植物根發(fā)育和功能的基因調(diào)控是農(nóng)學(xué)和生態(tài)學(xué)中相當(dāng)受關(guān)注的課題。根系發(fā)源于在胚胎形成期間發(fā)育的初生根。初生根產(chǎn)生次生根，次生根繼而產(chǎn)生三生根。所有次生、三生、四生以及更進(jìn)一步分生的根均被稱(chēng)為側(cè)根。包括玉米在內(nèi)的許多植物也能從連續(xù)的地下節(jié)位(冠根)或地上節(jié)位(支柱根)處產(chǎn)生不定根。有三個(gè)主要過(guò)程影響根系的總體構(gòu)造。第一個(gè)是在初生根分裂組織中的細(xì)胞分裂過(guò)程，該過(guò)程通過(guò)加入新生細(xì)胞到根中使得根不定生長(zhǎng)。第二個(gè)是側(cè)根形成過(guò)程，該過(guò)程增加根系的探索能力。第三個(gè)是根毛形成過(guò)程，該過(guò)程增加初生根和側(cè)根的總表面(Lopez-Bucio等人，CurrentOpinioninPlantBiology(2003)6:280_287)。在已經(jīng)分離出的玉米突變體中僅僅缺少根型的一個(gè)亞型。已經(jīng)鑒定了擬南芥的根形態(tài)基因突變體如SH0RTR00T和SCARECROW，它顯示初生根和側(cè)根的發(fā)育缺陷(J.E.Malamy，Plant，CellandEnvironment(2005)28:67_77)。已經(jīng)鑒定了許多特異性影響根發(fā)育的玉米突變體(Hochholdinger等人，2004，AnnalsofBotany93:359-368)。隱性突變體rtcs和rtl不形成或形成較少的冠根和支柱根，然而初生根和側(cè)根不受影響。在隱性突變體des21中，缺失側(cè)生種子根和根毛。隱性突變體rthl-3缺失根毛。突變體Irtl和ruml在側(cè)根開(kāi)始產(chǎn)生之前受影響，而突變體slrl和slr2的側(cè)根伸長(zhǎng)能力受到削弱。決定根系構(gòu)造的內(nèi)源響應(yīng)途徑包括激素、細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)子和調(diào)節(jié)基因。水分脅迫和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可用性屬于決定根系構(gòu)造的環(huán)境響應(yīng)途徑。提交于2005年2月14日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2005-57473(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)公布2005/223429A1，公布于2005年10月6日)涉及使用擬南芥細(xì)胞分裂素氧化酶基因改變植物中的細(xì)胞分裂素含量并刺激根生長(zhǎng)。美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)6，344，601(公布于2002年2月5日)涉及在植物細(xì)胞中低表達(dá)或超表達(dá)肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(profilin)以改變植物生長(zhǎng)習(xí)性例如減少根系或根毛系統(tǒng)會(huì)使花期推遲。W02004/US16432(提交于2004年5月21日(W02004/106531，公布于2004年12月9日)涉及使用超表達(dá)順式異戊烯轉(zhuǎn)移酶的方法操縱生長(zhǎng)速率和/或產(chǎn)量和/或構(gòu)造。提交于2004年9月30日的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2004/489500(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)公布2005/059154A1，公布于2005年3月13日)涉及使用在植物中超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子E2F的方法改變細(xì)胞數(shù)量、構(gòu)造和產(chǎn)量?？衫眉せ顦?biāo)記來(lái)鑒定能影響性狀的基因。已經(jīng)在模型植物擬南芥中使用該方法(Weigel等人，2000，PlantPhysiol.122:1003_1013)。插入轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件能夠顯著激活和/或提高附近內(nèi)源基因的表達(dá)。發(fā)明概述本發(fā)明包括在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼NDK或NDK樣多肽的核酸序列或所述核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO25比較時(shí)具有至少80%的序列同一性或在與SEQIDNO23比較時(shí)具有至少85%的序列同一性，或在與SEQIDN0:21比較時(shí)具有至少90%的序列同一性，或在與SEQIDNO33比較時(shí)具有至少95%的序列同一性。在第二實(shí)施方案中，分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼NDK或NDK樣多肽的核酸序列或所述核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO25比較時(shí)具有至少85%的序列同一性，或在與SEQIDNO23比較時(shí)具有至少90%的序列同一性，或在與SEQIDN0:21比較時(shí)具有至少95%的序列同一性。在第三實(shí)施方案中，分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼NDK或NDK樣多肽的核酸序列或所述核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO25比較時(shí)具有至少90%的序列同一性，或在與SEQIDNO23比較時(shí)具有至少95%的序列同一性。在第四實(shí)施方案中，分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼NDK或NDK樣多肽的核酸序列或所述核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO25比較時(shí)具有至少95%的序列同一性。在第五實(shí)施方案中，分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼NDK或NDK樣多肽的核酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQIDN0:21、23、25或33。在第六實(shí)施方案中，分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含編碼NDK或NDK樣多肽的核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQIDNO:20、22、24或32。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含任一前述多核苷酸的載體和重組構(gòu)建體，以及包含所述重組構(gòu)建體的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用任一前述多核苷酸來(lái)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，以及用于生產(chǎn)和再生包含任一前述多核苷酸的轉(zhuǎn)化植物的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，該重組DNA構(gòu)建體包含(a)可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(b)抑制DNA構(gòu)建體，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或⑶所述(b)⑴㈧的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽，并且其中在與未包含所述重組構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改變植物根構(gòu)造的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；以及(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體并且在與未包含該DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造；并且任選地，(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體并且在與未包含該DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。在另一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)該轉(zhuǎn)基因植物的根構(gòu)造；以及任選地，(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及任選地，(e)評(píng)價(jià)與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)該子代植物的根構(gòu)造。在另一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)該子代植物的根構(gòu)造。在另一個(gè)實(shí)施方案中，確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(c)確定該轉(zhuǎn)基因植物在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變；以及任選地，(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及任選地，(e)確定該子代植物在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，確定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；并且(d)確定該子代植物在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，確定植物農(nóng)學(xué)特征改變的方法，該方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)確定該轉(zhuǎn)基因植物在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變；以及(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及任選地，(e)確定該子代植物在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，確定植物農(nóng)學(xué)特征改變的方法，該方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體，并且當(dāng)與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)測(cè)定所述子代植物在與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改變植物根構(gòu)造的方法，該方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；或⑶所述(b)⑴㈧的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；以及(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體并且在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造；以及任選地，(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體并且其中該子代植物在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的農(nóng)學(xué)特性；在另一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造的方法，該方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)該轉(zhuǎn)基因植物的根構(gòu)造；以及(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及任選地，(e)評(píng)價(jià)與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)該子代植物的根構(gòu)造。在另一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造的方法，該方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)當(dāng)與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)所述子代植物的根構(gòu)造。本發(fā)明中還包括上述植物的任何子代、上述植物的任何種子以及來(lái)自任一上述植物和子代植物的細(xì)胞。生產(chǎn)可作為產(chǎn)品銷(xiāo)售的種子的方法，該種子提供改變的根構(gòu)造，該方法包括任一前述優(yōu)選的方法，并且還包括從所述子代植物獲得種子，其中所述種子在它們的基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體。附圖以及序列表的說(shuō)明根據(jù)以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細(xì)描述和附圖以及序列表形成本申請(qǐng)的一部分。圖1示出pHSbarENDs激活標(biāo)記構(gòu)建體(SEQIDNO1)的圖譜，該構(gòu)建體用于制備擬南芥種群。圖2示出載體pD0NRTM/ZeO(SEQIDNO2)的圖譜。attPl位點(diǎn)位于核苷酸570至801；attP2位點(diǎn)位于核苷酸2754至2985(互補(bǔ)鏈)。圖3示出載體pD0NR221(SEQIDNO3)的圖譜。attPl位點(diǎn)位于核苷酸570至801；attP2位點(diǎn)位于核苷酸2754至2985(互補(bǔ)鏈)。圖4示出載體pBC-yell0W(SEQIDNO4)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建擬南芥表達(dá)載體的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸11276至11399(互補(bǔ)鏈)；attR2位點(diǎn)位于核苷酸9695至9819(互補(bǔ)鏈)。圖5示出PHP27840(SEQIDNO5)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建大豆表達(dá)載體的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸7310至7434；attR2位點(diǎn)位于核苷酸8890至9014。圖6示出PHP23236(SEQIDNO6)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建GaspeBayFlint來(lái)源的玉米品系的表達(dá)載體的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸2006至2130；attR2位點(diǎn)位于核苷酸2899至3023。圖7示出PHP10523(SEQIDNO7)的圖譜，它是存在于農(nóng)桿菌菌株LBA4404中的質(zhì)粒DNA。圖8示出PHP23235(SEQIDNO8)的圖譜，它是用于構(gòu)建目的載體PHP23236的載體。圖9示出了入門(mén)克隆PHP20234(SEQIDNO9)的圖譜，它是轉(zhuǎn)運(yùn)PINII終止子的載體。attR2位點(diǎn)位于核苷酸591至747；attL3位點(diǎn)位于核苷酸1100至1195。圖10示出PHP28529(SEQIDNO10)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建玉米品系表達(dá)載體的目的載體。attR3位點(diǎn)位于核苷酸3613至3737；attR4位點(diǎn)位于核苷酸2035至2159。圖11示出了入門(mén)克隆PHP28408(SEQIDNO:11)的圖譜，它是轉(zhuǎn)運(yùn)組成型玉米G0S2啟動(dòng)子的載體。attL4位點(diǎn)位于核苷酸160至255；attRl位點(diǎn)位于核苷酸2301至2447。圖12示出了入門(mén)克隆PHP22020(SEQIDNO12)的圖譜，它是轉(zhuǎn)運(yùn)玉米根NAS2啟動(dòng)子的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸31至187；attL4位點(diǎn)位于核苷酸2578至2673。圖13示出PHP29635(SEQIDNO13)的圖譜，該載體是用于構(gòu)建GaspeBayFlint來(lái)源的玉米品系的表達(dá)載體的目的載體。attRl位點(diǎn)位于核苷酸40786至40910；attR2位點(diǎn)位于核苷酸41679至41803。圖14示出PII0XS2a-FRT87(ni)m(SEQIDNO56)的圖譜，該載體用于構(gòu)建目的載體PHP29635。圖15A至15K示出以下全長(zhǎng)氨基酸序列的多重比對(duì)SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、和37，以及SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和51。完全匹配共有序列的殘基顯示為暗色。將共有序列顯示于每個(gè)比對(duì)上部。共有殘基通過(guò)直接取多數(shù)決定。圖16示出圖15A至15K中示出的NDK同源物的每對(duì)氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值圖表。圖17是實(shí)施例17中用于半水栽玉米生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。圖18是列出實(shí)施例17中與不同硝酸鹽濃度對(duì)GaspeBayFlint衍生的玉米系生長(zhǎng)和發(fā)育的影響相關(guān)的數(shù)據(jù)的圖表。序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825所列出的關(guān)于專(zhuān)利申請(qǐng)中核苷酸和/或氨基酸序列公開(kāi)的規(guī)定。序列表包含用于核苷酸序列字符的單字母碼和用于氨基酸的三字母碼，如遵照IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)所定義的，該標(biāo)準(zhǔn)在NucleicAcidsRes.133021-3030(1985)以及在BiochemicalJ.219(No.2):345_373(1984)中描述，這兩篇文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的規(guī)定。SEQIDNOIpHSbarENDsSEQIDNO:2pD0NR/ZeoSEQIDNO:3pD0NR221SEQIDNO:4pBC-yellowSEQIDNO:5PHP27840SEQIDNO:6PHP23236SEQIDNO:7PHP10523SEQIDNO:8PHP23235SEQIDNO:9PHP20234SEQIDNO:10PHP28529SEQIDNO:11PHP28408SEQIDNO:12PHP22020SEQIDNO:13PHP29635表1列出了本文所述的多肽、包含編碼多肽全部或其主要部分的核酸片段的cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的對(duì)應(yīng)標(biāo)識(shí)符(SEQIDN0:)。核苷二磷酸激酶(NDK)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>SEQIDNO:50是擬南芥核苷二磷酸激酶(NDK)(AT4G23900)的核苷酸序列，其中氨基酸序列的核苷酸51-764(終止)代碼示于SEQIDNO51,NCBIGeneralIdentifierNo.11990430)中。SEQIDNO:51對(duì)應(yīng)于NCBIGINO11990430(AT4G23900)SEQIDNO:52是attBl序列。SEQIDNO53是attB2序列。SEQIDNO:54是實(shí)施例9中的正向引物VC062。SEQIDNO:55是實(shí)施例9中的反向引物VC063。SEQIDNO:56PII0XS2a-FRT87(ni)m。SEQIDNO:57是玉米NAS2啟動(dòng)子。SEQIDNO:58是G0S2啟動(dòng)子。SEQIDNO:59是泛素啟動(dòng)子。SEQIDNO60是S2A啟動(dòng)子。SEQIDNO61是PINII終止子。優(yōu)選實(shí)施方案的具體描述本文中所列出的每篇參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容的全文以引用的方式并入本文。如本文所用的并在所附的權(quán)利要求書(shū)中的單數(shù)形式“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)涵義，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵義包括多株此類(lèi)植物?！耙粋€(gè)細(xì)胞”的涵義包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞及其本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的等同物，等等。術(shù)語(yǔ)“根構(gòu)造”指構(gòu)成根的不同部分的布置方式。術(shù)語(yǔ)“根構(gòu)造”、“根結(jié)構(gòu)”、“根系”或“根系構(gòu)造”在這里可互換使用。一般來(lái)講，植物由胚發(fā)育成的第一種根稱(chēng)為初生根。在大多數(shù)雙子葉植物中，初生根被稱(chēng)為主根。這種主根向下生長(zhǎng)并產(chǎn)生分枝根(側(cè)根)。在單子葉植物中，植物的初生根發(fā)生分枝，生成須根系。術(shù)語(yǔ)“改變的根構(gòu)造”指與參照植株或?qū)φ罩仓瓯容^，在其不同發(fā)育階段構(gòu)成根系的不同部分的改變狀況。應(yīng)當(dāng)理解，改變的根構(gòu)造涵蓋了一種或多種可測(cè)量參數(shù)(包括但不限于一個(gè)或多個(gè)根系部分的直徑、長(zhǎng)度、數(shù)目、角度或表面)的改變，所述根系部分包括但不限于初生根、側(cè)根或分枝根、不定根和根毛，所有這些均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些改變可導(dǎo)致根所占的區(qū)域或空間的整體改變。參照植株或?qū)φ罩仓暝谄浠蚪M中不含重組DNA構(gòu)建體或異源構(gòu)建體。“農(nóng)學(xué)特性”是可測(cè)量的參數(shù)，包括但不限于綠度、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營(yíng)養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮脅迫耐受性、氮攝取、根倒伏、莖倒伏、植株高度、穗長(zhǎng)和收獲指數(shù)。“氮脅迫耐受性”是植物的特性，指植物在氮限制條件下存活的能力。植物“提高的氮脅迫耐受性”相對(duì)于參照或?qū)φ罩参镞M(jìn)行測(cè)量，并意指植物的氮脅迫耐受性在與參照或?qū)φ罩参镞M(jìn)行比較時(shí)提高的任何量或量度?！暗{迫耐受性植物”是指表現(xiàn)出氮脅迫耐受性的植物。氮脅迫耐受性植物優(yōu)選地是在氮限制條件下相對(duì)于對(duì)照植物在至少一種農(nóng)學(xué)特性上表現(xiàn)出提高的植物。術(shù)語(yǔ)“V”階段是指玉米植物的葉片生長(zhǎng)階段；例如V4=四片、V5=五片具有可見(jiàn)葉頸的葉片。葉頸是淺色領(lǐng)狀“帶”，位于暴露的葉片底部，靠近葉片接觸植物莖部的區(qū)域。進(jìn)行葉片計(jì)數(shù)，開(kāi)始時(shí)計(jì)數(shù)最底下的、短的、圓頂真葉，最后計(jì)數(shù)具有可見(jiàn)葉頸的最上面的葉片?！皀dk”、“at-ndk本文可互換使用，指擬南芥位點(diǎn)AT4G23900(SEQIDNO50)。NDK指AT4G23900(SEQIDNO50)編碼的蛋白(SEQIDNO:51)?！皀dk樣”指擬南芥“NDK”位點(diǎn)AT4G23900(SEQIDNO:50)的來(lái)自不同物種的核苷酸同源物，如玉米和大豆，并且不受限制的包括任何以下核苷酸序列SEQIDN0:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、和42?！癗DK樣”指擬南芥“NDK”(SEQIDNO:51)的來(lái)自不同物種的蛋白同源物，如玉米和大豆，并且不受限制的包括任何以下氨基酸序列SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、和43。在公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中將擬南芥序列(AT4G23900)稱(chēng)為NDK4，將來(lái)自水稻、擬南芥和阿爾卑斯菥蓂、以及葡萄藤(分別是NCBIGiNo:115465831、15237018、62870979、和1477864944)的蛋白稱(chēng)為NDKIII，將來(lái)自豌豆、以及水稻(分別是6435320和125595441)的蛋白稱(chēng)為NDKI。不清楚什么決定NDK家族的不同成員的數(shù)目，因此該公開(kāi)的序列通稱(chēng)為NDK或NDK樣。所有所述公開(kāi)NDK、全長(zhǎng)NDK樣蛋白同源物(SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、和37以及所述擬南芥NDK(SEQIDNO51)包含保守組氨酸，具有序列NXXHGSDXX。“環(huán)境條件”指植物生長(zhǎng)的條件，例如水的可用性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(例如氮)的可用性或者病害的存在。“轉(zhuǎn)基因”指其基因組因異源核酸(如重組DNA構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過(guò)有性雜交或無(wú)性生殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過(guò)常規(guī)植物育種方法或通過(guò)諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類(lèi)的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。“基因組”在用于植物細(xì)胞時(shí)不僅涵蓋存在于細(xì)胞核中的染色體DNA，而且還包括存在于細(xì)胞的亞細(xì)胞組分(如線粒體、質(zhì)粒)中的細(xì)胞器DNA。“植物”包括整個(gè)植株、植物器官、植物組織、種子和植物細(xì)胞以及同一植株的子代。植物細(xì)胞包括但不限于得自下列物質(zhì)的細(xì)胞種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子?！白哟卑ㄖ参锏娜魏魏罄m(xù)世代?！稗D(zhuǎn)基因”指其基因組因異源核酸(如重組DNA構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過(guò)有性雜交或無(wú)性生殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過(guò)常規(guī)植物育種方法或通過(guò)諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類(lèi)的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。“轉(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。優(yōu)選的是，異源多核苷酸被穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組中，使得該多核苷酸傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨(dú)地或作為重組DNA構(gòu)建體的部分整合進(jìn)基因組中。針對(duì)序列而言的“異源”意指來(lái)自外來(lái)物種的序列，或者如果來(lái)自相同物種，則指通過(guò)蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列?！岸嗪塑账帷薄ⅰ昂怂嵝蛄小?、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用并且是任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它們的5'-單磷酸形式存在)通過(guò)如下它們的單個(gè)字母名稱(chēng)來(lái)指代“A”為腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別對(duì)應(yīng)RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥(niǎo)苷酸或脫氧鳥(niǎo)苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，而“N”表示任意核苷酸?！岸嚯摹?、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類(lèi)似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥化和ADP-核糖基化。“信使RNA(mRNA)”指無(wú)內(nèi)含子并且可通過(guò)細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。“cDNA”指與mRNA模板互補(bǔ)并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是單鏈的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式?！俺墒臁钡鞍踪|(zhì)指經(jīng)翻譯后加工的多肽；即已經(jīng)去除了存在于初級(jí)翻譯產(chǎn)物中的任何前肽或原肽的多肽?！扒绑w”蛋白質(zhì)指mRNA的翻譯初級(jí)產(chǎn)物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)?！胺蛛x的”指物質(zhì)，例如核酸和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說(shuō)是該物質(zhì)被從所述組分移出。分離的多核苷酸可從它們天然存在于其中的宿主細(xì)胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸?！爸亟M體”指例如通過(guò)化學(xué)合成或者通過(guò)用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸片段來(lái)實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)原本分離的序列片段的人工組合。“重組體”也包括指已經(jīng)通過(guò)引入異源核酸而進(jìn)行了修飾的細(xì)胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細(xì)胞的細(xì)胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事件(如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)對(duì)細(xì)胞或載體的改變，例如沒(méi)有蓄意人為干擾而發(fā)生的那些。“重組DNA構(gòu)建體”指在自然界中通常不會(huì)一起存在的核酸片段的組合。因此，重組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來(lái)源但以不同于通常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。術(shù)語(yǔ)“入門(mén)克隆”和“入門(mén)載體”本文可互換使用?！罢{(diào)控序列”指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)，并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列?！皢?dòng)子”指能夠控制另一核酸片段轉(zhuǎn)錄的核酸片段?！霸谥参镏杏泄δ艿膯?dòng)子”指能夠控制植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，無(wú)論其是否來(lái)源于植物細(xì)胞。“組織特異性啟動(dòng)子”和“組織優(yōu)選啟動(dòng)子”可互換使用，并且指主要但非必須專(zhuān)一地在一種組織或器官中表達(dá)，而是也可在一種特定細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。“發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子”指其活性由發(fā)育事件決定的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指核酸片段聯(lián)合成單一片段，使得其中一個(gè)核酸片段的功能受到另一個(gè)核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動(dòng)子能夠調(diào)控核酸片段的轉(zhuǎn)錄時(shí)，該啟動(dòng)子與該核酸片段進(jìn)行了可操作地連接?！氨磉_(dá)”指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，核酸片段的表達(dá)可指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(如生成mRNA或功能RNA的轉(zhuǎn)錄)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)?！氨硇汀币庵讣?xì)胞或生物體的可檢測(cè)的特征。有關(guān)將核酸片段(例如重組DNA構(gòu)建體)插入細(xì)胞內(nèi)的“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)，轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)?！稗D(zhuǎn)化細(xì)胞”是將核酸片段(如重組DNA構(gòu)建體)引入其中的任何細(xì)胞。在此所用的“轉(zhuǎn)化”指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化兩者?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。一旦穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸片段穩(wěn)定地整合進(jìn)宿主生物體和任何連續(xù)世代的基因組中。“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”指將核酸片段引入宿主生物體的核中或包含DNA的細(xì)胞器中，引起基因表達(dá)而沒(méi)有基因穩(wěn)定遺傳。“等位基因”是占據(jù)染色體上給定位點(diǎn)的基因的幾種供選擇形式的其中一種。當(dāng)二倍體植物中一對(duì)同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時(shí)，該植物在該基因座處是純合的。如果二倍體植物中一對(duì)同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同，則該植物在該基因座處是雜合的。如果轉(zhuǎn)基因存在于二倍體植物中一對(duì)同源染色體中的其中之一上，則該植物在該基因座處是半合子的。序列比對(duì)和同一性百分比可用設(shè)計(jì)用于檢測(cè)同源序列的多種比較方法來(lái)確定，這些方法包括但不限于LASERGENE生物信息計(jì)算包(DNASTARInc.，Madison,WI)的Megalign程序。除非另外說(shuō)明，否則本文提供的序列的多重比對(duì)用ClustalV比對(duì)方法(Higgins和Sharp,1989，CABI0S.5151-153)采用默認(rèn)參數(shù)(空位罰分=10，空位長(zhǎng)度罰分=10)執(zhí)行。用ClustalV方法進(jìn)行成對(duì)比對(duì)和蛋白質(zhì)序列的同一性百分比計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE=1、缺口罰分=3、窗口(WINDOW)=5和DIAGONALSSAVED=5。而對(duì)于核酸，這些參數(shù)為KTUPLE=2，空位罰分=5，窗口=4和DIAGONALSSAVED=4。用ClustalV程序比對(duì)序列后，可通過(guò)查看同一程序中的“序列距離，，表來(lái)獲得“同一性百分比”和“趨異”值。除非另外說(shuō)明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計(jì)算的。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn)中有更全面的描述Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch,E.F.禾口Maniatis，Τ.，MolecularCloningALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,1989(下文稱(chēng)為“Sambrook”)。現(xiàn)在來(lái)看優(yōu)選的實(shí)施方案優(yōu)選的實(shí)施方案包括分離的多核苷酸和多肽、重組DNA構(gòu)建體、包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(例如植株或種子)以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。優(yōu)選的分離的多核苷酸和多肽本發(fā)明包括如下優(yōu)選的分離的多核苷酸和多肽分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^；100%的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。所述多肽優(yōu)選地是NDK或NDK樣蛋白。分離的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDN015、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,8182%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、99%或100%的序列同一性。所述多肽優(yōu)選地是NDK或NDK樣蛋白。分離的多核苷酸，該多核苷酸包含(i)基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42或50進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,8182%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、99%或100%的序列同一性的核酸序列，或(ii)(i)核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。該分離的多核苷酸編碼NDK或NDK樣蛋白。優(yōu)選的重組DNA構(gòu)建體和抑制DNA構(gòu)建體。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(如，在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中該多核苷酸包含(i)編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii)(i)核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(如，在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)在與SEQIDNO:14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42或50進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%,5152%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,8182%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9192%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的核酸序列，或(ii)(i)核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。圖15A至15K顯示以下全長(zhǎng)氨基酸序列的多重比對(duì)SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、和37，以及SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和51。用LASERGENE生物信息計(jì)算包(DNASTARIne,，Madison，wi)的Megalign程序進(jìn)行序列多重比對(duì)。具體地講，使用ClustalV比對(duì)方法(Higgins和Sharp(1989)CABI0S.5151-153)，多重比對(duì)預(yù)設(shè)參數(shù)為空位罰分=10，空位長(zhǎng)度罰分=10，成對(duì)比對(duì)預(yù)設(shè)參數(shù)為KTUPLE=1，空位罰分=3，窗口=5以及DIAGONALSSAVED=5。圖16示出圖15A至15K中示出的NDK同源物的每對(duì)氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(如，在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼NDK或NDK樣蛋白。在另一方面，本發(fā)明包括抑制DNA構(gòu)建體。抑制DNA構(gòu)建體優(yōu)選包含至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)，該調(diào)控序列可操作地連接至(a)以下序列的全部或部分(i)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,7172%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,8182%,83%,84%,85%,86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii)(a)(i)核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或者(b)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,7172%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,8182%,83%,84%,85%,86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣蛋白；或(c)以下序列的全部或部分(i)基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42或50進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,7172%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的核酸序列，或(c)(i)核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列。該抑制DNA構(gòu)建體優(yōu)選包含共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制性構(gòu)建體、莖環(huán)抑制性構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構(gòu)建體、RNAi構(gòu)建體或小RNA構(gòu)建體(如，siRNA構(gòu)建體或miRNA構(gòu)建體)。應(yīng)當(dāng)理解(正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解的)，本發(fā)明不僅僅涵蓋這些具體的示例性序列。導(dǎo)致給定位點(diǎn)處產(chǎn)生化學(xué)上等價(jià)的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核酸片段中的改變是本領(lǐng)域眾所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一種疏水性氨基酸)的密碼子可被編碼另一個(gè)疏水性較弱的殘基(例如甘氨酸)或疏水性較強(qiáng)的殘基(例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。類(lèi)似地，導(dǎo)致一個(gè)帶負(fù)電荷的殘基替換為另一個(gè)帶負(fù)電荷的殘基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一個(gè)帶正電荷的殘基替換為另一個(gè)帶正電荷的殘基(例如，賴(lài)氨酸替換精氨酸)的改變也可預(yù)期產(chǎn)生功能上等價(jià)的產(chǎn)物。導(dǎo)致多肽分子的N-末端和C-末端部分改變的核苷酸變化也將預(yù)計(jì)不會(huì)改變多肽的活性。所提出的修飾中的每一種均完全在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)內(nèi)，如測(cè)定所編碼的產(chǎn)物的生物活性的保留?！耙种艱NA構(gòu)建體”是在轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組時(shí)，導(dǎo)致該植物中的靶基因“沉默”的重組DNA構(gòu)建體。對(duì)該植物來(lái)說(shuō)，該靶基因可以是內(nèi)源性的或是轉(zhuǎn)基因的。如本文針對(duì)靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表達(dá)的mRNA或蛋白質(zhì)/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白質(zhì)功能性的水平上的抑制。術(shù)語(yǔ)“抑制”包括降低、減少、下調(diào)、減弱、抑制、消除或阻止?！俺聊被颉盎虺聊辈淮_定機(jī)理并且包括(并且不限于)反義、共抑制、病毒抑制、發(fā)夾抑制、莖環(huán)抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。抑制DNA構(gòu)建體可包含源自所關(guān)注的靶基因的區(qū)域并且可包含所關(guān)注的靶基因的有義鏈(或反義鏈)的核酸序列的全部或部分。取決于所要利用的方法，該區(qū)域可與所關(guān)注基因的有義鏈(或反義鏈)的全部或部分100%相同或者有少于100%的同一性(如，有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性)。抑制DNA構(gòu)建體是本領(lǐng)域所熟知的，一旦選定所關(guān)注的靶基因就很容易構(gòu)建，并且包括但不限于共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制性構(gòu)建體、莖環(huán)抑制性構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構(gòu)建體，以及更通常的是，RNAi(RNA干擾)構(gòu)建體和小RNA構(gòu)建體，例如siRNA(短干擾RNA)構(gòu)建體和miRNA(微RNA)構(gòu)建體。“反義抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶蛋白表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物。“反義RNA”指與靶初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補(bǔ)，并阻斷分離的靶核酸片段表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，107，065)。反義RNA可與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即5'非編碼序列、3'非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列互補(bǔ)。“共抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶蛋白表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物。“有義”RNA指包括mRNA和在細(xì)胞內(nèi)或體外可被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA在內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄物。此前，已通過(guò)著眼于以有義方向過(guò)表達(dá)與內(nèi)源mRNA具有同源性的核酸序列(其導(dǎo)致與過(guò)表達(dá)的序列具有同源性的所有RNA減少)設(shè)計(jì)出了植物中的共抑制構(gòu)建體(參見(jiàn)Vaucheret等人，1998，PlantJ.，16651-659；以及Gura，2000Nature404:804_808)。另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導(dǎo)對(duì)近端mRNA編碼序列的抑制(于1998年8月20日公開(kāi)的PCT專(zhuān)利公開(kāi)WO98/36083)。此前描述的是“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的利用，該結(jié)構(gòu)以互補(bǔ)方向整合mRNA編碼序列的全部或部分，導(dǎo)致已表達(dá)的RNA形成潛在的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)(于1999年10月21日公開(kāi)的PCT專(zhuān)利公開(kāi)W099/53050)。在這種情況下，莖由對(duì)應(yīng)相對(duì)于啟動(dòng)子以有義或反義方向插入的相關(guān)基因的多核苷酸形成，并且環(huán)由一些相關(guān)基因的多核苷酸形成，在構(gòu)建體中該多核苷酸不具有互補(bǔ)序列。這增加了獲得的轉(zhuǎn)基因植物中的共抑制或沉默頻率。關(guān)于發(fā)夾抑制的綜述，參JALWesley,S.V.等人，2003,MethodsinMolecularBiology,PlantFunctionalGenomicsMethodsandProtocols236:273_286。其中莖由至少30個(gè)來(lái)自待抑制基因的核苷酸形成而環(huán)由任意的核苷酸序列形成的構(gòu)建體也已經(jīng)有效地用于抑制(于1999年12月2日公開(kāi)的PCT專(zhuān)利公開(kāi)WO99/61632)。使用聚-T和聚-A序列產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖已經(jīng)有所描述(于2002年1月3日公開(kāi)的PCT專(zhuān)利公開(kāi)WO02/00894)。然而另一種變型涉及使用合成的重復(fù)序列來(lái)促進(jìn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖的形成。用這種重組DNA片段產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生物體已經(jīng)顯示由形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸片段編碼的蛋白質(zhì)的水平降低，如于2002年1月3日公開(kāi)的PCT專(zhuān)利公開(kāi)WO02/00904中所述。RNA干擾是指由短干擾性RNA(SiRNA)介導(dǎo)的動(dòng)物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過(guò)程(Fire等人，Nature391:8061998)。在植物中的對(duì)應(yīng)過(guò)程通常稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也稱(chēng)為阻抑作用(quelling)。據(jù)信轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程是用于防止外來(lái)基因表達(dá)的進(jìn)化保守性細(xì)胞防御機(jī)制，并且通常由不同植物區(qū)系和門(mén)所共有(Fire等人，TrendsGenet.153581999)。這種防止外來(lái)基因表達(dá)的保護(hù)作用可能是通過(guò)特異性破壞病毒基因組RNA的同源單鏈RNA的細(xì)胞反應(yīng)，響應(yīng)源自病毒感染或源自轉(zhuǎn)座因子隨機(jī)整合到宿主基因組內(nèi)的雙鏈RNA(dsRNA)的生成而進(jìn)化而來(lái)。dsRNA在細(xì)胞中的存在通過(guò)還沒(méi)有完全表征的機(jī)制引發(fā)了RNAi反應(yīng)。細(xì)胞中長(zhǎng)dsRNA的存在刺激了稱(chēng)為dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉及使dsRNA加工成稱(chēng)為短干擾RNA(siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人，Nature4093632001)。源自dicer活性的短干擾RNA的長(zhǎng)度通常是約21至約23個(gè)核苷酸，并且包含約19個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體(Elbashir等人，GenesDev.15=188,2001)Dicer還涉及從保守結(jié)構(gòu)的前體RNA上切下21個(gè)和22個(gè)核苷酸的小時(shí)序RNA(StRNA)，該小時(shí)序RNA參與翻譯控制(Hutvagner等人，2001，Science293:834)。RNAi響應(yīng)還涉及內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，通常稱(chēng)為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，其介導(dǎo)具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的序列的單鏈RNA的裂解。靶RNA的裂解在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域中間發(fā)生(Elbashir等人，GenesDev.15:188，2001)。此外，RNA干擾還涉及小RNA(如miRNA)介導(dǎo)的基因沉默，可推定是通過(guò)調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并由此防止靶基因序列轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞機(jī)制(參見(jiàn)(例如)Allshire,Science297:1818-18192002;Volpe等人，Science297:1833-18372002；Jenuwein,Science297:2215_22182002；和Hall等人，Science297:2232_22372002)。這樣，本發(fā)明的miRNA分子可用于通過(guò)與RNA轉(zhuǎn)錄物相互作用或者作為另一種選擇通過(guò)與特定基因序列相互作用來(lái)介導(dǎo)基因沉默，其中這樣的相互作用導(dǎo)致在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默。已經(jīng)在多種系統(tǒng)中研究了RNAi。Fire等人(Nature391=806,1998)首次在秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)中觀察到RNAi。Wianny和Goetz(NatureCellBiol.2:70，1999)描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介導(dǎo)的RNAi。Hammond等人(Nature404:293,2000)描述了在用dsRNA轉(zhuǎn)染的果蠅(Drosophila)細(xì)胞中的RNAi。Elbashir等人(Nature4114942001)描述了通過(guò)將合成的21-核苷酸RNA的雙鏈體引入包括人胚腎和HeLa細(xì)胞在內(nèi)的培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中而誘導(dǎo)的RNAi。小RNA在控制基因表達(dá)中起重要作用。很多發(fā)育過(guò)程(包括開(kāi)花)的調(diào)控是由小RNA控制的。現(xiàn)在有可能通過(guò)使用在植物中產(chǎn)生小RNA的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體來(lái)以工程手段改變植物基因的基因表達(dá)。小RNA似乎是通過(guò)與互補(bǔ)RNA或DNA靶序列堿基配對(duì)來(lái)行使功能的。當(dāng)與RNA結(jié)合時(shí)，小RNA或者引發(fā)靶序列的RNA裂解或者引發(fā)翻譯抑制。當(dāng)與DNA靶序列結(jié)合時(shí)，據(jù)信小RNA可介導(dǎo)靶序列的DNA甲基化。無(wú)論具體機(jī)制是什么，這些事件的后果是基因表達(dá)受到抑制。據(jù)認(rèn)為，小RNA和它們的RNA靶標(biāo)之間的序列互補(bǔ)性有助于確定采用了哪種機(jī)制(RNA裂解或翻譯抑制)。據(jù)信，優(yōu)選與它們的靶標(biāo)互補(bǔ)的siRNA通過(guò)RNA裂解起作用。一些miRNA與它們的靶基因具有完全或幾乎完全的互補(bǔ)性，并且對(duì)于至少一些這樣的miRNA，已經(jīng)驗(yàn)證了RNA裂解。其他miRNA與它們的靶標(biāo)具有若干錯(cuò)配，并且在翻譯水平上明顯抑制了它們的靶標(biāo)。同樣，無(wú)需堅(jiān)持特定的作用機(jī)理，出現(xiàn)了這樣一種一般規(guī)律完全或幾乎完全的互補(bǔ)性引起RNA裂解，而當(dāng)miRNA/靶標(biāo)雙鏈體含有許多錯(cuò)配時(shí)傾向于翻譯抑制。對(duì)于此規(guī)律的一個(gè)明顯例外是植物中微RNA172(miR172)。miR172的其中一個(gè)靶標(biāo)是APETALA2(AP2)，盡管miR172與AP2具有幾乎完全的互補(bǔ)性，但其表現(xiàn)出引起AP2的翻譯抑制而不是引起RNA裂解。微RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為約19至約24個(gè)核苷酸(nt)的已經(jīng)在動(dòng)物和植物中鑒定出的非編碼RNA(Lagos-Quintana等人，Science294:853_8582001，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12:735_7392002；Lau等人，Science294:858_862，2001；Lee禾口Ambros,Science294:862_864，2001;Llave等人，PlantCell141605-1619,2002；Mourelatos^人，Genes.Dev.16:720_728，2002；Park等人，Curr.Biol.121484-1495，2002；Reinhart等人，Genes.偏差(Dev.)16:1616_1626，2002)。它們是由大小為大約70至200nt的較長(zhǎng)的前體轉(zhuǎn)錄物加工生成的，并且這些前體轉(zhuǎn)錄物能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在動(dòng)物中，涉及加工miRNA前體的酶稱(chēng)為Dicer，這是一種核糖核酸酶III樣蛋白(Grishok等人，Cell10623-342001;Hutvagner等人，Science293:834-8382001;Ketting等人，Genes.偏差(Dev.)152654-2659,2001)。植物也具有Dicer樣酶，即DCLl(以前稱(chēng)為CARPELFACTORY/SHORTINTEGUMENTS1/SUSPENSOR1)，并且最近有證據(jù)表明，其像Dicer—樣，也涉及發(fā)夾前體的加工以產(chǎn)生成熟miRNA(Park等人，Curr.Biol.121484-1495,2002；Reinhart等人，Genes.偏差(Dev.)16:1616_1626，2002)。此外，最近的研究已經(jīng)清楚地表明，至少某些miRNA發(fā)夾前體最初是作為較長(zhǎng)的聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄物存在，并且在單個(gè)轉(zhuǎn)錄物中可存在幾種不同的miRNA以及相關(guān)發(fā)夾(Lagos-Quintana等人，Science294:853_8582001；Lee等人，EMBOJ21=4663-46702002)。最近的研究還測(cè)定了從dsRNA產(chǎn)物的miRNA鏈選擇，所述dsRNA產(chǎn)物是通過(guò)DICER加工發(fā)夾而產(chǎn)生的(Schwartz等人，2003，Cell115:199-208)?？雌饋?lái)，經(jīng)加工的dsRNA的兩端的穩(wěn)定性(即GC與AU的含量比，和/或錯(cuò)配)影響鏈選擇，具有低穩(wěn)定性的末端更容易因解旋酶活性而解旋。低穩(wěn)定性末端的5’末端鏈被整合至RISC復(fù)合物內(nèi)，而另一條鏈被降解。微RNA看起來(lái)通過(guò)與位于由這些基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物中的互補(bǔ)序列結(jié)合來(lái)調(diào)控靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位點(diǎn)位于靶mRNA的3'非翻譯區(qū)中(Lee等人，Cell75:843-854，1993；Wightman等人，Cell75:855_862，1993；Reinhart等人，Nature403901-906，2000；Slack等人，Mol.Cell5:659_6692000)，并且在lin_4和let_7miRNA與其靶位點(diǎn)之間有幾個(gè)錯(cuò)配。lin-4或let-7miRNA的結(jié)合看起來(lái)引起了由靶mRNA編碼的蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)水平下調(diào)，而不影響轉(zhuǎn)錄物自身(Olsen和Ambros，Dev.Biol.216=671-680,1999)另一方面，最近有證據(jù)表明，在某些情況下，miRNA可引起靶轉(zhuǎn)錄物在靶位點(diǎn)內(nèi)特異性RNA裂解，并且該裂解步驟看起來(lái)需要miRNA與靶轉(zhuǎn)錄物之間具有100%的互補(bǔ)性(Hutvagner和Zamore,Science297:2056-20602002;Llave等人，PlantCell14:1605-16192002)?？雌饋?lái)有可能miRNA可進(jìn)入至少兩條靶基因調(diào)控途徑當(dāng)靶互補(bǔ)性<100%時(shí)，蛋白下調(diào)，當(dāng)靶互補(bǔ)性是100%時(shí)，RNA裂解。進(jìn)入RNA裂解途徑的微RNA與在動(dòng)物中RNA干擾(RNAi)期間以及在植物中轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)期間產(chǎn)生的21-25nt短干擾RNA(SiRNA)類(lèi)似(Hamilton禾口Baulcombel999；Hammond等人，2000；Zamore等人，2000；Elbashir等人，2001)，并且可能整合進(jìn)與在RNAi情況中觀察到的復(fù)合物類(lèi)似或相同的RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)內(nèi)。用生物信息學(xué)鑒定miRNA的靶標(biāo)在動(dòng)物中沒(méi)有成功，這可能是因?yàn)閯?dòng)物miRNA與它們的靶標(biāo)具有低水平的互補(bǔ)性。另一方面，生物信息學(xué)方法已經(jīng)成功地用于預(yù)測(cè)植物miRNA的靴標(biāo)(Llave等人，PlantCell141605-16192002；Park等人，Curr.Biol.121484-14952002;Rhoades等人，Cell110:513-5202002)，因此，看起來(lái)植物miRNA與它們的推定靶標(biāo)的整體互補(bǔ)性高于動(dòng)物miRNA。植物miRNA的這些預(yù)測(cè)靶標(biāo)中的大部分編碼涉及植物發(fā)育模式或細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體(包括抑制DNA構(gòu)建體)優(yōu)選包含至少一種調(diào)控序列。優(yōu)選的調(diào)控序列是啟動(dòng)子。多種啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體(及抑制DNA構(gòu)建體)中?？筛鶕?jù)所需結(jié)果來(lái)選擇啟動(dòng)子，并且可包括用于在宿主生物體中表達(dá)的組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其他啟動(dòng)子。雖然候選基因當(dāng)通過(guò)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)可預(yù)測(cè)其效應(yīng)，但候選基因在35S或UBI啟動(dòng)子控制下的高水平、組成型表達(dá)可具有多重效應(yīng)。使用組織特異表達(dá)和/或脅迫特異表達(dá)可消除不需要的效應(yīng)但保留改變根構(gòu)造的能力。在擬南芥中已經(jīng)觀察到了該效應(yīng)(Kasuga等人(1999)NatureBiotechnol.17287-291)。適用于植物宿主細(xì)胞的組成型啟動(dòng)子包括例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子和在WO99/43838和美國(guó)專(zhuān)利6，072，050中公開(kāi)的其他組成型啟動(dòng)子；CaMV35S核心啟動(dòng)子(Odell等人，Nature313:810-812(1985))；水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等人，PlantCell2:163_171(1990))；泛素啟動(dòng)子(UBI)(Christensen等人，PlantMol.Biol.12619-632(1989)和Christensen等人，PlantMol.Biol.18:675_689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81:581_588(1991))；MAS(Velten等人，EMBOJ.3=2723-2730(1984))；ALS啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)5，659，026)、玉米G0S2啟動(dòng)子(W00020571A2，公布于2000年4月1日)等。其他組成型啟動(dòng)子包括例如在美國(guó)專(zhuān)利5，608，149,5,608，144,5,604，121,5,569，597,5,466，785,5,399，680,5,268，463、5，608，142和6，177，611中公開(kāi)的那些啟動(dòng)子。在選擇啟動(dòng)子用于本發(fā)明方法時(shí)，可能有利的是使用組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子。優(yōu)選的組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子是這樣的DNA序列，該序列調(diào)控DNA序列選擇性地在對(duì)雄穗發(fā)育、結(jié)籽或兩者重要的植物細(xì)胞/組織中表達(dá)，并限制這種DNA序列只在植物的雄穗發(fā)育或種子成熟期間表達(dá)。任何引起所需時(shí)空表達(dá)的可鑒定啟動(dòng)子均可用于本發(fā)明的方法中。種子或胚特異性的并且可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括大豆Kimitz胰蛋白酶抑制劑(Kti3，Jofuku和Goldberg，PlantCell11079-1093(1989))、馬鈴薯塊蓮特異蛋白(patatin)(馬鈴薯塊蓮)(Rocha-Sosa，Μ.等人，1989，EMBOJ.8:23_29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子葉)(Rerie,W.G.等人，1991，Mol.Gen.Genet.259149-157；Newbigin,E.J.等人，1990，Planta180461-470；Higgins,T.J.V.等人，1988，Plant.Mol.Biol.11683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，1988，EMBOJ.71249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子葉)(Segupta-Gopalan，C.等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Α.82=3320-3324)、植物凝集素(菜豆子葉)(Voelker，Τ.等人，1987，EMBOJ.63571-3577)、B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子葉)(Chen，Z-L等人，1988，EMBOJ.7297-302)、谷蛋白(水稻胚乳)、大麥醇溶蛋白(大麥胚乳)(Marris，C.等人，1988，PlantMol.Biol.10359-366)、麥谷蛋白和麥醇溶蛋白(小麥胚乳)(Colot，V.等人，1987，EMBOJ.63559-3564)和甘薯C藏蛋白(sporamin)(甘薯塊根)(Hattori，T.等人，1990,PlantMol.Biol.14:595-604)。可操作地連接至嵌合基因構(gòu)建體異源編碼區(qū)的種子特異性基因的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中保持它們的時(shí)空表達(dá)模式。這樣的實(shí)施例包括在擬南芥屬和甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)種子中表達(dá)腦啡肽的擬南芥2S種子儲(chǔ)藏蛋白基因啟動(dòng)子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology7:L929_932(1989))、表達(dá)熒光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白啟動(dòng)子(Riggs等人，PlantSci.63:47_57(1989))，以及表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的小麥谷蛋白啟動(dòng)子(Colot等人，EMBOJ6:3559-3564(1987))?？烧T導(dǎo)啟動(dòng)子響應(yīng)內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如通過(guò)化合物(化學(xué)誘導(dǎo)劑)，或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)信號(hào)和/或發(fā)育信號(hào)而選擇性表達(dá)可操作地連接的DNA序列?？烧T導(dǎo)的或受調(diào)控的啟動(dòng)子包括例如受光、熱、脅迫、水澇或干旱、植物激素、創(chuàng)傷或諸如乙醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類(lèi)的化學(xué)品調(diào)控的啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子包括如下啟動(dòng)子1)脅迫誘導(dǎo)型RD29A啟動(dòng)子(Kasuga等人，1999，NatureBiotechnol.17287-91)；2)大麥啟動(dòng)子B22E;B22E的表達(dá)是發(fā)育中的玉米籽粒巾白勺牛寺胃?jìng)€(gè)生白勺("PrimaryStructureofaNovelBarleyGeneDifferentiallyExpressedinlmmatureAleuroneLayers(在未成熟糊粉層中差異表達(dá)的新大麥基因的一級(jí)結(jié)構(gòu))”。Klemsdal,S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2):9_16(1991))；以及3)玉米啟動(dòng)子Zag2("IdentificationandmolecularcharacterizationofZAG1,themaizehomologoftheArabidopsisfloralhomeoticgeneAGAMOUS(ZAG1-擬南芥花同源異形基因AGAMOUS的玉米同系物的鑒定和分子表征)”，Schmidt,R.J.等人，PlantCell5(7):729_737(1993))ο"Structuralcharacterization,chromosomallocaliζationandphylogeneticevaluationoftwopairsofAGAMOUS-1ikeMADS-boxgenesfrommaize(兩對(duì)來(lái)自玉米的AGAMOUS樣MADS-box基因的結(jié)構(gòu)表征、染色體定位及系統(tǒng)發(fā)育評(píng)價(jià))，，，Theissen等人，Gene156(2)155-166(1995)；NCBIGenBank登錄號(hào)X80206))。Zag2轉(zhuǎn)錄物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被檢測(cè)到，并且引導(dǎo)Ciml在發(fā)育中的雌花序心皮中表達(dá)，Ciml對(duì)發(fā)育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml轉(zhuǎn)錄物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被檢測(cè)到。其他可用的啟動(dòng)子包括可源自其表達(dá)與發(fā)育中的雌小花母系相關(guān)的基因的任何啟動(dòng)子。用于在植物中調(diào)控本發(fā)明的核苷酸序列表達(dá)的其他優(yōu)選啟動(dòng)子是維管元件特異性啟動(dòng)子或莖優(yōu)選啟動(dòng)子。這種莖優(yōu)選啟動(dòng)子包括苜蓿S2A啟動(dòng)子(GenBank登錄號(hào)EF030816；Abrahams等人，PlantMol.Biol.27:513_528(1995))和S2B啟動(dòng)子(GenBank登錄號(hào)EF030817)等等，這些文獻(xiàn)以引用方式并入本文。啟動(dòng)子可整個(gè)源于天然基因，或者由源于天然存在的不同啟動(dòng)子的不同元件構(gòu)成，或者甚至包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動(dòng)子可在不同的組織或細(xì)胞類(lèi)型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者響應(yīng)不同的環(huán)境條件而引導(dǎo)基因的表達(dá)。還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，由于在大多數(shù)情況下還不能完全確定調(diào)控序列的確切范圍，一些變型的DNA片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。在多數(shù)情況下引起基因在大多數(shù)細(xì)胞型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱(chēng)為“組成型啟動(dòng)子”。目前不斷在發(fā)現(xiàn)可用于植物細(xì)胞中的不同類(lèi)型的新啟動(dòng)子；在Okamuro，J.K.禾口Goldberg，R.B.，BiochemistryofPlants151-82(1989)的、匯編中可找到許多實(shí)例。(將其與其他組成型啟動(dòng)子描述放在一起。)優(yōu)選的啟動(dòng)子可包括RIP2、mLIP15、ZmCORl、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子(SEQIDNO61)、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶啟動(dòng)子、R-等位基因啟動(dòng)子、根細(xì)胞啟動(dòng)子、維管組織特異性啟動(dòng)子S2A(Genbank登錄號(hào)EF030816；SEQIDNO62)和S2B(Genbank登錄號(hào)EF030817)及來(lái)自6260玉米的組成型啟動(dòng)子G0S2(SEQIDNO:60)。其他優(yōu)選的啟動(dòng)子包括根優(yōu)選的啟動(dòng)子，例如玉米NAS2啟動(dòng)子(SEQIDNO:59)、玉米Cyclo啟動(dòng)子(US2006/0156439，公開(kāi)于2006年7月13日)、玉米R(shí)00TMET2啟動(dòng)子(W005063998,公開(kāi)于2005年7月14日)、CRlBIO啟動(dòng)子(W006055487,公開(kāi)于2006年5月26日)、CRWAQ81(W005035770,公開(kāi)于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47啟動(dòng)子(NCBI保藏號(hào):U38790,gi1063664)。核苷酸序列的“主要部分”包含的核苷酸序列足以提供其包含的啟動(dòng)子的推定鑒定。核苷酸序列可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)人工評(píng)估，或使用基于計(jì)算機(jī)的序列比較和鑒定工具進(jìn)行評(píng)估，所述工具使用算法如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool；Altschul等人(1993)J.Mol.Biol.215:403-410)。一般來(lái)講，為了推定鑒定啟動(dòng)子核酸序列是否與已知啟動(dòng)子同源，包含三十或更多個(gè)鄰接核苷酸的序列是必需的。具有如本文報(bào)道序列的有益效果，技術(shù)人員現(xiàn)在可使用全部公布序列或它們的主要部分用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的目的。因此，本發(fā)明包括在附隨序列表中報(bào)道的完全序列，以及那些上述序列的主要部分。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體(及抑制DNA構(gòu)建體)也可包括其他調(diào)控序列，包括但不限于翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體還包括增強(qiáng)子或沉默子。內(nèi)含子序列可加入到至部分編碼序列的5’非翻譯區(qū)或編碼序列以增加積聚在胞漿中的成熟信息的量。已經(jīng)顯示，在植物和動(dòng)物兩者的表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接內(nèi)含子可使基因表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均增強(qiáng)高達(dá)1000倍。參見(jiàn)Buchman和Berg,Mol.CellBiol.84395-4405(1988)；Callis等人，GenesDev.1:1183_1200(1987)。這種內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)的增強(qiáng)通常在將其設(shè)置接近轉(zhuǎn)錄單位的5’端時(shí)為最大。玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子1、2和6、Bronze_l內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域已知的。通常參見(jiàn)TheMaizeHandbook，第116章，F(xiàn)reeling和Walbot(編輯)，Springer，紐約(1994)。如果期望進(jìn)行多肽表達(dá)，則通常希望在多核苷酸編碼區(qū)的3'-端處包含有多腺苷酸化區(qū)。該多腺苷酸化區(qū)可源自天然基因，源自多種其他植物基因或源自T-DNA。要加入的3'端序列可源自(例如)胭脂堿合成酶或章魚(yú)堿合成酶基因，或作為選擇源自另外的植物基因，或較不優(yōu)選的是源自任何其他真核基因?！胺g前導(dǎo)序列，，指位于基因啟動(dòng)子序列和編碼序列之間的DNA序列。翻譯前導(dǎo)序列存在于翻譯起始序列的經(jīng)完全加工后的mRNA上游。翻譯前導(dǎo)序列可影響mRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄過(guò)程、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例已經(jīng)有所描述(Turner，R.和Foster,G.MolecularBiotechnology3:225(1995))。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體還包括增強(qiáng)子或沉默子。任何植物均可選擇用來(lái)鑒定將用于產(chǎn)生本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體和抑制DNA構(gòu)建體的調(diào)控序列和基因。適用于分離基因和調(diào)控序列的靶植物的實(shí)例應(yīng)該包括但不限于苜蓿、蘋(píng)果、杏、擬南芥屬植物、朝鮮薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類(lèi)、甜菜、黑莓、藍(lán)莓、椰菜、抱子甘藍(lán)、卷心菜、低芥酸菜籽、香瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽、柑桔類(lèi)、克萊門(mén)氏小柑橘類(lèi)、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉花、酸果蔓、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉樹(shù)、茴香、無(wú)花果、大蒜、葫蘆、葡萄、柚子樹(shù)、白蘭瓜、豆薯、獼猴桃、生菜、韭蔥、檸檬、萊檬、火炬松、亞麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、堅(jiān)果、燕麥、油棕、油菜、秋葵、橄欖樹(shù)、洋蔥、橙、觀賞植物、棕櫚、番木瓜樹(shù)、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃樹(shù)、花生、梨樹(shù)、胡椒、柿樹(shù)、松樹(shù)、菠蘿、大蕉、李樹(shù)、石榴樹(shù)、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、紅菊苣、蘿卜、油菜、樹(shù)莓、水稻、黑麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香樹(shù)、柑橘、茶、煙草、蕃茄、黑小麥、草皮草、蕪菁、葡萄樹(shù)、西瓜、小麥、薯蕷和西葫蘆。用于鑒定調(diào)控序列的特別優(yōu)選的植物是擬南芥屬植物、玉米、小麥、大豆和棉花。優(yōu)詵的組合物本發(fā)明的優(yōu)選組合物是其基因組中包含本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體(包括任何抑制DNA構(gòu)建體)(例如上面所討論的那些優(yōu)選構(gòu)建體)的植物。優(yōu)選的組合物也包括任何植物的子代，以及獲取自植物或其子代的任何種子，其中所述子代或種子在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)。子代包括通過(guò)植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連續(xù)世代。子代也包括雜交種和近交系。優(yōu)選地，在雜交種子繁殖的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可自花授粉而產(chǎn)生純合的近交系植物。該近交系植物產(chǎn)生含有新引入的重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的種子。這些種子可生長(zhǎng)而產(chǎn)生將會(huì)表現(xiàn)出改變的根(或植物)構(gòu)造，或者可用于育種程序以產(chǎn)生雜交種子，這些雜交種子可生長(zhǎng)而產(chǎn)生將會(huì)表現(xiàn)出改變的根(或植物)構(gòu)造的植物。優(yōu)選地，種子是玉米。優(yōu)選地，植物是單子葉植物或雙子葉植物，更優(yōu)選地，是玉米或大豆植物，甚至更優(yōu)選的是玉米植物，例如玉米雜交種植物或玉米近交系植物。植物還可以是向日葵、高梁、蓖麻、葡萄、低芥酸菜籽、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥或小米。優(yōu)選地，重組DNA構(gòu)建體穩(wěn)定地整合進(jìn)植物的基因組中。尤其優(yōu)選的實(shí)施方案包括但不限于如下優(yōu)選的實(shí)施方案1.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(優(yōu)選玉米或大豆植物)，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,7172%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,8182%,83%,84%,85%,86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。優(yōu)選地，在與該對(duì)照植物比較時(shí)，該植物還表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。2.植物(優(yōu)選地玉米或大豆植物)，所述植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含(a)可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(b)抑制DNA構(gòu)建體，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或⑶所述(b)⑴㈧的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽，并且其中在與未包含所述重組構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。3.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(優(yōu)選玉米或大豆植物)，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼NDK或NDK樣蛋白，并且其中在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。優(yōu)選地，該植物還表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。優(yōu)選地，該NDK或NDK樣蛋白來(lái)自擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)、煙豆(Glycinetabacina)、里予大豆(Glycinesoja)禾口短絨里予大(Glycinetomentella)。4.在基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體的植物(優(yōu)選玉米或大豆植物)，該抑制DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)可操作地連接至源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域的調(diào)控元件，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,7172%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,8182%,83%,84%,85%,86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣蛋白，并且其中在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。5.在基因組中包含抑制DNA構(gòu)建體的植物(優(yōu)選玉米或大豆植物)，該抑制DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)可操作地連接至以下序列的全部或部分的調(diào)控元件(a)編碼多肽的核酸序列，在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，該多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(b)(a)核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列，并且其中在與未包含所述重組構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。6.上述優(yōu)選實(shí)施方案1-5中的植物的任何子代、上述優(yōu)選實(shí)施方案1-5中的植物的任何種子、上述優(yōu)選實(shí)施方案1-5中的植物的子代的任何種子以及來(lái)自上述優(yōu)選實(shí)施方案1-5中的植物以及它們的子代的細(xì)胞。在上述優(yōu)選的實(shí)施方案1-6或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中的任一項(xiàng)中，重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)優(yōu)選包含至少一個(gè)在植物中有功能的啟動(dòng)子作為優(yōu)選的調(diào)控序列。在上述優(yōu)選的實(shí)施方案1-6或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中的任一項(xiàng)中，至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變是增加或減少，優(yōu)選增加。在任一前述的優(yōu)選實(shí)施方案1至6或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中，至少一種農(nóng)學(xué)特性?xún)?yōu)選選自綠度、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營(yíng)養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、抗?jié)承?、氮攝取、氮脅迫耐受性、根倒伏、莖倒伏、植株高度、穗長(zhǎng)以及收獲指數(shù)；產(chǎn)量、綠度、生物量和根倒?fàn)钍怯绕鋬?yōu)選進(jìn)行改變的農(nóng)學(xué)特性(優(yōu)選增加)。在任一前述的優(yōu)選實(shí)施方案1至6或本發(fā)明的任何其他實(shí)施方案中，在與對(duì)照植物比較時(shí)，植物優(yōu)選表現(xiàn)出至少一種與環(huán)境條件例如水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可用性無(wú)關(guān)的農(nóng)學(xué)特性的改變。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉確定植物根構(gòu)造改變的規(guī)程。例如，可檢測(cè)分析轉(zhuǎn)基因玉米植物的根構(gòu)造在幼苗期、花期或成熟期的改變。根構(gòu)造的改變可以通過(guò)統(tǒng)計(jì)溫室培育的植物頂部第3或第4節(jié)的節(jié)根數(shù)目或根帶的寬度來(lái)確定?！案鶐А敝赋墒炱谥参镌诨ㄅ璧撞康母鶇矊挾?。植物根構(gòu)造變化的其他量度包括但不限于側(cè)根的數(shù)量、節(jié)根的平均根直徑、側(cè)根的平均根直徑、根毛的數(shù)量和長(zhǎng)度。側(cè)根分枝的程度(如側(cè)根數(shù)量、側(cè)根長(zhǎng)度)可通過(guò)這樣確定從完整的根系進(jìn)行二次取樣，將樣本用平面掃描器或數(shù)碼相機(jī)成像并用WinRHIZO軟件(RegentInstrumentsInc.)分析。對(duì)提取的有關(guān)根表型的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(通常為t檢驗(yàn))，以將轉(zhuǎn)基因根與非轉(zhuǎn)基因姊妹株植株的根進(jìn)行比較。在多個(gè)事件和/或構(gòu)建體涉及該分析的情況下，還可以使用單因素方差分析。下面的實(shí)施例描述了一些用于檢測(cè)根構(gòu)造改變的代表性規(guī)程和技術(shù)。也可通過(guò)在田間測(cè)試中，在相同條件下比較植物與對(duì)照或參照植物提高產(chǎn)量的能力，評(píng)估植物根構(gòu)造的改變。也可通過(guò)在田間測(cè)試中比較植物在脅迫條件下(例如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)?；蚴芟蕖⑺^(guò)?；蚴芟蕖⒋嬖诓『?保持基本產(chǎn)量(優(yōu)選地至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%、98%、99%或100%產(chǎn)量)的能力，與非脅迫條件下的對(duì)照或參照植物的產(chǎn)量，評(píng)估根構(gòu)造改變。根構(gòu)造的改變可以通過(guò)確定轉(zhuǎn)基因植物與參照植物或?qū)φ罩参锉容^的抗根倒伏性來(lái)測(cè)量。在評(píng)估或測(cè)量其中利用了對(duì)照或參照植物的本發(fā)明任何實(shí)施方案(如，如本文描述的組合物或方法)中的轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時(shí)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將很容易認(rèn)識(shí)到要利用的合適對(duì)照或參照植物。例如，通過(guò)如下非限制性示例來(lái)說(shuō)明1.轉(zhuǎn)化植物的子代，該植物對(duì)于重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)來(lái)說(shuō)是半合子的，使得該子代分離成包含或不包含該DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植株包含該重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的子代將通常相對(duì)于未包含該重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的子代來(lái)進(jìn)行測(cè)量(即，未包含該重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的子代是對(duì)照或參照植株)。2.重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)基因滲入至近交系中，例如在玉米中，或基因滲入進(jìn)變體中，例如在大豆中基因滲入品系將通常相對(duì)于親本近交系或變種品系進(jìn)行測(cè)量(即，親本近交系或變種品系是對(duì)照或參照植物)。3.雙雜交系，其中第一雜交系由兩個(gè)親本近交系產(chǎn)生，而第二雜交系由相同的兩個(gè)親本近交系產(chǎn)生，不同的是其中一個(gè)親本近交系含有重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)第二雜交系通常將相對(duì)于第一雜交系進(jìn)行測(cè)量(即親本近交系或變種品系為對(duì)照植物或參照植物)。4.包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植株該植株可以相對(duì)于這樣的對(duì)照植株進(jìn)行評(píng)估或測(cè)量，該對(duì)照植株不包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)，但具有與該植株相當(dāng)?shù)倪z傳背景(例如，與包含重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)的植株相比較，核遺傳物質(zhì)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性)。存在許多可用于分析、比較和表征植物遺傳背景的基于實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)；其中這些技術(shù)是同工酶電泳、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、任意引物聚合成酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、DNA擴(kuò)增指紋(DAF)、序列特異擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)和也稱(chēng)為微衛(wèi)星的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)。此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，評(píng)估或測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時(shí)合適的對(duì)照或參照植物將不包括先前已經(jīng)針對(duì)所需的農(nóng)學(xué)特性或表型，通過(guò)誘變或轉(zhuǎn)化而選擇的植物。優(yōu)選的方法優(yōu)選的方法包括但不限于用于改變植物根構(gòu)造的方法、用于評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造改變的方法、用于改變植物農(nóng)學(xué)特性的方法、用于測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法以及用于產(chǎn)生種子的方法。優(yōu)選地，植物是單子葉植物或雙子葉植物，更優(yōu)選地，是玉米或大豆植物，甚至更優(yōu)選地，是玉米植物。植物還可以是向日葵、高梁、蓖麻、低芥酸菜籽、小麥、苜蓿、棉花、水稻、大麥或小米。種子優(yōu)選的是玉米或大豆種子，更優(yōu)選的是玉米種子，并且甚至更優(yōu)選的是玉米雜交種子或玉米近交系種子。特別優(yōu)選的方法包括但不限于如下方法改變植物根構(gòu)造的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9193%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；以及(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體并且在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。所述方法可進(jìn)一步包括(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體并且在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。改變植物根構(gòu)造的方法，該方法包括(a)將包含至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)的抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可再生植物細(xì)胞，該調(diào)控序列可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，在與SEQIDN0:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，該多肽的氨基酸序列具有至少50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；以及(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體并且在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。所述方法可進(jìn)一步包括(c)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體并且在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造；評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造改變的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,100%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)該轉(zhuǎn)基因植物的根構(gòu)造；該方法還可包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(e)評(píng)價(jià)與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)該子代植物的根構(gòu)造。評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造改變的方法，所述方法包括(a)將包含至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)的抑制DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可再生植物細(xì)胞，該調(diào)控序列可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分㈧編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51比較時(shí)具有至少50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^；100%的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或者(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^；100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；以及(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因植物在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)改變的根構(gòu)造。該方法可另外包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)評(píng)價(jià)該子代植物在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)改變的根構(gòu)造。評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造改變的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)該子代植物在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)改變的根構(gòu)造。評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，當(dāng)與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，該多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或⑶所述(a)⑴㈧的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或者(ii)源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,8183%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)該子代植物的根構(gòu)造。測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQIDN0:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，該多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9192%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)確定該轉(zhuǎn)基因植物在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。該方法還可包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；以及(e)確定該子代植物在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，該方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該抑制DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)，所述調(diào)控序列可操作地連接以下序列的全部或部分(i)該核酸序列編碼多肽，在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，該多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,7173%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii)(i)核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)確定該轉(zhuǎn)基因植物在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。該方法可另外包括(d)獲得源自該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)確定該子代植物在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，該方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，在與SEQIDN0:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，該多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9192%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該重組DNA構(gòu)建體；并且(d)確定該子代植物在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測(cè)定植物中農(nóng)學(xué)特性改變的方法可進(jìn)一步包括測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在不同的環(huán)境條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，該方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，該抑制DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)調(diào)控序列(優(yōu)選在植物中有功能的啟動(dòng)子)，所述調(diào)控序列可操作地連接以下序列的全部或部分(i)該核酸序列編碼多肽，在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，該多肽的氨基酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%,59%,60%,56%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,7173%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，或(ii)(i)核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)確定該子代植物在與未包含該重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞，該抑制DNA構(gòu)建體包括至少一個(gè)調(diào)控元件，該調(diào)控元件可操作地連接至源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后從該可再生植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含該抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。所述方法可進(jìn)一步包括(d)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)確定該子代植物在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞，該抑制DNA構(gòu)建體包括至少一個(gè)調(diào)控元件，該調(diào)控元件可操作地連接至源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、56%、62%、63%、64%、65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣蛋白；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)確定該子代植物在與未包含該抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。產(chǎn)生種子(優(yōu)選可作為提供改變的根構(gòu)造的產(chǎn)品銷(xiāo)售的種子)的方法，該方法包括任一上述的優(yōu)選方法，并且還包括從所述子代植物獲得種子，其中所述種子在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體(或抑制DNA構(gòu)建體)。在任一前述的優(yōu)選方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，測(cè)定轉(zhuǎn)基因植物中農(nóng)學(xué)特性改變的步驟(如果適用的話(huà))可優(yōu)選地包括測(cè)定在改變的環(huán)境條件下與不包含重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)該轉(zhuǎn)基因植物是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在任一前述的優(yōu)選方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，測(cè)定子代植物中農(nóng)學(xué)特性改變的步驟(如果適用的話(huà))可優(yōu)選地包括測(cè)定在改變的環(huán)境條件下與不包含重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)該子代植物是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。在任一前述的優(yōu)選方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，在所述導(dǎo)入步驟中所述可再生的植物細(xì)胞優(yōu)選地包括愈傷組織細(xì)胞(優(yōu)選胚胎)、配子細(xì)胞、分生細(xì)胞或未成熟胚芽細(xì)胞?？稍偕闹参锛?xì)胞優(yōu)選來(lái)自近交系玉米植物。在任一上述的優(yōu)選方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，所述再生步驟優(yōu)選包括(i)在包含促進(jìn)胚發(fā)生的激素的培養(yǎng)基中培育所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞直至觀察到愈傷組織；(ii)將所述步驟(i)的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包含促進(jìn)組織機(jī)體形成的激素的第一培養(yǎng)基；以及(iii)在第二培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)步驟(ii)后的所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以允許嫩芽伸長(zhǎng)、根發(fā)育或這兩者同時(shí)發(fā)生。在任一前述的優(yōu)選方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，存在供選擇的替代方案用于將包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控序列上的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞。例如，可將調(diào)控序列(例如一種或多種增強(qiáng)子、優(yōu)選地作為轉(zhuǎn)位因子的部件)導(dǎo)入可再生的植物細(xì)胞中，然后篩選其中將所述調(diào)控序列可操作地連接至編碼本發(fā)明多肽的內(nèi)源基因的事件。將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體引入植物可通過(guò)任何合適的技術(shù)來(lái)進(jìn)行，這些技術(shù)包括但不限于引導(dǎo)DNA攝取、化學(xué)處理、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、感染、載體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、轟擊或農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。在任一上述的優(yōu)選方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，至少一種農(nóng)學(xué)特性?xún)?yōu)選選自綠度、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營(yíng)養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、抗?jié)承?、氮攝取、氮脅迫耐受性、根倒伏、莖倒伏、植株高度、穗長(zhǎng)、莖倒伏以及收獲指數(shù)。產(chǎn)量、綠度、生物量和根倒?fàn)钍怯绕鋬?yōu)選進(jìn)行改變的農(nóng)學(xué)特性(優(yōu)選增加)。在任一上述的優(yōu)選方法或本發(fā)明方法的任何其他實(shí)施方案中，在與對(duì)照植物比較時(shí)，所述植物優(yōu)選表現(xiàn)出至少一種與環(huán)境條件無(wú)關(guān)的農(nóng)學(xué)特性的改變。將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體引入植物可通過(guò)任何合適的技術(shù)來(lái)進(jìn)行，這些技術(shù)包括但不限于引導(dǎo)DNA攝取、化學(xué)處理、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、感染、載體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、轟擊或農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的技術(shù)如下文實(shí)施例所示，用于轉(zhuǎn)化玉米植物細(xì)胞和大豆植物細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物(主要通過(guò)利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens))以及獲得轉(zhuǎn)基因植物的其他優(yōu)選方法包括公開(kāi)的用于棉花的那些(美國(guó)專(zhuān)利5，004,863、美國(guó)專(zhuān)利5，159，135、美國(guó)專(zhuān)利5，518，908)；用于大豆的那些(美國(guó)專(zhuān)利5，569，834、美國(guó)專(zhuān)利5，416，011、McCabe等人，Bio/Technology6923(1988),Christou等人，PlantPhysiol.87=671674(1988))；用于蕓苔的那些(美國(guó)專(zhuān)利5，463，174)；用于花生的那些(Cheng等人，PlantCellRep.15653657(1996)，McKently等人，PlantCellR印.14:699703(1995))；用于番木瓜的那些；以及用于豌豆的那些(Grant等人，PlantCellRep.15254258，(1995))。用電穿孔、粒子轟擊和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物也已有報(bào)道并且作為優(yōu)選的方法包括例如在天門(mén)冬屬(asparagus)中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84=5354,(1987))；在大麥中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Wan和Lemaux,PlantPhysiol.104:37(1994))；在玉米中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Rhodes等人，Science240:204(1988)；Gordon-Kamm等人，PlantCell2:603618(1990)；Fromm等A,Bio/Technology8:833(1990)；Koziel等A,Bio/Technology11194,(1993)；Armstrong等人，CropScience35:550_557(1995))；在燕麥中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Somers等人，Bio/Technology10:1589(1992))；在鴨茅中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Horn等人，PlantCellRep.7=469(1988))；在水稻中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Toriyama等人，Theor.Appl.Genet.20534,(1986)；Part等人，PlantMol.Biol.3211351148，(1996)；Abedinia等人，Aust.J.PlantPhysiol.24133141(1997)；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76:835(1988)；Zhang等人，PlantCellRep.7:379，(1988)；Battraw和Hall,PlantSci.86:191202(1992)；Christou等人，Bio/Technology9:957(1991))；裸麥(DelaPena等人，Nature325:274(1987))；在甘蔗中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Bower和Birch，PlantJ.2=409(1992))；在高羊茅(tallfescue)中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Wang等人，Bio/TechnologylO=691(1992))和在小麥中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化和植物再生(Vasil等人，Bio/Technology10:667(1992)；美國(guó)專(zhuān)利5，631，152)。存在多種用于從植物組織再生植物的方法。再生的具體方法將取決于起始植物組織以及待再生的具體植物物種。從單植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或從多種經(jīng)轉(zhuǎn)化的外植體再生、發(fā)育和培育植物是本領(lǐng)域所熟知的(Weissbach禾口Weissbach(編輯)，載于MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,Inc.SanDiego,CA,(1988))。該再生和生長(zhǎng)方法通常包括如下步驟選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、培養(yǎng)這些單獨(dú)化的細(xì)胞通過(guò)胚發(fā)育的通常階段以及通過(guò)生根小植株階段。轉(zhuǎn)基因胚以及種子以類(lèi)似的方式再生。隨后將所得的轉(zhuǎn)基因的生根小苗種植在諸如土壤之類(lèi)的合適植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。含有編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的外來(lái)的外源性分離核酸片段的植物的發(fā)育或再生是本領(lǐng)域所熟知的。優(yōu)選地，將再生的植物進(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物?；蛘撸瑢⒌米栽偕参锏幕ǚ叟c農(nóng)學(xué)上重要的品系的產(chǎn)生種子的植株進(jìn)行雜交。相反，將來(lái)自這些重要品系的植物用于給再生植物授粉。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法培育含有所需多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。實(shí)施例本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明，其中份數(shù)和百分比是以重量計(jì)并且度數(shù)是攝氏度，除非另外說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，盡管這些實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明做出多種改變和修飾，以使其適用于多種用法和條件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。這些修改形式也旨在屬于所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。實(shí)施例1制備具有激活標(biāo)記基因的擬南芥種群構(gòu)建18.4kb的T-DNA基二元構(gòu)建體，pHSbarENDs(圖1；SEQIDN01；)包含四個(gè)來(lái)源于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的四個(gè)多聚增強(qiáng)子元件，對(duì)應(yīng)于序列-341至-64，如Odell等人(1985)Nature313:810_812所述。該構(gòu)建體也包含允許質(zhì)粒救援的載體序列(pUC9)、再動(dòng)員T-DNA的轉(zhuǎn)座子序列(Ds)、以及允許草胺磷選擇轉(zhuǎn)基因植物的bar基因。僅將從右邊界(RB)至左邊界(LB)包含的10.8kb片段轉(zhuǎn)移到寄主植物基因組中。因?yàn)樵鰪?qiáng)子元件位于靠近RB處，它們可誘導(dǎo)T-DNA整合后的基因組位點(diǎn)順式激活。將pHSbarENDs構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株C58中，在25°C下在LB中培養(yǎng)至0D6001.0。然后離心沉淀細(xì)胞，并重懸在相等體積的5%蔗糖/0.05%SilwetL-77(0SISpecialties,Inc)中。在早期抽薹時(shí)，生長(zhǎng)擬南芥生態(tài)型Col_0的土壤使用農(nóng)桿菌懸浮液進(jìn)行頂部灌溉。一周后，相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行頂部灌溉。然后將該植物的種子設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)。所得種子在土壤中播種，通過(guò)噴灑草胺磷(Finale;AgrEvo；BayerEnvironmentalScience)選擇轉(zhuǎn)基因幼苗。從大約35，000個(gè)單個(gè)草胺磷抗性植株中收集T2種子。培養(yǎng)T2植株并收集來(lái)自96個(gè)分離T2品系的相同體積的T3種子。這組成了360個(gè)亞群。農(nóng)桿菌菌株和整個(gè)植株的轉(zhuǎn)化如上所述進(jìn)行。選擇總計(jì)100，000個(gè)草胺磷抗性幼苗。分開(kāi)保存來(lái)自每個(gè)品系的T2種子。實(shí)施例2A(_制件氮爐)在與早期發(fā)育期間來(lái)自如實(shí)施例1所述的種群的對(duì)照幼苗進(jìn)行比較時(shí)，可分析在不限制氮條件下培養(yǎng)的具有激活標(biāo)記的擬南芥幼苗的根系構(gòu)造。來(lái)自每個(gè)96，000個(gè)分離T1激活標(biāo)記品系的十個(gè)T2種子可用氯氣進(jìn)行滅菌并種植在培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)皿包含以下培養(yǎng)基0.5xN-FreeHoagland，s，60mMKN03，0.蔗糖，ImMMES和l^Phytagel。通常將10個(gè)平板置于架子中。平板在4°C下保存三天以使種子分層，然后在22L光照和20L黑暗垂直保持11天。光周期為16h；8h黑暗，平均光照強(qiáng)度為lSOymol/m2/^。架子(通常每個(gè)裝有10個(gè)平板)在每個(gè)擱板中每日旋轉(zhuǎn)。在第14天，評(píng)估平板的幼苗狀態(tài)，拍攝整個(gè)平板的數(shù)字圖像并分析根面積。將平板隨機(jī)分成10個(gè)水平區(qū)域。在板上10個(gè)水平區(qū)域的每個(gè)區(qū)域中的根面積以總面積百分比表示。僅僅使用區(qū)域3至9的面積進(jìn)行品系根總面積計(jì)算?？墒褂肐C0RIA開(kāi)發(fā)的Rootbot圖像分析工具(專(zhuān)有)評(píng)估根面積。根總面積以mm2表示。期望具有增加的根生長(zhǎng)特性的品系位于根分布區(qū)域的上端。假定架子有最多兩個(gè)異常值，可使用滑動(dòng)窗方法評(píng)估給定架子的根區(qū)域的變化。包括生長(zhǎng)培養(yǎng)基、溫度、和濕度在內(nèi)的多個(gè)因素的環(huán)境變量可引起根生長(zhǎng)的顯著改變，尤其是在播種期間更是如此。因此根據(jù)播種日期和擱板來(lái)將所述品系分組以用于數(shù)據(jù)分析。然后通過(guò)平均根面積來(lái)揀選特定播種日期/擱板組中的架子。通過(guò)將表示架子巧的數(shù)據(jù)與來(lái)自下一個(gè)最低架子Ovi，以及下一個(gè)最高平均根面積，ri+1)的數(shù)據(jù)進(jìn)行合并來(lái)執(zhí)行滑動(dòng)窗根面積分布。然后使用Grubbs型方法(Barnett等人，OutliersinStatisticalData,JohnWiley&Sons，第3版(1994)分析組合分布的變量以鑒定ri中的異常值。將通過(guò)上文所述方法測(cè)定的具有顯著增加的根生長(zhǎng)的品系命名為Phase1hits。在相同分析條件下進(jìn)行Phase1hits的重復(fù)試樣再篩選。當(dāng)任一個(gè)或兩個(gè)Phase2重復(fù)試樣顯示與平均值的顯著差異時(shí)，認(rèn)為該品系是驗(yàn)證過(guò)的根構(gòu)造品系。在Phase2的至少一個(gè)平板中再次發(fā)現(xiàn)是異常值的那些品系經(jīng)過(guò)室內(nèi)進(jìn)行的Phase3篩選以驗(yàn)證Phase1和Phase2中獲得的結(jié)果。使用下文所述的Rootboot圖像分析(如上所述)和WinRHIZO驗(yàn)證Phase3的結(jié)果。在第一輪篩選中進(jìn)行相同方式的確認(rèn)。T2種子用50%家用漂白劑，0.01%tritonX-100溶液滅菌，并以10顆種子/平板的密度置于與第一輪篩選所述的相同平板培養(yǎng)基上。在4°C下保存平板三天以使種子分層，并在與首次實(shí)驗(yàn)相同的溫度和光周期下培養(yǎng)種子，光照強(qiáng)度為leOymol/tf/s。將平板垂直放入10平板架的八個(gè)中心位置，第一個(gè)和最后一個(gè)位置放空白平板。每隔一天旋轉(zhuǎn)架子和架子中的平板。每隔平板拍攝兩組照片。第一組在14-16天拍攝，此時(shí)大多數(shù)品系的初生根已經(jīng)到達(dá)平板底部，第二組照片在發(fā)育出更多側(cè)根兩天后拍攝。通常用后面40的一組照片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用軟件^WinRHIZO(RegentlnstrumentsInc)分析在垂直平板上生長(zhǎng)的這些幼苗的根生長(zhǎng)，該軟件是特別設(shè)計(jì)的一種進(jìn)行根測(cè)量的圖像分析系統(tǒng)。WinRHIZO利用像素對(duì)照來(lái)從較暗的背景辨別出根構(gòu)造。為了在不拍攝背景情況下鑒定的根的最大量，所述像素級(jí)別是150-170，并且使用濾光器移除長(zhǎng)度/寬度比率小于10.0的物體。進(jìn)行分析的平板上的面積為從植物葉片邊緣至距離平板底部約lcrn處。使用完全相同的WinRHIZG設(shè)置和分析面積分析一批的所有平板。WinlimZC)給出的一個(gè)平板的總根長(zhǎng)度得分除以已經(jīng)萌發(fā)并沿平板生長(zhǎng)一半的植物數(shù)目。每個(gè)品系培養(yǎng)三個(gè)平板，取它們的得分均值。然后將該平均值與同時(shí)培養(yǎng)的包含野生型種子的三個(gè)平板的平均值比較。然后使用通過(guò)與野生型相比具有更高根生長(zhǎng)數(shù)值進(jìn)行再確認(rèn)的擬南芥激活標(biāo)記品系，用于分子鑒定側(cè)接T-DNA插入序列的DNA。實(shí)施例2B在突變種群中鑒定具有改變的根表型的突變品系(氮限制條件)可使用兩步篩選程序，該程序包括(1)用垂直平板檢測(cè)分析法鑒定改變的根生長(zhǎng)表型；(2)在拯救的突變體品系中確認(rèn)抗除草劑性和根表型；初次篩選基于垂直平板，該平板包含無(wú)氮的Hoagland鹽，0.3%蔗糖和ImMKN03。該培養(yǎng)基也包含0.8%至1.0%PhytaGel作膠凝劑。具有1.0%Phytagel的培養(yǎng)基有時(shí)難以灌注，因?yàn)樗萄杆伲欢陀?.8%時(shí)當(dāng)垂直放置時(shí)培養(yǎng)基將滑出平板。來(lái)自激活標(biāo)記種群的突變體，其中100個(gè)單個(gè)品系的集合可用于總計(jì)36000個(gè)品系的篩選。在每個(gè)平板上，種植12個(gè)突變體和2個(gè)野生型Columbia種子。平板置于具有26°C恒溫的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)室為16小時(shí)-日循環(huán)，平板頂部的平均光照強(qiáng)度為110i!E/m2S。這些平板在2.5周期限內(nèi)拍照3-4次。當(dāng)觀察到清楚的根表型時(shí)拯救單個(gè)幼苗。拯救的幼苗在生長(zhǎng)室(24°C，每日16小時(shí)，250至300iiE/m2s)中生長(zhǎng)至成熟以采集種子。就次級(jí)篩選而言，將來(lái)自在初次篩選中鑒定的推定hits的種子播種于包含與上文相同的培養(yǎng)基(加上6mg/L雙丙氨磷)的平板上。野生型Columbia種子在相同時(shí)間、但無(wú)雙丙氨磷的相同培養(yǎng)基上播種。每個(gè)平板具有10個(gè)種子。每個(gè)突變體品系有3個(gè)平板，而野生型Columbia有2個(gè)平板作為重復(fù)試樣。這些平板置于培養(yǎng)室中，生長(zhǎng)條件與上文所述相同。剔除那些認(rèn)為是假陽(yáng)性的不具有抗除草劑性或無(wú)明顯的根表型的品系。保存次級(jí)篩選驗(yàn)證的品系用于進(jìn)一步研究。實(shí)施例3鑒定激活標(biāo)記基因使用下述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)程序中的一個(gè)或兩個(gè)鑒定側(cè)接導(dǎo)致根構(gòu)造改變的T-DNA插入序列的基因(1)熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR(TAIL)PCR(Liu等人，(1995)，PlantJ.8:457_63)；以及(2)SAIFFPCR(Siebert等人，(1995)NucleicAcidsRes.231087-1088)。至于復(fù)雜的多聚T-DNA插入序列，TAILPCR和SAIFFPCR可能都不足以鑒定候選基因。在這些情況下，可使用包括反式PCR、質(zhì)粒拯救和/或基因組文庫(kù)構(gòu)建在內(nèi)的其他程序。成功的結(jié)果是其中單個(gè)TAIL或SAIFFPCR片段包含T-DNA邊界序列和擬南芥基因組序列。一旦獲取側(cè)接T-DNA插入序列的基因組序列標(biāo)記，通過(guò)與公開(kāi)可用的擬南芥基因組的序列比對(duì)來(lái)鑒定候選基因。具體地講，最靠近35S增強(qiáng)子元件/T-DNARB的注釋基因是激活的基因的候選基因。為了驗(yàn)證鑒定的基因真的靠近T-DNA并排除TAIL/SAIFF片段是嵌合偽克隆的可能性，用一個(gè)T-DNA中的寡核苷酸和一個(gè)候選基因特異性的寡核苷酸進(jìn)行對(duì)基因組DNA的診斷PCR。將提供PCR產(chǎn)品的基因組DNA樣本理解為表示T-DNA插入序列。此分析也驗(yàn)證了其中一種以上的插入事件發(fā)生在相同品系中的情況，例如，在TAIL和/或SAIFFPCR分析中鑒定是否有多個(gè)不同基因組片段。實(shí)施例4鑒定激活標(biāo)記ndk基因通過(guò)如實(shí)施例2B所述的篩選程序，以及隨后經(jīng)過(guò)如實(shí)施例2A所述的階段3(室內(nèi))篩選獲取ndk基因。如實(shí)施例3所述進(jìn)行激活標(biāo)記基因的鑒定。進(jìn)一步分析顯示具有改變的根構(gòu)造的一個(gè)品系(1至6)。提取來(lái)自品系的DNA，使用T-DNA左邊界內(nèi)的引物通過(guò)連接介導(dǎo)PCR(Siebert等人，(1995)NucleicAcidsRes.231087-1088)建立T-DNA插入序列。一旦獲取側(cè)接T-DNA插入序列的基因組序列標(biāo)記，通過(guò)與完全擬南芥基因組的序列比對(duì)鑒定候選基因。將其中一個(gè)鑒定的插入位點(diǎn)鑒定為嵌合插入；左邊界的T-DNA序列經(jīng)測(cè)定位于T-DNA插入序列的兩端。這仍然是可能的位于靠近T-DNA右邊界的增強(qiáng)子元件足夠靠近以對(duì)附近的候選基因產(chǎn)生效應(yīng)。在這種情況下，假定右邊界位置位于插入位點(diǎn)，并將側(cè)接插入位點(diǎn)的兩個(gè)基因選作候選基因。最靠近嵌合插入序列的35S增強(qiáng)子的基因是AT4G23900(SEQIDNO50；NCBIGIN011990430；擬南芥核苷二磷酸激酶4)，它編碼NDK4蛋白(SEQIDN051)，本文稱(chēng)為核苷二磷酸激酶或NDK。實(shí)施例5A驗(yàn)證候選擬南芥基因(AT4G23900)經(jīng)由轉(zhuǎn)化到擬南芥中增強(qiáng)植物根構(gòu)造的能力可將候選基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中并在35S啟動(dòng)子作用下過(guò)表達(dá)。如果在轉(zhuǎn)基因品系中觀察到與親本激活標(biāo)記品系相同或相似的表型，則將候選基因認(rèn)為是擬南芥中驗(yàn)證過(guò)的“前導(dǎo)基因”?？芍苯訙y(cè)試擬南芥AT4G23900基因促進(jìn)擬南芥中的根構(gòu)造的能力。擬南芥AT4G23900cDNA用寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，寡核苷酸導(dǎo)入attBl(SEQIDNO51)序列，其上游為ATG起始密碼子的共有起始序列(CAACA)和AT4G23900cDNA(SEQIDN0:50的核苷酸51-764(終止))蛋白編碼區(qū)的前23個(gè)核苷酸，以及attB2(SEQIDN0:53)序列和包括所述cDNA終止密碼子的蛋白編碼區(qū)的最后21個(gè)核苷酸。使用InvitrogenGateway技術(shù)，用pD0NR/Zeo(Invitrogen,圖2；SEQIDNO2)進(jìn)行MultiSiteGatewaybp重組反應(yīng)。這種方法將細(xì)菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)從pDONRTM/Zeo移除并定向地克隆了該在旁側(cè)具有attBl(SEQIDNO52)和attB2(SEQIDNO53)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物而得到入門(mén)克隆PHP28731。用緊接InvitrogenGatewayC1轉(zhuǎn)化插入序列上游的1.3-kb35S啟動(dòng)子構(gòu)建稱(chēng)為pBC-yellow(圖4，SEQIDNO4)的16.8_kbT-DNA基的二元載體，所述插入序列包含側(cè)接attRl和attR2序列的ccdB基因和氯霉素抗性基因(CAM)。該載體也包含在Rd29a啟動(dòng)子控制下的YFP標(biāo)記用于選擇轉(zhuǎn)化過(guò)的種子。使用InvitrogenGateway技術(shù)，對(duì)包含定向克隆PCR產(chǎn)物和pBC-yellow的入門(mén)克隆進(jìn)行MultiSiteGatewayLR重組反應(yīng)。這使得能夠迅速地和定向地克隆pBC-yellow中在35S啟動(dòng)子后的AT4G23900基因。使用如實(shí)施例1所述的相同農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化程序?qū)?5S-AT4G23900基因構(gòu)建體導(dǎo)入野生型擬南芥生態(tài)型Col-0中。通過(guò)存在的熒光YFP標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)基因T1種子。按照如實(shí)施例2A所述的程序?qū)晒夥N子進(jìn)行根構(gòu)造檢測(cè)分析。每個(gè)構(gòu)建體使用6個(gè)平板對(duì)轉(zhuǎn)基因T1種子進(jìn)行再篩選。包含從熒光種子中分選出的未轉(zhuǎn)化的Columbia種子的兩個(gè)平板(每個(gè)架子)作為對(duì)照。每個(gè)構(gòu)建體有六個(gè)平板進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并檢測(cè)平板上生長(zhǎng)的植物數(shù)量和它們的平均WinRHIZO得分之間的趨勢(shì)。WinRHIZO得分進(jìn)行趨勢(shì)歸一化處理，對(duì)應(yīng)于構(gòu)建體的根得分除以野生型根得分。實(shí)施例5B在氮限制條件下篩詵候詵基因也可篩選如上文實(shí)施例5A所述通過(guò)存在的熒光標(biāo)記YFP選擇的轉(zhuǎn)基因T1種子在氮限制條件下生長(zhǎng)的抗性。為此目的，32個(gè)轉(zhuǎn)基因個(gè)體可在一個(gè)有0.4mM謂03或601111KN03的平板上緊鄰著32個(gè)野生型個(gè)體生長(zhǎng)。如果一個(gè)品系顯示與對(duì)照的統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異，可認(rèn)為該品系是驗(yàn)證過(guò)的氮缺乏抗性品系。在掩蔽該平板圖像以移除背景顏色后，每個(gè)個(gè)體收集兩個(gè)不同的測(cè)量數(shù)據(jù)總羅賽塔面積和進(jìn)入綠色區(qū)的顏色百分比。使用色調(diào)、飽和度和強(qiáng)度數(shù)據(jù)(HIS)，綠色區(qū)由色調(diào)50至66組成?？偭_賽塔面積用作植物生物量的量度，而綠色區(qū)通過(guò)劑量響應(yīng)研究已經(jīng)顯示指示氮同化作用。實(shí)施例5C駘證候詵擬南芥某因(AT4G23900)經(jīng)由轉(zhuǎn)仆,講入擬南芥后改善棺物氮為丨用率的能力如實(shí)施例5B所述篩選能夠在氮限制條件下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因種子。在第10、11、12和13天評(píng)估植物。與野生型相比，表達(dá)擬南芥候選基因(AT4G23900)的轉(zhuǎn)基因個(gè)體在氮限制條件下得分更佳，然而，當(dāng)在包含有限濃度的氮(0.4mMKNO3)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，與野生型植物相比，它們不被驗(yàn)證為氮缺乏抗性植物。在不限制氮條件下(60mMKN03)未觀察到轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物之間的差異。實(shí)施例5Df帝誅鑒定H有的硝H鹽攝耳又的p°P系就每個(gè)過(guò)表達(dá)品系而言，將十二個(gè)T2植株播種在96孔微滴定板上，所述微滴定板包含2mMMgS04,0.5mMKH2P04,ImMCaCl2,2.5mMKC1,0.15mMSprint330,0.06mMFeS04,1uMMnCl24H20,1uMZnS047H20,3uMH3B03,0.1uMNaMo04,0.1uMCuS045H20,0.8mM硝酸鉀，0.蔗糖，ImMMES，200iiM溴酚紅和0.40%PhytagelTM(pH測(cè)定培養(yǎng)基)。培養(yǎng)基PH使得溴酚呈紅色，pH指示染料是黃色的。將四個(gè)品系種植于每個(gè)平板中，每個(gè)平板上包含12個(gè)野生型個(gè)體和來(lái)自某一已43經(jīng)顯示具有改善的硝酸鹽攝取(陽(yáng)性對(duì)照)的品系的12個(gè)個(gè)體，在每個(gè)96孔微滴定板上總計(jì)有72個(gè)個(gè)體可使用基于網(wǎng)絡(luò)的隨機(jī)序列發(fā)生器測(cè)定每個(gè)平板上的品系順序。不將種子種植在96孔微滴定板上的RowA或RowH中。每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用四個(gè)平板，使得每個(gè)品系分析最多48株植物。在暗處、4°C條件下保持平板三天以使種子分層，然后在22°C，光照和黑暗交替條件下水平放置六天。光周期為16小時(shí)光照；8小時(shí)黑暗，平均光照強(qiáng)度為200mmol/m2/S。旋轉(zhuǎn)并振動(dòng)每個(gè)架子中的平板。在第八或第九天(生長(zhǎng)五天或六天)，通過(guò)記錄培養(yǎng)基顏色為粉紅色、桃色、黃色或無(wú)發(fā)芽來(lái)評(píng)估幼苗狀態(tài)。然后移除每孔上的植物和/或種子。將每個(gè)培養(yǎng)基塊狀物轉(zhuǎn)移到1.2mL微滴定管中，并置于96孔深微滴定板中的相應(yīng)孔中。將包含2yM熒光素的等體積水加入每個(gè)1.2mL微滴定管中。用土壤覆蓋平板并用液體循環(huán)高壓滅菌。將每個(gè)管充分混合，從每個(gè)管中移除等分試樣并分析培養(yǎng)基中保留的硝酸鹽的量。如果t檢驗(yàn)顯示某個(gè)品系與野生型對(duì)照植物具有顯著差異(p<0.05)，則可認(rèn)為所述品系是驗(yàn)證過(guò)的具有改善的硝酸鹽攝取品系。實(shí)施例5E駘證句,含候詵擬南芥某因(AT4G23900)的轉(zhuǎn)某因品系氮,攝取J曾加如實(shí)施例5D所述篩選氮攝取增加的轉(zhuǎn)基因種子。與不過(guò)表達(dá)擬南芥候選基因的野生型植物相比，過(guò)表達(dá)擬南芥候選基因(AT4G23900)的轉(zhuǎn)基因個(gè)體經(jīng)驗(yàn)證為具有改善的硝酸鹽攝取品系。實(shí)施例6cDNA文庫(kù)的組成；cDNA克隆的分離和測(cè)序制備提供來(lái)自Cannaedulis(美人蕉)、Momordicacharantia(苦瓜)、Brassica(芥辣)>Cyamopsistetragonoloba瓜耳f)、Zeamays(玉米)>0ryzasativa(水稻)、Glycinemax(大豆)、Helianthusannuus(向日葵)和Triticumaestivum(小麥)的不同組織的mRNA的cDNA文庫(kù)。下面描述了對(duì)該文庫(kù)的特征。表2來(lái)自美人蕉、苦瓜、芥辣、瓜耳、玉米、水稻、大豆、向日葵和小麥的cDNA文庫(kù)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>cDNA文庫(kù)可通過(guò)許多可用的方法中的任一種制備。例如，通過(guò)首先根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)(StratageneCloningSystems,LaJolla,CA)制備Uni_ZAPXR載體中的cDNA文庫(kù)，可將cDNA引入質(zhì)粒載體中。根據(jù)Stratagene提供的說(shuō)明書(shū)，將Uni-ZAPXR文庫(kù)轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒文庫(kù)。轉(zhuǎn)換后，cDNA插入序列將會(huì)包含在質(zhì)粒載體pBluescript中。此外，可用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)將cDNA直接引入預(yù)切的BluescriptIISK(+)載體(Stratagene)中，然后根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)(GIBCOBRLProducts)將其轉(zhuǎn)染進(jìn)DH10B細(xì)胞中。一旦cDNA插入序列處于質(zhì)粒載體中，從隨機(jī)選取的含重組pBluescript質(zhì)粒的細(xì)菌菌落制備質(zhì)粒DNA，或者用對(duì)插入的cDNA序列旁側(cè)的載體序列特異性的引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增插入的cDNA序列。將擴(kuò)增的DNA插入序列或質(zhì)粒DNA在引物標(biāo)記法測(cè)序反應(yīng)(dye-primersequencingreaction)中進(jìn)行測(cè)序，以產(chǎn)生部分cDNA序列(表達(dá)序列標(biāo)記或"EST”；參見(jiàn)Adams等人，1991，Science252:1651-1656)。用PerkinElmerModel377熒光測(cè)序儀分析所得的EST。用改進(jìn)的轉(zhuǎn)座規(guī)程產(chǎn)生全長(zhǎng)插入序列(FIS)數(shù)據(jù)。從歸檔的甘油原種作為單一菌落回收確定了FIS的克隆，并通過(guò)堿性裂解分離質(zhì)粒DNA。將分離的DNA模板在基于PCR的測(cè)序反應(yīng)中與載體引物M13正向和反向寡核苷酸反應(yīng)并上樣至自動(dòng)化的測(cè)序儀上。通過(guò)與對(duì)其進(jìn)行FIS查詢(xún)的初始EST序列進(jìn)行序列比對(duì)來(lái)確認(rèn)克隆鑒定。將確認(rèn)的模板通過(guò)基于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Tyl轉(zhuǎn)座因子(Devine和Boeke，1994，NucleicAcidsRes.22:3765_3772)的PrimerIsland轉(zhuǎn)座試劑盒(PEAppliedBiosystems,FosterCity,CA)進(jìn)行轉(zhuǎn)座。該體外轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在整個(gè)一組大DNA分子中隨機(jī)地放入獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)。隨后將轉(zhuǎn)座的DNA用于通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化DH10B電感受態(tài)細(xì)胞(GibcoBRL/LifeTechnologies,Rockville,MD)。轉(zhuǎn)座因子含有另外的可選標(biāo)記(稱(chēng)為DHFR；Fling禾口Richards,1983，NucleicAcidsRes.11:5147_5158)，使得能在瓊脂平板上僅雙重篩選含有整合的轉(zhuǎn)座子的那些亞克隆。從每次轉(zhuǎn)座反應(yīng)隨機(jī)地選擇多個(gè)亞克隆，通過(guò)堿性裂解制備質(zhì)粒DNA，并用對(duì)轉(zhuǎn)座子內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)特異性的獨(dú)特引物從轉(zhuǎn)座事件位點(diǎn)向夕卜進(jìn)行測(cè)序(ABIPrismdye-terminatorReadyReactionmix)。收集序列數(shù)據(jù)(ABIPrismCollections)并用Phred和Phrap(Ewing，等人，1998，GenomeRes.8:175—185；Ewing禾口Green，1998，GenomeRes.8186-194)進(jìn)對(duì)亍裝配。Phred是一種公用軟件程序，該程序再次讀取ABI序列數(shù)據(jù)，再次調(diào)出(recall)堿基，賦質(zhì)量值，并將堿基序列(basecall)和質(zhì)量值寫(xiě)入可編輯的輸出文件中。Phrap序列組裝程序使用這些質(zhì)量值來(lái)增加組裝的序列重疊群的準(zhǔn)確度。通過(guò)Consed序列編輯器(Gordon等人，1998，GenomeRes.8195-202)檢查裝配序列。在一些克隆中，cDNA片段對(duì)應(yīng)基因的3’-端的一部分并且不會(huì)涵蓋整個(gè)開(kāi)放閱讀框。為了獲得上游信息，使用兩種不同規(guī)程中的一者。這兩種方法中的第一種方法導(dǎo)致產(chǎn)生含有所需基因序列的部分的DNA片段，而第二種方法導(dǎo)致產(chǎn)生含有整個(gè)開(kāi)放閱讀框的片段。這兩種方法均使用兩輪PCR擴(kuò)增以從一個(gè)或多個(gè)文庫(kù)獲得片段。有時(shí)基于以前的知識(shí)(特定的基因應(yīng)該存在于某些組織中)選擇文庫(kù)，有時(shí)則進(jìn)行隨機(jī)地選擇。獲得相同基因的反應(yīng)可平行地在若干文庫(kù)中進(jìn)行，或者在文庫(kù)池中進(jìn)行。文庫(kù)池通常用3至5個(gè)不同的文庫(kù)制備并且使其歸一化而成為一致的稀釋度。在第一輪擴(kuò)增中，兩種方法均使用載體特異性的(正向)引物，同時(shí)還使用基因特異性的(反向)引物，該正向引物對(duì)應(yīng)位于克隆5’_端處的載體的一部分。第一種方法使用與已知基因序列的一部分互補(bǔ)的序列，而第二種方法使用與3’-非翻譯區(qū)(也稱(chēng)為UTR)的一部分互補(bǔ)的基因特異性引物。在第二輪擴(kuò)增中，兩種方法均使用套式引物組。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，用市售試劑盒將所得DNA片段連接進(jìn)pBluescript載體中。該試劑盒選自可得自包括Invitrogen(Carlsbad，CA)、PromegaBiotech(Madison，WI)和Gibco_BRL(Gaithersburg，MD)在內(nèi)的一些供應(yīng)商的許多試劑盒。如上所述，將質(zhì)粒DNA通過(guò)堿性裂解方法分離并進(jìn)行測(cè)序和用Phred/Phrap進(jìn)行裝配。實(shí)施例7cDNA克隆的鑒定編碼NDK樣多肽的cDNA克隆通過(guò)這樣鑒定進(jìn)行BLAST(基本的局部比對(duì)搜索工具)；Altschul等人，1993，J.Mol.Biol.215403-410；還可參見(jiàn)國(guó)立衛(wèi)生研究院國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館的國(guó)家生物技術(shù)信息中心的萬(wàn)維網(wǎng)址上對(duì)BLAST算法的解釋)，尋找與BLAST"nr"數(shù)據(jù)庫(kù)中所包含序列(包括所有非冗余GenBankCDS翻譯序列、源自3-維結(jié)構(gòu)Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行(ProteinDataBank)、SWISS_PR0T蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的最新的主要版本、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)的序列)的相似性。采用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析如實(shí)施例6中獲得的cDNA序列與包含在“nr”數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有可公開(kāi)獲得的DNA序列的相似性。在所有的閱讀框中翻譯DNA并用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States，1993，Nat.Genet.3266-272)比較與“nr”數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的所有可公開(kāi)獲得的蛋白質(zhì)序列的相似性。為方便起見(jiàn)，通過(guò)BLAST計(jì)算僅僅偶然觀察到cDNA序列與所搜索的數(shù)據(jù)庫(kù)中所包含序列的匹配的P值(概率)在本文報(bào)導(dǎo)為“pLog”值，它代表所報(bào)導(dǎo)的P值的負(fù)對(duì)數(shù)。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST的“匹配”代表同源蛋白的可能性就越大。將受分析的EST與上述Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。通過(guò)使用BLASTn算法(Altschul等人，1997，NucleicAcidsRes.25:3389_3402.)對(duì)杜邦專(zhuān)利數(shù)據(jù)庫(kù)比較具有序列同源共有區(qū)域或重疊區(qū)域的核苷酸序列，可找到含更5端或3端序列的EST。在兩個(gè)或更多個(gè)核酸片段之間存在共有或重疊序列時(shí)，該序列可裝配成單一的連續(xù)核苷酸序列，從而使最初的片段在5或3初始方向上延伸。一旦確定了最5的EST后，可如實(shí)施例6中所述，通過(guò)全長(zhǎng)插入序列來(lái)確定其完整的序列。可用tBLASTn算法，通過(guò)將已知基因(來(lái)自專(zhuān)有來(lái)源或公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)的已知基因)的氨基酸序列對(duì)EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，可找到屬于不同物種的同源基因。tBLASTn算法對(duì)所有6個(gè)閱讀框都翻譯了的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行氨基酸查詢(xún)的搜索。該搜索允許不同物種之間的核苷酸密碼子使用的差異，并且允許密碼子簡(jiǎn)并。實(shí)施例8表征編碼NDK樣多肽的cDNA克隆使用表1列出的EST序列進(jìn)行的BLASTX揭示cDNA編碼的多肽與表3所示的來(lái)自水稻(GINo.115465831和125595441，分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:44和49)、擬南芥a(GINo.15237018，對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:46)、豌豆(GINo.6435320，對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:45)、葡萄藤(GINo.147864944，對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:47)、和菥蓂(GINo.62870979，對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:48)的NDK樣多肽的相似性。表3顯示的是每個(gè)EST(“EST”)、包含指示cDNA克隆(“FIS”)的整個(gè)cDNA插入序列、兩個(gè)或更多個(gè)EST裝配的重疊群序列、FIS或PCR序列(“重疊群”)或編碼來(lái)源于FIS或重疊群(“CGS”)的整個(gè)和功能蛋白的序列的BLAST結(jié)果M3編碼NDK樣多肽同源物的多肽序列的BLAST結(jié)果和同一性百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>圖15A至15K顯示以下全長(zhǎng)氨基酸序列的多重比對(duì)SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、和37，以及SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和51圖16顯示圖15A至15K中顯示的每個(gè)序列對(duì)的序列同一性百分比和趨異值。用LASERGENE生物信息計(jì)算包(DNASTARInc.，Madison,WI)的Megalign程序進(jìn)行序列比對(duì)和同一性百分比計(jì)算。用帶默認(rèn)參數(shù)(空位罰分=10，空位長(zhǎng)度罰分=10)的Clustal比對(duì)方法(Higgins和Sharp,1989，CABI0S.5:151_153)進(jìn)行序列的多重比對(duì)。使用Clustal方法的成對(duì)比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE1，空位罰分=3，窗口=5，DIAGONALSSAVED=5。序列比對(duì)和BLAST打分以及概率顯示包含本發(fā)明cDNA克隆的核酸片段編碼NDK樣多肽。M4編碼與NDK和NDK樣多flt同源的多flt的序歹丨丨的BLAST結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>實(shí)施例9制各含有擬南芥前導(dǎo)某因(AT4G23900)的同勿的棺物表汰裁體可使用諸如BLAST(基本的局部比對(duì)搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)；Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403_410，1993；也參見(jiàn)美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(NationalLibraryofMedicine)的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的萬(wàn)維網(wǎng)網(wǎng)址上對(duì)BLAST算法的解釋)之類(lèi)的序列比較算法，鑒定與前導(dǎo)ndk基因同源的序列。同源NDK樣序列，如實(shí)施例8所述的序列，可通過(guò)任一種以下方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。方法1(基于RNA的方法)如果ndk同源物的蛋白編碼區(qū)域的5’和3’序列信息是可用的，能如實(shí)施例5A所述設(shè)計(jì)基因特異性引物?？蓪T-PCR用于植物RNA來(lái)獲得含有RUMl蛋白編碼區(qū)的核酸片段，該ndk蛋白編碼區(qū)旁側(cè)為attBl(SEQIDNO52)和attB2(SEQIDNO53)序列。引物可含有起始密碼子上游的共有Kozak序列(CAACA)。方法2(基于DNA的方法)作為另外一種選擇，如果編碼NDK多肽同源物的基因的cDNA克隆是可用的，可以PCR擴(kuò)增完整cDNA插入序列(含有5'和3'非編碼區(qū))。可設(shè)計(jì)正向引物和反向引物，使它們分別或者含有attBl序列和在該cDNA插入序列前面的載體特異性序列或者含有attB2序列和在該cDNA插入序列后面的載體特異性序列。對(duì)于克隆進(jìn)載體pBluescriptSK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062(SEQIDNO54)和反向引物VC063(SEQIDNO:55)。方法1和方法2可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的步驟進(jìn)行修改。例如，方法1的引物可含有限制性酶切位點(diǎn)而不是attBl和attB2位點(diǎn)，用于后來(lái)將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)含有attBl和attB2位點(diǎn)的載體內(nèi)。另外，方法2可涉及從cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因組DNA擴(kuò)增?？衫胋p重組反應(yīng)將通過(guò)任一種上述方法獲得的PCR產(chǎn)物與Gateway供體載體(例如pD0NR/Zeo(Invitrogen,圖2；SEQIDNO2)或pD0NR221(Invitrogen,圖3;SEQIDNO3)組合。這種方法將細(xì)菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)從PD0NRTM221移除并定向地克隆了該在旁側(cè)具有attBl和attB2位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物而得到入門(mén)克隆(entryclone)0使用InvitrogenGatewayClonase技術(shù)，然后能將來(lái)自入門(mén)克隆的同源NDK樣基因轉(zhuǎn)移到合適的目的載體中以獲得植物表達(dá)載體，所述載體用于擬南芥、玉米和大豆，如pBC-Yellow(圖4；SEQIDNO4)、PHP27840(圖5；SEQIDNO5)或PHP23236(圖6；SEQIDNO6)，以獲取植物表達(dá)載體，分別用于擬南芥、大豆和玉米。作為另外一種選擇，可進(jìn)行多個(gè)入門(mén)克隆和合適的目的載體之間的MultiSiteGatewayLR重組反應(yīng)以產(chǎn)生表達(dá)載體。該程序的一個(gè)實(shí)例在實(shí)施例14A中有所描述，該實(shí)施例描述了用于轉(zhuǎn)化玉米品系的玉米表達(dá)載體的構(gòu)建。實(shí)施例10_3]臓耐_赫能細(xì)力細(xì)原輪組百.表汰裁■■擁為了檢查所得表型，可將大豆植株轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)驗(yàn)證過(guò)的擬南芥(Arabidopsis)基因(AT4G23900)和來(lái)自不同物種的對(duì)應(yīng)同源物。可將實(shí)施例5A和9中所述的入門(mén)克隆用于將每個(gè)基因定向克隆進(jìn)PHP27840載體(圖5，SEQIDNO5)中，使得該基因的表達(dá)處于SCPl啟動(dòng)子的控制下。然后可用包含編碼本多肽的序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大豆胚。為了誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，可將子葉(長(zhǎng)度為3_5mm，從大豆品種A2872的表面滅菌的未成熟種子解剖出來(lái))于26°C在光下或黑暗下培養(yǎng)6-10周。然后切取體細(xì)胞胚(其產(chǎn)生次生胚)并將其置于合適的液體培養(yǎng)基內(nèi)。在重復(fù)選擇增殖為早期球形階段胚的體細(xì)胞胚的簇后，按下面的描述保持該懸浮液。可將大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物在26°C下在搖床(150rpm)上的35mL液體培養(yǎng)基中保持，熒光光照采用168小時(shí)(白天/黑夜)的時(shí)間表。通過(guò)將大約35mg組織移植進(jìn)35ml液體培養(yǎng)基中，每?jī)芍軐⑴囵B(yǎng)物進(jìn)行傳代培養(yǎng)。然后可通過(guò)基因槍轟擊方法(Klein等人，Nature(London)327=70-73,1987；美國(guó)專(zhuān)利4，945，050)轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。杜邦公司的BiolistiCTMPDS1000/HE儀器(氦氣改進(jìn)型)可用于這些轉(zhuǎn)化?？捎糜趲椭蠖罐D(zhuǎn)化的可選標(biāo)記基因是由來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(Odell等人，Nature313:810_812，1985)、來(lái)自質(zhì)粒pJR225(來(lái)自大腸桿菌；Gritz等人，Gene25:179_188，1983)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因以及胭脂堿合成酶基因的3'區(qū)構(gòu)成的嵌合基因，該胭脂堿合成酶基因來(lái)自根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA?？捎糜趲椭蠖罐D(zhuǎn)化的另一種可選標(biāo)記基因是來(lái)自大豆或擬南芥屬的除草劑抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成中的第一共用酶。已經(jīng)鑒定出ALS中的突變導(dǎo)致對(duì)三類(lèi)ALS抑制劑中的某些或全部具有抗性(美國(guó)專(zhuān)利5，013，659；其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文)。除草劑抗性ALS基因的表達(dá)可以處于SAM合成酶啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US-2003-0226166-A1；其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文)的控制下。將如下物質(zhì)(依次)加入到50yL60mg/mL的Ιμπι金顆粒懸浮液中5yL0嫩(1“8/^0、2(^1^亞精胺(0.說(shuō))^P50μLCaCl2(2.5Μ)然后攪拌該顆粒制備物三分鐘，在微量離心機(jī)(microfuge)中離心10秒并移除上清液。然后將DNA包覆的顆粒在400μL70%乙醇中洗滌一次并再懸浮于40μL無(wú)水乙醇中。可將DNA/顆粒懸浮液用超聲波處理三次，每次一秒鐘。然后將5μL該DNA-包覆的金顆粒裝載至每個(gè)宏載體盤(pán)上。將大約300-400mg兩周大的懸浮培養(yǎng)物置于60X15mm的空培養(yǎng)皿中并用吸管將殘留的液體從組織移除。對(duì)于每次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，大約5-10板的組織受到正常轟擊。膜破裂壓力設(shè)定為IlOOpsi并將腔室抽成28英寸汞柱的真空。將組織置于離阻擋網(wǎng)大約3.5英寸的地方并轟擊三次。轟擊后，可將組織分成兩份并放回液體培養(yǎng)基中，如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。轟擊后五至七天，用新鮮培養(yǎng)基更換該液體培養(yǎng)基，并在轟擊后七至十二天，用含有50mg/mL潮霉素的新鮮培養(yǎng)基更換。可每周更換這種選擇培養(yǎng)基。轟擊后七至八周，可觀察到綠色的轉(zhuǎn)化組織從未轉(zhuǎn)化的壞死的胚芽發(fā)生簇長(zhǎng)出來(lái)。移出分離的綠色組織并將其移植進(jìn)單獨(dú)的燒瓶中以產(chǎn)生新的、無(wú)性繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物?？蓪⒚恳恍缕废诞?dāng)成是獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。然后可將這些懸浮培養(yǎng)物作為未成熟胚進(jìn)行傳代培養(yǎng)和維持，或者通過(guò)使單獨(dú)體細(xì)胞胚成熟并萌發(fā)而再生成整株植株。能通過(guò)在土壤中培養(yǎng)植物并在用winRHIZ；。分析總根質(zhì)量前洗滌根部來(lái)測(cè)量大豆增大的根構(gòu)造。然后可分析用驗(yàn)證過(guò)的基因轉(zhuǎn)化大豆植株以研究相對(duì)于對(duì)照或參照植株的農(nóng)學(xué)特性。例如，在多種環(huán)境條件(如氮限制條件、干旱等)下的氮利用效率、產(chǎn)量增強(qiáng)和/或穩(wěn)定性。實(shí)施例11立子轟擊用驗(yàn)i!^寸白射以南芥前導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化玉米為了檢查所得表型，可將大豆植株轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因或來(lái)自不同物種的對(duì)應(yīng)同源物。可將實(shí)施例5A中所述的Gateway入門(mén)克隆用于將每種基因定向克隆進(jìn)玉米轉(zhuǎn)化載體中。玉米基因的表達(dá)可以處于組成型啟動(dòng)子的控制下，例如玉米泛素啟動(dòng)子(Christensen等人，PlantMol.Biol.12:619_632，1989，以及Christensen等人，PlantMol.Biol.18675-689,1992)。然后可通過(guò)下面的方法將上述重組DNA構(gòu)建體引入玉米細(xì)胞中。可從源于近交玉米系H99和LH132雜交的發(fā)育中的穎果切取未成熟的玉米胚。在授粉后10至11天分離胚，這時(shí)它們長(zhǎng)為1.0至1.5mm。然后將胚以軸線側(cè)朝下放置并與瓊脂糖硬化的N6培養(yǎng)基(Chu等人，Sci.Sin.Peking18=659-668,1975)接觸。將胚在27°C下保持在黑暗中。從這些未成熟胚的胚鱗增生出易脆的胚發(fā)生愈傷組織，該愈傷組織由未分化的細(xì)胞塊構(gòu)成，在胚柄結(jié)構(gòu)上長(zhǎng)有體細(xì)胞原胚狀體和胚狀體?？蓪脑撛庵搀w分離的胚發(fā)生愈傷組織在N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并每?jī)芍寥茉谶@種培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)?？蓪①|(zhì)粒p35S/Ac(得自PeterEckes博士，HoechstAg,Frankfurt,Germany)用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以便提供可選標(biāo)記。該質(zhì)粒含有pat基因(見(jiàn)歐洲專(zhuān)利公布0242236)，該基因編碼草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)。酶PAT賦予對(duì)除草性谷氨酰胺合成酶抑制劑例如草胺膦的抗性。p35S/Ac的pat基因處于來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(Odell等人，Nature313810-812(1985))和胭脂堿合成酶基因的3'區(qū)的控制下，該胭脂堿合成酶基因來(lái)自根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA?？蓪⒘Ｗ愚Z擊法(Klein等人，Nature327:70_73(1987))用于將基因轉(zhuǎn)移至愈傷組織培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)該方法，利用下面的技術(shù)用DNA包覆金顆粒(直徑Iym)。將IOyg質(zhì)粒DNA加入到50μL金顆粒懸浮液(每mL60mg)中。將氯化鈣(50μL的2·5Μ溶液)禾口亞精胺游離堿(20μL的1.OM溶液)加入到該顆粒中。再加入這些溶液過(guò)程中渦旋該懸浮液。10分鐘后，將試管粗略地離心(以15，OOOrpm進(jìn)行5秒鐘)并移除上清液。將該顆粒再懸浮于200μL的無(wú)水乙醇中，再次離心并移除上清液。再次進(jìn)行乙醇沖洗并將顆粒再懸浮于終體積為30yL的乙醇中?？蓪NA包覆的金顆粒等分試樣(5μL)置于Kapton飛行圓盤(pán)(Bio-RadLabs)的中心。然后使用BiolisticPDS-1000/He(Bio-RadInstruments,HerculesCA)，采用IOOOpsi的氦氣壓、0.5cm的間隙距離以及1.Ocm的飛行距離，將顆粒加速射入玉米組織中。對(duì)于轟擊，將胚發(fā)生組織置于瓊脂糖硬化的N6培養(yǎng)基上的濾紙上。組織布置成薄薄一層，并覆蓋直徑為約5cm的圓形區(qū)域。然后可將包含組織的培養(yǎng)皿置于離阻擋網(wǎng)大約8cm的PDS-1000/He的腔室內(nèi)。然后將該腔室中的空氣抽出至28英寸汞柱的真空。利用在擊波管中氦氣壓力達(dá)到IOOOpsi時(shí)破裂的可破裂膜，宏載體被氦氣沖擊波加速。轟擊后七天，可將組織轉(zhuǎn)移至N6培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有雙丙氨磷(每升5mg)并缺少酪蛋白或脯氨酸。組織繼續(xù)在這種培養(yǎng)基上緩慢生長(zhǎng)。另外兩周后，可將組織轉(zhuǎn)移至含有bialaphos的新鮮N6培養(yǎng)基上。六周后，在某些裝有補(bǔ)充了雙丙氨磷的培養(yǎng)基的盤(pán)上，可辨別直徑約Icm的區(qū)域上有活性生長(zhǎng)的愈傷組織。當(dāng)在選擇培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)時(shí)，這些愈傷組織可繼續(xù)生長(zhǎng)。通過(guò)首先將組織簇轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有0.2mg每升的2，4_D的N6培養(yǎng)基中，可從該轉(zhuǎn)基因愈傷組織再生出植物。兩周后，可將組織轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中(Fromm等人，Bio/Technology8:833-839(1990))?？稍偕鲛D(zhuǎn)基因的TO植株并按照下面的HTP步驟確定它們的表型。可收集Tl種子?？稍耘郥l植株并分析表型變化。利用圖像分析可定量下面的參數(shù)可收集并定量植株面積、體積、生長(zhǎng)速率以及顏色分析。與合適的對(duì)照植物比較，導(dǎo)致根構(gòu)造改變或上文列出的任何一種農(nóng)學(xué)特性改變的表達(dá)構(gòu)建體可被認(rèn)為是擬南芥前導(dǎo)基因在玉米中發(fā)揮功能以改變根構(gòu)造或植物構(gòu)造的證據(jù)。此外，可通過(guò)直接轉(zhuǎn)化或者從單獨(dú)轉(zhuǎn)化的品系基因滲入而將含有驗(yàn)證的擬南芥基因的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入玉米品系內(nèi)。可對(duì)轉(zhuǎn)基因植株(或者是近交的或者是雜交的)進(jìn)行更有力的基于田間的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究在多種環(huán)境條件下(如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的改變和水的可利用性)的根構(gòu)造或植物構(gòu)造、產(chǎn)量提高和/或抗根倒伏性。也可進(jìn)行后續(xù)的產(chǎn)量分析，以確定含有驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的植物與不包含驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的對(duì)照(或參照)植物相比較時(shí)是否具有改善的產(chǎn)量表現(xiàn)。包含驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的植物相對(duì)于對(duì)植物將具有改善的產(chǎn)量，優(yōu)選地在不利環(huán)境條件下產(chǎn)量損失減少50%，或在不同環(huán)境條件下相對(duì)于對(duì)照植物將具有提高的產(chǎn)量。實(shí)施例12電穿孔根癌農(nóng)桿菌LBA4404將電穿孔感受態(tài)細(xì)胞(40μ1)，例如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404(含有ΡΗΡ10523)在冰上解凍(20至30分鐘)。ΡΗΡ10523含有用于T-DNA轉(zhuǎn)移的VIR基因、農(nóng)桿菌屬的低拷貝數(shù)質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)、四環(huán)素抗性基因以及用于體內(nèi)DNA生物分子重組的cos位點(diǎn)。同時(shí)，將電穿孔管(electroporationcuvette)在冰上冷卻。將該電穿孔儀的設(shè)置調(diào)節(jié)至2.lkV。將DNA等分試樣(0.5μLJT(US7，087，812)親代DNA，在低鹽緩沖液或雙蒸H2O中的濃度為0.2μg至1.0μg)與解凍的農(nóng)桿菌細(xì)胞混合，同時(shí)仍然保持在冰上。將該混合物轉(zhuǎn)移至電穿孔管的底部并靜止保持在冰上1至2分鐘。通過(guò)按下“pulse(脈沖)”鍵兩次(理想的是獲得4.0毫秒的脈沖)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電穿孔(Eppendorf電穿孔儀2510)。隨后，將0.5ml2xYT培養(yǎng)基(或SOCmedium)加入到電穿孔管并轉(zhuǎn)移至15mlFalcon管中。將細(xì)胞在28至30°C、200至250rpm下培養(yǎng)3小時(shí)。將250μ1的等分試樣散布在#30Β(ΥΜ+50μg/mL奇放線菌素)板上并在28至30°C下培養(yǎng)3天。為了增加轉(zhuǎn)化體的數(shù)目，可進(jìn)行如下兩個(gè)可選步驟中的其中一個(gè)選擇1用30μ115mg/ml的利福平覆蓋平板。LBA4404具有針對(duì)利福平的染色體抗性基因。這種附加的選擇消除了在使用較差的LBA4404感受態(tài)細(xì)胞制備物時(shí)觀察到的一些污染克隆。選擇2進(jìn)行兩次重復(fù)的電穿孔以補(bǔ)償較差的電感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化體的鑒定選取四個(gè)獨(dú)立的克隆并劃痕接種在AB基本培養(yǎng)基+50mg/mL奇放線菌素的平板(#12S培養(yǎng)基)上用于分離單個(gè)克隆。將平板在28°C下培養(yǎng)2至3天。對(duì)于每個(gè)推定的共整合體選取單個(gè)克隆并將其接種在4ml具有50mg/l的奇放線菌素的#60A中。將該混合物在28°C下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)。采用QiagenMiniprep+可選的PB洗滌，從4ml培養(yǎng)物分離出質(zhì)粒DNA。將DNA在30μ1中洗提。如上所述，將2μ1的等分試樣用于電穿孔20μ1DH10b+20μ1ddH20?？扇芜x地，可將15μ1等分試樣用于轉(zhuǎn)化75至100μ1的InvitrogenLibraryEfficiencyDH5α。將細(xì)胞散布在LB培養(yǎng)基+50mg/mL奇放線菌素的平板(#34T培養(yǎng)基)上并將其在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)于每個(gè)推定的共整合體選取3至4個(gè)獨(dú)立的克隆并將其接種在4ml具有50μg/ml奇放線菌素的2xYT(#60A)上。將細(xì)胞在37°C下?lián)u晃培養(yǎng)過(guò)夜。使用QIAprepMinipr印，用任選PB洗滌液(稀釋成50μ1)從4mL培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，并且8μ1質(zhì)粒DNA用SalI(使用JT親本和ΡΗΡ10523作對(duì)照物)進(jìn)行消化。對(duì)于4個(gè)質(zhì)粒利用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、EcoRI和HindIII再進(jìn)行三次消化(使用親代DNA和PHP10523作為對(duì)照)，這4個(gè)質(zhì)粒代表2種具有正確SalI消化模式的推定共整合體。推薦電凝膠(Electronicgel)用于比較。作為另一種選擇，對(duì)于高通量應(yīng)用，例如針對(duì)GaspeBayFlint衍生的玉米品系(實(shí)施例15-17)所描述的，代替通過(guò)限制性酶切分析來(lái)評(píng)價(jià)所得的共整合載體，可將三個(gè)克隆同時(shí)用于如實(shí)施例13所述的感染步驟。實(shí)施例13農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米的轉(zhuǎn)化為了檢查所得表型，可轉(zhuǎn)化玉米植株以過(guò)表達(dá)驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因或來(lái)自不同物種的對(duì)應(yīng)同源物。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化基本上按照Z(yǔ)hao等人，Meth.Mol.Biol.318315-323(2006)中描述的方法進(jìn)行(還可參見(jiàn)Zhao等人，Mol.Breed.8:323_333(2001)和1999年11月9日公布的美國(guó)專(zhuān)利5，981，840，以引用的方式將該文獻(xiàn)并入本文)。該轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及細(xì)菌接種、共培養(yǎng)、靜止期、選擇以及植株再生。1.未成熟胚的制備從穎果切取未成熟胚并置于裝有2mLPHI-A培養(yǎng)基的2mL微型管中。2.胚的農(nóng)桿菌感染以及共培養(yǎng)2.1感染步驟用ImL微量吸移管移出PHI-A培養(yǎng)基并加入ImL農(nóng)桿菌懸浮液。輕輕倒置該管進(jìn)行混合。將該混合物在室溫下培養(yǎng)5分鐘。2.2共培養(yǎng)步驟用ImL微量吸移管將農(nóng)桿菌懸浮液從感染步驟中移出。使用無(wú)菌刮刀將胚從管中刮出并轉(zhuǎn)移到IOOX15mm培養(yǎng)皿中的PHI-B培養(yǎng)基的平板中。確定胚的朝向，使得胚軸在培養(yǎng)基表面上朝下。將具有胚的平板在20°C下于黑暗中培養(yǎng)3天。L-半胱氨酸可用于共培養(yǎng)階段。采用標(biāo)準(zhǔn)二元載體，補(bǔ)充有100-400mg/LL-半胱氨酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)于回收穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因事件是至關(guān)重要的。3.推定他轉(zhuǎn)基因事件的誅雇向IOOX15mm培養(yǎng)皿中的PHI-D培養(yǎng)基的每平板中轉(zhuǎn)移10個(gè)胚，保持朝向，并用石蠟?zāi)⑴囵B(yǎng)皿密封。將平板在黑暗中于28°C下培養(yǎng)。預(yù)計(jì)在6-8周將看見(jiàn)活性生長(zhǎng)的推定事件(作為淺黃色胚組織)。不產(chǎn)生事件的胚可能是棕色和壞死的，并且?guī)缀蹩床灰?jiàn)脆性組織生長(zhǎng)。取決于生長(zhǎng)速率，以2至3周的間隔將推定的轉(zhuǎn)基因胚組織轉(zhuǎn)移到新鮮的PHI-D平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。記錄事件。4.TO植株的再生將在PHI-D培養(yǎng)基上增殖的胚組織轉(zhuǎn)移至100X25mm培養(yǎng)皿中的PHI-E培養(yǎng)基(體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基)進(jìn)行傳代培養(yǎng)并在28°C下，在黑暗中培養(yǎng)約10至18天，直至體細(xì)胞胚成熟。將具有良好限定的盾片和胚芽鞘的個(gè)體成熟體細(xì)胞胚芽轉(zhuǎn)移到PHI-F胚芽發(fā)芽培養(yǎng)基中，并且在28°C下于光中(約80μΕ，來(lái)自冷光燈或同等熒光燈)培養(yǎng)。在7至10天，將約IOcm高的再生植株盆載于園藝混合物中，并使用標(biāo)準(zhǔn)園藝方法使其受冷而變得耐寒。用于棺物轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基1.PHI-A:4g/L的CHU基礎(chǔ)鹽、1.OmL/L的1000XEriksson維生素混合物、0.5mg/L的鹽酸硫胺素、1.5mg/L的2，4-D、0.69g/L的L-脯氨酸、68.5g/L的蔗糖、36g/L的葡萄糖，PH為5.2。在使用前加入100μM的乙酰丁香酮，過(guò)濾滅菌。2.PHI-B無(wú)葡萄糖的PHI_A，2，4_D增加至2mg/L，蔗糖減少至30g/L并且補(bǔ)充有0.85mg/L的硝酸銀(過(guò)濾滅菌)，3.Og/L的固化劑(gelrite)，100μM的乙酰丁香酮(過(guò)濾滅菌)，ρΗ為5.8。3.PHI-C無(wú)固化劑和乙酰丁香酮的PHI-B，2，4-D減少至1.5mg/L并且補(bǔ)充有8.Og/L的瓊脂，0.5g/L的Ms-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液，100mg/L的羧芐青霉素(過(guò)濾滅菌)。4.PHI-D補(bǔ)充有3mg/L的雙丙氨磷(過(guò)濾滅菌)的PHI-C。5.PHI-E4.3g/L的MurashigeandSkoog(MS)鹽(Gibco，BRLl1117-074)、0·5mg/L的煙酸、0.lmg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、2.Omg/L的甘氨酸、0.lg/L的肌醇、0.5mg/L的玉米素(Sigma，商品目錄號(hào):Z_0164)、lmg/L的吲哚乙酸(IAA)、26·4μg/L的脫落酸(ABA)、60g/L的蔗糖、3mg/L的雙丙氨磷(過(guò)濾滅菌)、100mg/L的羧芐青霉素(過(guò)濾滅菌)、8g/L的瓊脂，pH為5.6。6.PHI-F不含玉米素、IAA,ABA的PHI-E；蔗糖減少至40g/L；用1.5g/L的固化劑代替瓊脂；pH*5.6。通過(guò)首先將組織簇轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有0.2mg每升的2，4-D的N6培養(yǎng)基中，可從該轉(zhuǎn)基因愈傷組織中再生出植物。兩周后，可將組織轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(Fromm等人，(1990)Bio/Technology8:833-839)中?？蛇M(jìn)行對(duì)轉(zhuǎn)基因TO植株和Tl植株的表型分析?？煞治鯰l植株表型的變化。利用圖像分析，可在植株生長(zhǎng)過(guò)程中在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分析Tl植株在植株面積、體積、生長(zhǎng)速率方面的表型變化并且可進(jìn)行顏色分析?？扇鐚?shí)施例20中所述來(lái)分析根構(gòu)造的改變。可對(duì)農(nóng)學(xué)特性的改變進(jìn)行后續(xù)分析，以確定含有驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的植株在與不含有驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的對(duì)照(或參照)植株比較時(shí)是否具有至少一種農(nóng)學(xué)特性的改善。還可在多種環(huán)境條件下研究改變。導(dǎo)致根構(gòu)造顯著改變的表達(dá)構(gòu)建體將被認(rèn)為是擬南芥基因在玉米中發(fā)揮功能以改變根構(gòu)造的證據(jù)。實(shí)施例14A利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化構(gòu)建具有擬南芥前導(dǎo)基因(AT4G23900)的玉米表達(dá)載體用擬南芥ndk基因(AT4G23900)在NAS2(SEQIDNO:57和G0S2(SEQIDNO58)啟動(dòng)子控制下制備玉米表達(dá)載體。PINII是終止子(SEQIDNO61)使用InvitrogenGateway技術(shù)，如實(shí)施例5A所述制備的、包含擬南芥ndk基因(AT4G23900)的入門(mén)克隆PHP28731被用于獨(dú)立的GatewayLR反應(yīng)1)組成型玉米G0S2啟動(dòng)子入門(mén)克隆(PHP28408，圖11,SEQIDNO11)和PinII終止子入門(mén)克隆(PHP20234，圖9，SEQIDNO9)形成目的載體PHP28529(圖10，SEQIDN0:10)。將所得載體命名為PHP28911。2)根玉米NAS2啟動(dòng)子入門(mén)克隆(PHP22020,圖12，SEQIDNO12)和PinII終止子入門(mén)克隆(PHP20234，圖9，SEQIDNO9)形成目的載體PHP28529(圖10，SEQIDN0:10)。將所得載體命名為PHP28912。目的載體PHP28529被加到每個(gè)最終載體(PHP28911和PHP28912)中，也是1)RD29A啟動(dòng)子黃色熒光蛋白=PinII終止子盒，用于擬南芥屬種子分選。2)泛素啟動(dòng)子moPAT/紅色熒光蛋白融合基因=PinII終止子盒，用于轉(zhuǎn)化選擇和玉米種子分選。實(shí)施例14B吿編射以赫ndk細(xì)減表汰木_本可使用實(shí)施例5A和14A所述的程序?qū)M南芥ndk基因及其來(lái)自玉米和其他物種的對(duì)應(yīng)同源物(表1)轉(zhuǎn)化到玉米品系中。能如實(shí)施例5A和14A所述制備具有擬南芥ndk基因及其來(lái)自玉米和其他物種的對(duì)應(yīng)同源物(表1)的玉米表達(dá)載體。除了G0S2或NAS2啟動(dòng)子，其他啟動(dòng)子，例如但不限于泛素啟動(dòng)子、S2A和S2B啟動(dòng)子、玉米R(shí)00TMET2啟動(dòng)子、玉米Cyclo、CRlBI0、CRWAQ81以及玉米ZRP2.4447，可用于引導(dǎo)ndk和NDK樣基因在玉米中的表達(dá)。此外，多種終止子，例如但不限于PINII終止子，可用于完成所關(guān)注基因在玉米中的表達(dá)。實(shí)施例14C#用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，用擬南芥前導(dǎo)某因(AT4G23900)禾Π來(lái)自1；他,物禾Φ的對(duì)應(yīng)同源物轉(zhuǎn)化玉米品系然后可將最終載體(玉米中表達(dá)的載體，實(shí)施例14Α和B)分別電穿孔進(jìn)入包含ΡΗΡ10523的LBA4404農(nóng)桿菌(圖7；SEQIDNO:7，Komari等人，PlantJ10165-174(1996),NCBIGI:59797027)中，以產(chǎn)生用于玉米轉(zhuǎn)化的共整合載體。該共整合載體是通過(guò)最終載體(玉米表達(dá)載體)與PHP10523的重組(通過(guò)每個(gè)載體上含有的COS重組位點(diǎn))而形成。除了實(shí)施例14A-B中所述的表達(dá)盒，該共整合載體還含有農(nóng)桿菌菌株以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化所需的基因(ΤΕΤ、ΤΕΤ、TRFA、ORI終止子、CTL、ORIV、VIRCl、VIRC2、VIRG、VIRB)。轉(zhuǎn)化玉米品系可如實(shí)施例13所述進(jìn)行。實(shí)施例15用于轉(zhuǎn)化GaspeBayFlint衍生的玉米品系的目的載體PHP23236和PHP29635的制備目的載體PHP23236(圖6，SEQIDNO:6)是通過(guò)用質(zhì)粒PHP23235(圖8，SEQIDNO8)轉(zhuǎn)化包含質(zhì)粒PHP10523(圖7，SEQIDNO7)的農(nóng)桿菌菌株LBA4404并分離所得的共整合產(chǎn)物而獲得。目的載體PHP23236可被用于如實(shí)施例16所述的與入門(mén)克隆的重組反應(yīng)，以產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化GaspeBayFlint衍生的玉米品系的玉米表達(dá)載體。所關(guān)注的基因的表達(dá)是處于泛素啟動(dòng)子(SEQIDNO59)的控制之下。PHP29635(圖13，SEQIDNO:13)是通過(guò)用質(zhì)粒PII0XS2a_FRT87(ni)m(圖14，SEQIDNO56)轉(zhuǎn)化包含質(zhì)粒PHP10523的農(nóng)桿菌菌株LBA4404并分離所得的共整合產(chǎn)物而獲得。目的載體PHP29635可被用于如實(shí)施例16所述的與入門(mén)克隆的重組反應(yīng)，以產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化GaspeBayFlint衍生的玉米品系的玉米表達(dá)載體。所關(guān)注的基因的表達(dá)是處于S2A啟動(dòng)子(SEQIDNO60)的控制之下。實(shí)施例16用于轉(zhuǎn)化GaspeBayFlint衍生的玉米品系的質(zhì)粒的制備使用InvitrogenGateway重組技術(shù)，可如實(shí)施例5A和9所述制備包含擬南芥ndk基因(AT4G23900)或玉米NDK樣同源物的入門(mén)克隆，該克隆用于定向克隆每個(gè)基因進(jìn)入目的載體PHP23236(實(shí)施例15)用于在泛素啟動(dòng)子下表達(dá)，或進(jìn)入目的載體PHP29635(實(shí)施例15)用于在S2A啟動(dòng)子下表達(dá)。每一種表達(dá)載體都是用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)化的T-DNA二元載體。GaspeBayFlint衍生的玉米品系可如實(shí)施例17中所述用表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。實(shí)施例17用駘iifi寸的擬南芥前導(dǎo)某因和來(lái)自1；他,物種的對(duì)應(yīng)同源物轉(zhuǎn)化GameBayFlint衍牛的玉米品系為了檢查所得表型，玉米植株可如實(shí)施例16所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)擬南芥AT4G23900基因和來(lái)自其他物種的同源物，如表1列出的基因。除了如實(shí)施例16所述的啟動(dòng)子之外，其他啟動(dòng)子，例如S2A和S2B啟動(dòng)子、玉米R(shí)00TMET2啟動(dòng)子、玉米Cyclo、CRlBI0、CRffAQ81以及玉米ZRP2.4447，可用于引導(dǎo)ndk和NDK樣基因在玉米中的表達(dá)。此外，多種終止子，例如但不限于PINII終止子，可用于完成所關(guān)注基因在GaspeBayFlint衍生的玉米品系中的表達(dá)。受體棺株受體植株細(xì)胞可來(lái)自具有短的生活周期(“快速循環(huán)”)、大小減少以及轉(zhuǎn)化潛能高的單一玉米品系。對(duì)玉米典型的這些植株細(xì)胞是來(lái)自可公開(kāi)獲得的GaspeBayFlint(GBF)品系變種的植株細(xì)胞。一種可能的候選植株品系變種是GBFXQTM(QuickTurnaroundMaize(快速周轉(zhuǎn)玉米)，選擇用于在溫室條件下生長(zhǎng)的GaspeBayFlint的可公開(kāi)獲得形式)的Fl雜交種，其在Tomes等人的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0221212中有所公開(kāi)。從該品系獲得的轉(zhuǎn)基因植株具有如此小的大小使得它們可在4英寸的盆中生長(zhǎng)(是正常大小的玉米植株所需空間的1/4)并且它們?cè)谏儆?.5個(gè)月時(shí)間內(nèi)成熟。(傳統(tǒng)上，一旦轉(zhuǎn)基因植株適應(yīng)溫室后需要3.5個(gè)月來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因TO種子。)另一合適的品系是GS3(高度可轉(zhuǎn)化的品系)XGaspeFlint的雙單倍體品系。還有另一種合適的品系是攜帶引起較早開(kāi)花、高度減小或這兩者的轉(zhuǎn)基因的可轉(zhuǎn)化的優(yōu)良近交系。轉(zhuǎn)化規(guī)程任何合適的方法可用于將轉(zhuǎn)基因引入玉米細(xì)胞中，包括但不限于利用基于農(nóng)桿菌載體的接種類(lèi)型的步驟，如實(shí)施例9所述。轉(zhuǎn)化可在受體(靶標(biāo))植株的未成熟胚上進(jìn)行。精確的生長(zhǎng)和植株跟蹤將由轉(zhuǎn)化的玉米胚產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因(TO)植株的事件群體在受控的溫室環(huán)境中栽培，該溫室使用改良的隨機(jī)分塊(block)設(shè)計(jì)以降低或消除環(huán)境誤差。隨機(jī)分塊設(shè)計(jì)是這樣一種植株布局，在該布局中，實(shí)驗(yàn)植株被分成組(如，每組30株植株)，稱(chēng)為塊，而每株植株隨塊被隨機(jī)分配一個(gè)位置。對(duì)于一組30株植株，24株轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)植株和6株對(duì)照植株(具有設(shè)定好的表型的植株)(總起來(lái)說(shuō)稱(chēng)為“重復(fù)組”)被置于盆中，這些盆在位于溫室內(nèi)的桌子上布置成陣列(也叫做重復(fù)組或塊)。每株植株(對(duì)照植株或?qū)嶒?yàn)植株)隨塊被隨機(jī)分配一個(gè)位置，所述的塊映射一個(gè)唯一的、溫室物理位置以及映射該重復(fù)組。在單次實(shí)驗(yàn)中多個(gè)30株植株的重復(fù)組中的每一個(gè)可栽培在相同的溫室中。應(yīng)該確定重復(fù)組的布局(布置方式)以使對(duì)空間的要求最小以及溫室內(nèi)的環(huán)境影響最小。這樣一種布局可稱(chēng)為壓縮的溫室布局。對(duì)于加入特定的對(duì)照組的一種替代方法是鑒定不表達(dá)所關(guān)注基因的那些轉(zhuǎn)基因植株?？蓪⒅T如RT-PCR之類(lèi)的多種技術(shù)應(yīng)用于定量評(píng)估引入基因的表達(dá)水平?？蓪⒉槐磉_(dá)轉(zhuǎn)基因的TO植株與表達(dá)轉(zhuǎn)基因的那些植株進(jìn)行比較。在整個(gè)評(píng)價(jià)過(guò)程中鑒定和跟蹤事件群體中的每株植株，并且從那些植株收集的數(shù)據(jù)自動(dòng)與那些植株相關(guān)聯(lián)，使得所搜集的數(shù)據(jù)可與由該植株攜帶的轉(zhuǎn)基因關(guān)聯(lián)。例如，每個(gè)植株容器具有機(jī)器可讀的標(biāo)簽(例如通用貨單代碼(UPC)條形碼)，該標(biāo)簽包含了關(guān)于植物身份的信息，身份信息繼而又與溫室位置相關(guān)，使得從植物獲得的數(shù)據(jù)可自動(dòng)與該植物相關(guān)聯(lián)。作為另外一種選擇，可使用任何有效的、機(jī)器可讀的植物識(shí)別系統(tǒng)，例如二維矩陣代碼或甚至是射頻識(shí)別標(biāo)簽(RFID)，其中數(shù)據(jù)被接收并由射頻接收器/處理器進(jìn)行翻譯。參見(jiàn)美國(guó)公布的專(zhuān)利申請(qǐng)2004/0122592，將其以引用的方式并入本文。利用三維成像講行表型分析對(duì)TO事件群體中的每株溫室植株(包括任何對(duì)照植株)分析所關(guān)注的農(nóng)學(xué)特性，并且以這樣一種方式記錄或存儲(chǔ)每株植株的農(nóng)學(xué)數(shù)據(jù)，該方式使得數(shù)據(jù)與該植株的辨識(shí)數(shù)據(jù)(見(jiàn)上面)相關(guān)聯(lián)?？衫门c上述類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可在Tl代中完成對(duì)表型(基因效應(yīng))的確認(rèn)。在植物的整個(gè)溫室生活周期中，利用定量的非破壞性成像技術(shù)在表型水平上來(lái)分析TO植株以評(píng)估所關(guān)注的性狀。優(yōu)選的是，將數(shù)字成像分析儀用于整株植物的自動(dòng)多維分析。成像可在溫室內(nèi)進(jìn)行。將兩個(gè)攝像系統(tǒng)(位于頂部和側(cè)面)和用于旋轉(zhuǎn)植物的裝置用于從所有側(cè)面觀察植物和成像。從每株植物的頂部、前面和側(cè)面采集圖像。所有的三個(gè)圖像一起提供了足夠的信息用于評(píng)價(jià)每株植物的生物量、大小和形態(tài)。由于植物在第一片葉片從土壤顯現(xiàn)出來(lái)時(shí)到植物處于它們發(fā)育的末期時(shí)大小的改變，最好是從頂部以較高的放大倍率記錄植物發(fā)育的早期。這可通過(guò)利用完全由成像軟件控制的自動(dòng)變焦鏡頭系統(tǒng)來(lái)完成。在單次成像分析操縱中，進(jìn)行如下事件(1)將植株傳送至分析儀區(qū)域內(nèi)，旋轉(zhuǎn)360度以便其機(jī)器可讀標(biāo)簽可被讀取，并且讓其保持靜止直至其葉片停止移動(dòng)；(2)獲取側(cè)面圖像并將其輸入數(shù)據(jù)庫(kù)；(3)將植株旋轉(zhuǎn)90度并再次讓其保持靜止直至其葉片停止移動(dòng)；以及(4)將該植株傳送出分析儀。每24小時(shí)的周期讓植物至少6個(gè)小時(shí)處于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。成像儀器可使用任何合適的成像儀器，包括但不限于可從LemnaTecGmbH(ffurselen，Germany)商購(gòu)獲得的光譜數(shù)字成像儀。獲取圖像并用具有1/2"ITProgressiveScanIEECCD成像設(shè)備的LemnaTecScanalyzerHTSLT-0001-2進(jìn)行分析。該成像照相機(jī)可配備有自動(dòng)變焦、自動(dòng)調(diào)節(jié)光圈和自動(dòng)聚焦?？衫肔emnaTec軟件設(shè)定所有的照相機(jī)設(shè)置。優(yōu)選的是，對(duì)于主要組成成像分析儀的儀器差異小于約5%，對(duì)于次要組成成像分析儀的儀器差異小于約10%。_成像分析系統(tǒng)包括用于顏色和結(jié)構(gòu)分析的LemnaTecHTSBonit軟件程序和用于存儲(chǔ)約500，000次分析的數(shù)據(jù)(包括分析數(shù)據(jù))的服務(wù)器數(shù)據(jù)庫(kù)。原始圖像和分析過(guò)的圖像儲(chǔ)存在一起以允許用戶(hù)根據(jù)需要進(jìn)行再次分析。可將數(shù)據(jù)庫(kù)連接至成像硬件用于自動(dòng)的數(shù)據(jù)收集和存儲(chǔ)。可將多種市售的軟件系統(tǒng)(如Matlab等)用于定量判讀成像數(shù)據(jù)，并且這些軟件系統(tǒng)中的任一種均可應(yīng)用于圖像數(shù)據(jù)集。傳送系統(tǒng)具有植物旋轉(zhuǎn)裝置的傳送系統(tǒng)可用于將植物傳送至成像區(qū)域并在成像過(guò)程中選擇植物。例如，將最多4株植物(每株最高高度為1.5m)裝上汽車(chē)，該汽車(chē)在循環(huán)的傳送系統(tǒng)上行進(jìn)并通過(guò)成像測(cè)量區(qū)域。在這種情況下，該單位(成像分析儀和傳送環(huán)線)的總占有面積為約5mX5m?？蓴U(kuò)大傳送系統(tǒng)以同時(shí)容納更多植物。將植物沿傳送環(huán)線傳送至成像區(qū)域并對(duì)每株植物分析最多50秒。獲取植物的三個(gè)視圖。傳送系統(tǒng)以及成像設(shè)備應(yīng)該能夠用于溫室環(huán)境條件。MM任何合適的照明模式可用于圖像采集。例如，可在暗背景上使用頂部照明。作為另外一種選擇，可采用使用白色背景的頂部照明和背部照明的組合。應(yīng)該將被照亮的區(qū)域圍起來(lái)以確保恒定的照明條件。遮蔽物應(yīng)該長(zhǎng)于測(cè)量區(qū)域使得能保持恒定的光條件而不需要打開(kāi)和關(guān)閉門(mén)。作為另一種選擇，可變化照明以引起轉(zhuǎn)基因(如，綠色熒光蛋白(GFP)^l色熒光蛋白(RFP))的激發(fā)或者引起內(nèi)源性(如葉綠素)熒光基團(tuán)的激發(fā)?；谌S成像的牛物量評(píng)價(jià)為了更好地評(píng)價(jià)生物量，應(yīng)該從至少三個(gè)軸(優(yōu)選頂部視圖和兩個(gè)側(cè)面(側(cè)面1和側(cè)面2)視圖)獲取植物圖像。然后分析這些圖像以將植物從背景(盆和花粉控制袋(如果適用的話(huà)))分離?？赏ㄟ^(guò)如下計(jì)算來(lái)評(píng)價(jià)植物的體積體積(體素)=^/頂部面積(像素)X^/側(cè)面1面積(像素)側(cè)面2面積(像素)在上面的等式中，體積和面積的單位是“任意單位”。在該體系中，任意單位完全足以檢測(cè)基因?qū)χ参锎笮『蜕L(zhǎng)影響，因?yàn)樗璧氖菣z測(cè)與實(shí)驗(yàn)平均值或?qū)φ掌骄档牟钪?正較大和負(fù)較小兩者)。大小(如面積)的任意單位可通過(guò)將物理參照加入到成像過(guò)程而輕易地轉(zhuǎn)化成物理量度。例如，可在頂部成像過(guò)程和側(cè)面成像過(guò)程兩者中均包括已知面積的物理參照?；谶@些物理參照的面積，可測(cè)定轉(zhuǎn)換因子以允許從像素轉(zhuǎn)換為面積單位，例如平方厘米(cm2)。物理參照可以是或可以不是獨(dú)立的樣本。例如，具有已知直徑和高度的盆足可用作物理參照。顏餼分類(lèi)成像技術(shù)還可用于確定植物顏色以及用于將植物顏色歸為各種衍生類(lèi)型。將圖像顏色歸屬于顏色類(lèi)型是LemnaTec軟件的固有特色。使用其他圖像分析軟件系統(tǒng)，可通過(guò)多種計(jì)算方法確定顏色分類(lèi)。對(duì)于植物大小和生長(zhǎng)參數(shù)的測(cè)定，一種有用的分類(lèi)方案是定義一種單一顏色方案，包括綠色的兩種或三種色調(diào)，此外，還有關(guān)于缺綠病、壞死和漂白(在這些條件出現(xiàn)時(shí))的顏色類(lèi)型。還使用了背景顏色類(lèi)型，其包括圖像中的非植物顏色(例如盆和土壤顏色)，并將這些像素特別地從測(cè)定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可定量一株植物內(nèi)隨時(shí)間推移的任何改變，或者植物之間或植物不同分枝之間的任何改變(如季節(jié)差異)ο除了其在測(cè)定植物的大小、生長(zhǎng)中的有效性之外，顏色分類(lèi)還可用于評(píng)估其他產(chǎn)量構(gòu)成性狀。對(duì)于這些其他產(chǎn)量構(gòu)成性狀，可使用另外的顏色分離方案。例如，稱(chēng)為“保綠度(staygreen)”的性狀(已經(jīng)將其與產(chǎn)量的提高相關(guān)聯(lián))可通過(guò)顏色分類(lèi)來(lái)評(píng)估，該顏色分類(lèi)將綠色色調(diào)與黃色和棕色色調(diào)(其指示老化的組織)相分離。通過(guò)將這種顏色分類(lèi)應(yīng)用于在TO或Tl植物生命周期末期獲取的圖像，可鑒定綠色的量相對(duì)于黃色和棕色(例如，可表示為綠色/黃色比率)增加的植物。這種綠色/黃色比率具有顯著差異的植物可被鑒定為攜帶影響這種重要農(nóng)學(xué)特性的轉(zhuǎn)基因。熟練的植物學(xué)家將認(rèn)識(shí)到可指示植物健康或應(yīng)激反應(yīng)的其他植物顏色(花青素)的出現(xiàn)，并且認(rèn)識(shí)到其他顏色分類(lèi)方案可提供對(duì)基因在與這些響應(yīng)相關(guān)的性狀方面的作用的進(jìn)一步度量。棺物構(gòu)造分析改變植物構(gòu)造參數(shù)的轉(zhuǎn)基因也可用本發(fā)明鑒定，包括諸如最大高度和寬度、節(jié)間距離、葉與莖之間的角度、在節(jié)處開(kāi)始的葉片數(shù)以及葉片長(zhǎng)度。LemnaTec系統(tǒng)軟件可如下用于確定植物構(gòu)造。在第一成像步驟中將植物簡(jiǎn)化至其主要的幾何構(gòu)造，并且隨后基于該圖像可進(jìn)行不同構(gòu)造參數(shù)的參數(shù)化鑒定。或者是單獨(dú)地或者是組合地修改任何這些構(gòu)造參數(shù)的轉(zhuǎn)基因可通過(guò)應(yīng)用此前所述的統(tǒng)計(jì)方法來(lái)鑒定。花粉脫落日期花粉脫落日期是轉(zhuǎn)基因植物中要分析的一個(gè)重要參數(shù)，并且可通過(guò)活性雄花第一次出現(xiàn)在植物上來(lái)確定。為了找到雄花目標(biāo)，通過(guò)用顏色對(duì)莖的上端進(jìn)行分類(lèi)以檢測(cè)黃色或紫色花藥。然后將這種顏色分類(lèi)分析用于定義活性花，活性花繼而可用于計(jì)算花粉脫落日期。作為另外一種選擇，花粉脫落日期和其他易于在視覺(jué)上檢測(cè)到的植物屬性(如授粉日期、第一穗絲日期)可由負(fù)責(zé)進(jìn)行植物看護(hù)的工作人員來(lái)記錄。為了使數(shù)據(jù)完整性和過(guò)程效率最大化，通過(guò)利用相同的由LemnaTec光譜數(shù)字分析設(shè)備利用的條形碼來(lái)跟蹤該數(shù)據(jù)?？蓪⒕哂袟l形碼閱讀器的電腦、掌上設(shè)備或筆記本電腦用于使記錄觀察時(shí)間、植物標(biāo)識(shí)符的數(shù)據(jù)捕捉變得容易，并且使捕捉數(shù)據(jù)的操作者感覺(jué)舒適。植物的取向以接近商業(yè)栽培的密度種植的成熟玉米植物通常具有平面的構(gòu)造。也就是說(shuō)，植物具有一可清晰分辨的寬的側(cè)面和窄的側(cè)面。對(duì)來(lái)自植物寬側(cè)的圖像進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于每株植物，給其賦予一個(gè)明確界定的基本取向以獲得寬側(cè)圖像與窄側(cè)(edgewise)圖像之間的最大差別。將頂部圖像用于確定植物的主軸，而將額外的旋轉(zhuǎn)裝置用于在開(kāi)始主圖像采集前將植物轉(zhuǎn)至合適的取向。實(shí)施例18在氮限制條件下篩選GaspeBayFlint衍生的玉米品系和雜交種一些轉(zhuǎn)基因植物將含有兩個(gè)或三個(gè)劑量的GaspeFlint_3與一個(gè)劑量的653(653/(6&86-3)2乂或653/(6386-3)3乂)，并且對(duì)于顯性轉(zhuǎn)基因?qū)?huì)以11分離。其他轉(zhuǎn)基因植物將是常規(guī)近交系，并將被用于頂交以生成測(cè)試雜交種。將植物在Turface中栽培，每天用ImMKNO3生長(zhǎng)培養(yǎng)基和2mMKNO3或更高的生長(zhǎng)培養(yǎng)基澆灑四次(見(jiàn)圖17)。生長(zhǎng)于ImMKNO3培養(yǎng)基中的對(duì)照植物將綠度更低，產(chǎn)生更少的生物量并在開(kāi)花期具有更小的穗。Gaspe衍生的品系將生長(zhǎng)到開(kāi)花階段，而常規(guī)近交系和雜交種將生長(zhǎng)到V4至V5階段。用統(tǒng)計(jì)學(xué)確定處理株之間所觀察到的差異是否是顯著差異。圖18示出了一種方法，該方法將字母放在數(shù)值后面。同一列中其后具有相同字母(不是字母組)的那些值不具有顯著的差異。使用該方法，如果在一列中的值的后面沒(méi)有字母，則該列中的任意這些值之間不存在顯著的差異，換句話(huà)講，該列中的所有這些值是均等的。與無(wú)效轉(zhuǎn)基因相比較，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)將導(dǎo)致植物在ImMKNO3中具有改善的植物生長(zhǎng)。因此生物量和綠度數(shù)據(jù)(如實(shí)施例17所述)將在取樣(Gaspe在開(kāi)花期，而其他的品系在V4-V5階段)時(shí)間采集，并與無(wú)效轉(zhuǎn)基因植物比較。此外，將在基本組織中分析植物中的總氮。在開(kāi)花期的生長(zhǎng)、綠度、氮積聚和穗大小的改善將指示氮利用效率提高。實(shí)施例19H有駘iifi寸的擬南芥前導(dǎo)某因(AT4G23900)的玉米品系的產(chǎn)量分析可通過(guò)直接轉(zhuǎn)化或者從單獨(dú)轉(zhuǎn)化的品系基因滲入而將含有驗(yàn)證過(guò)的擬南芥基因的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入玉米品系內(nèi)。可將轉(zhuǎn)基因植物(近交系或頂交種)進(jìn)行更強(qiáng)的基于田間的試驗(yàn)，以研究在不同環(huán)境條件(例如改變水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可利用性)下的產(chǎn)量增加和/或穩(wěn)定性。標(biāo)準(zhǔn)化的產(chǎn)量試驗(yàn)將通常包括4至6次重復(fù)，以及至少4個(gè)位置。將收集合并的收獲產(chǎn)量數(shù)據(jù)。可對(duì)產(chǎn)量進(jìn)行后續(xù)分析以確定含有驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的植株在與不含有驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的對(duì)照植株(無(wú)效構(gòu)建體或野生型)比較時(shí)，在不同環(huán)境條件下是否具有產(chǎn)量的改善?？稍诘{迫或水分脅迫環(huán)境下測(cè)量產(chǎn)量減少情況。包含驗(yàn)證過(guò)的擬南芥前導(dǎo)基因的植物具有相對(duì)于對(duì)照植物更少的產(chǎn)量損失，優(yōu)選50%更少的產(chǎn)量損失。實(shí)施例20測(cè)定玉米根構(gòu)造改變的測(cè)定法測(cè)定轉(zhuǎn)基因玉米植物在幼苗期、花期或成熟期的根構(gòu)造改變。測(cè)量玉米植物的根構(gòu)造改變的測(cè)定法包括但不限于下面概述的方法。為了便于手動(dòng)或自動(dòng)地測(cè)定根構(gòu)造改變，可讓玉米植物在透明的盆中生長(zhǎng)。1)根量(干重)。讓植物在Turface中生長(zhǎng)。將烘干的根和根組織稱(chēng)重并計(jì)算根/苗比率。2)側(cè)根分枝的水平。側(cè)根分枝的程度(如側(cè)根數(shù)量、側(cè)根長(zhǎng)度)通過(guò)這樣確定從完整的根系進(jìn)行二次取樣，將樣本用平面掃描器或數(shù)碼相機(jī)成像并用WinRHIZO軟件(RegentlnstrumentsInc.)分析。3)根帶寬度的測(cè)量。根帶是植物成熟時(shí)在溫室栽培盆的底部形成的根帶或根量。測(cè)量成熟時(shí)根帶的厚度(以mm為單位)，作為對(duì)根量的粗略評(píng)價(jià)。4)節(jié)生根的計(jì)數(shù)。從支持培養(yǎng)基(supportmedium)(如盆栽混合物(pottingmix))中分離出根后，可測(cè)定上部節(jié)位處出現(xiàn)的冠根數(shù)。另外，可測(cè)量冠根和/或支柱根的角度。對(duì)節(jié)生根和節(jié)生根的分枝量的數(shù)值分析形成對(duì)上述手動(dòng)方法的另一種延伸。對(duì)提取的有關(guān)根表型的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(通常為t檢驗(yàn))，以將轉(zhuǎn)基因根與非轉(zhuǎn)基因姊妹株植株的根進(jìn)行比較。在多個(gè)事件和/或構(gòu)建體涉及該分析的情況下，還可使用單因素方差分析。實(shí)施例21包含擬南芥ndk基因的玉米幼射艮ij來(lái)i不包含ndkgaa^i^ma^g的比較分近如實(shí)施例14A所述制備包含G0S2啟動(dòng)子和擬南芥ndk基因的玉米表達(dá)載體。如實(shí)施例14C所述經(jīng)由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，通過(guò)制備共合體載體(PHP29007)完成玉米轉(zhuǎn)化，并使用如實(shí)施例20所述的幼苗檢測(cè)分析法對(duì)根進(jìn)行檢測(cè)。在溫室實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)分析所有10個(gè)來(lái)自構(gòu)建體PHP29007(ZM-G0S2AT-NDK4)的事件，其中每個(gè)事件使9個(gè)植株在Turface培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至V4階段。種子來(lái)自Tl代(來(lái)自從TO植株收集的穗)。實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照是相同雜交玉米品系的15個(gè)植株，該植株不包含重組構(gòu)建體并生長(zhǎng)至相同階段。使用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)種植種子。在種植后19天收獲植株，此時(shí)它們達(dá)到V4階段。洗滌根部并從苗中分開(kāi)收集。在用分析天平稱(chēng)量干重之前，所有樣本進(jìn)行烘干。從表5中可以看到，據(jù)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照植物相比較，共4個(gè)事件的苗干重發(fā)生顯著改變，2個(gè)事件的根干重發(fā)生顯著改變。進(jìn)行t檢驗(yàn)分析以顯示每個(gè)轉(zhuǎn)基因事件和對(duì)照植物之間的顯著差異。顯示了每種特性的P值根干重、苗干重、以及根與苗的比率。粗體字指示轉(zhuǎn)基因植物具有比對(duì)照植物更高的值。具有小于0.1的P值的那些值用星號(hào)O指示。轉(zhuǎn)基因和對(duì)照幼苗的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>實(shí)施例22#_碰氮,禾口低復(fù)縫式。在2007季，在Johnston，Iowa的農(nóng)場(chǎng)中進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)包括表達(dá)由玉米G0S2啟動(dòng)子啟動(dòng)的擬南芥NDK4基因的十個(gè)(10)轉(zhuǎn)基因事件和兩個(gè)對(duì)照植物。一個(gè)對(duì)照植物由批雜交所有10個(gè)事件的非無(wú)效轉(zhuǎn)基因與無(wú)效轉(zhuǎn)基因組成。另一個(gè)對(duì)照植物由轉(zhuǎn)化中使用的野生型(不包含重組構(gòu)建體的相同雜交玉米品系)組成。所有植物是由常見(jiàn)近交系受試者生成的雜交玉米品系。施加兩次處理，其中植物在“標(biāo)準(zhǔn)”氮條件下或在氮“耗盡”條件下進(jìn)行處理?！皹?biāo)準(zhǔn)”處理包括以250磅每英畝的比率施加氮肥。氮“耗盡”條件通過(guò)在其中土壤含氮量已經(jīng)在以前多年的缺乏肥料條件下被作物耗盡的土地上種植轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩灼废但@得。氮耗盡與標(biāo)準(zhǔn)氮處理相比引起30%的產(chǎn)量減少，并且需要每英畝100磅的施肥比率。用2排小塊土地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其密度為每英畝32000株植物。在標(biāo)準(zhǔn)氮和氮耗盡處理中分別包括四次⑷和六次(6)重復(fù)。在2007年5月21日種植植物，并在2007年9月26日和27日一起收獲。以每英畝蒲式耳來(lái)測(cè)量產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)量數(shù)據(jù)在下表6中綜述?？傮w上，在低氮條件下的一個(gè)(1)事件和在標(biāo)準(zhǔn)氮條件下的四個(gè)(4)事件顯示與批無(wú)效轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锵啾?，產(chǎn)量顯著增加。在低氮條件下一個(gè)事件具有與對(duì)照植物相比的產(chǎn)量顯著減少。大部分測(cè)試的事件顯示產(chǎn)量比無(wú)效轉(zhuǎn)基因增加的正向趨勢(shì)。表6捕氮減賄縫T絲酬勿麵瓶式。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>權(quán)利要求在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物進(jìn)行比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。2.權(quán)利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。3.植物，所述植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含(a)可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(b)抑制DNA構(gòu)建體，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或()源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽，并且其中所述植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。4.權(quán)利要求3的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。5.權(quán)利要求3的植物，其中在不同的環(huán)境條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的所述對(duì)照植物比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的所述改變。6.權(quán)利要求5的植物，其中所述不同的環(huán)境條件為選自干旱、氮或病害中的至少一種。7.權(quán)利要求5的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。8.權(quán)利要求7的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。9.權(quán)利要求3的植物，其中所述至少一種農(nóng)學(xué)特性選自綠度、產(chǎn)量、生長(zhǎng)速率、生物量、成熟時(shí)的鮮重、成熟時(shí)的干重、果實(shí)產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實(shí)含氮量、種子含氮量、營(yíng)養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實(shí)游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、營(yíng)養(yǎng)組織游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實(shí)蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、氮脅迫耐受性、根倒伏、莖倒伏、植株高度、穗長(zhǎng)和收獲指數(shù)。10.權(quán)利要求9的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。11.權(quán)利要求3的植物，其中在與所述對(duì)照植物相比較時(shí)，所述植物表現(xiàn)出所述至少一種農(nóng)學(xué)特性的增強(qiáng)。12.權(quán)利要求11的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。13.改變植物根構(gòu)造的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；以及(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，并且在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。14.權(quán)利要求13的方法，所述方法還包括(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，并且在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。15.評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)所述轉(zhuǎn)基因植物的根構(gòu)造。16.權(quán)利要求15的方法，所述方法還包括(d)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(e)評(píng)價(jià)與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)所述子代植物的根構(gòu)造。17.評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)所述子代植物的根構(gòu)造。18.測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41,43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。19.權(quán)利要求18的方法，所述方法還包括(d)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(e)測(cè)定所述子代植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述測(cè)定步驟包括測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在不同的環(huán)境條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。21.權(quán)利要求19的方法，其中所述測(cè)定步驟(e)包括測(cè)定所述子代植物在不同的環(huán)境條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。22.測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(d)測(cè)定所述子代植物在與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述測(cè)定步驟包括測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在不同的環(huán)境條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。24.測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或()源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述測(cè)定步驟包括測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在不同的環(huán)境條件下與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。26.權(quán)利要求24的方法，所述方法還包括(d)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)測(cè)定所述子代植物在與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述測(cè)定步驟(e)包括測(cè)定所述子代植物在不同的環(huán)境條件下與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。28.測(cè)定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或()源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體，并且當(dāng)與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)測(cè)定所述子代植物在與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述測(cè)定步驟包括測(cè)定所述轉(zhuǎn)基因植物在不同的環(huán)境條件下與未包含所述重組DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。30.改變植物根構(gòu)造的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或()源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；以及(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體，并且其中當(dāng)與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)，所述轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。31.權(quán)利要求30的方法，所述方法還包括(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體，并且其中當(dāng)與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)，所述子代植物表現(xiàn)出改變的根構(gòu)造。32.評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體弓丨入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或()源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(c)評(píng)價(jià)與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)所述轉(zhuǎn)基因植物的根構(gòu)造。33.權(quán)利要求32的方法，所述方法還包括(d)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(e)評(píng)價(jià)與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)所述子代植物的根構(gòu)造。34.評(píng)價(jià)植物根構(gòu)造的方法，所述方法包括(a)將抑制DNA構(gòu)建體引入到可再生的植物細(xì)胞中，所述抑制DNA構(gòu)建體包含至少一種調(diào)控元件，所述調(diào)控元件可操作地連接至(i)以下序列的全部或部分(A)編碼多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43或51進(jìn)行比較時(shí)具有至少50%的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列；或()源自所關(guān)注的靶基因的有義鏈或反義鏈的全部或部分的區(qū)域，當(dāng)與所述區(qū)域所來(lái)源的有義鏈或反義鏈的全部或部分比較時(shí)，基于ClustalV比對(duì)方法，所述區(qū)域的核酸序列具有至少50%的序列同一性，并且其中所述所關(guān)注的靶基因編碼NDK或NDK樣多肽；(b)在步驟(a)之后，從可再生的植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；(c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述抑制DNA構(gòu)建體；以及(d)評(píng)價(jià)與未包含所述抑制DNA構(gòu)建體的對(duì)照植物比較時(shí)所述子代植物的根構(gòu)造。35.分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼NDK或NDK樣多肽的核酸序列或所述核酸序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)序列，所述多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對(duì)方法在與SEQIDNO25比較時(shí)具有至少80%的序列同一性，或在與SEQIDN0:23比較時(shí)具有至少85%的序列同一性，或在與SEQIDNO:21比較時(shí)具有至少90%的序列同一性，或在與SEQIDNO33比較時(shí)具有至少95%的序列同一性。36.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中基于Clustal比對(duì)方法，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO:25的氨基酸序列具有至少85%的序列同一性，或者與SEQIDNO:23的氨基酸序列具有至少90%的同一性，或者與SEQIDNO:21的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性。37.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中基于Clustal比對(duì)方法，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO25的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性，或者與SEQIDNO23的氨基酸序列具有至少95%的同一性。38.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中基于Clustal比對(duì)方法，所述多肽的氨基酸序列與SEQIDNO25的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性。39.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQIDN0:21、23、25或33。40.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中所述核酸序列包含SEQIDNO:20、22、24或32。41.包含權(quán)利要求35的多核苷酸的載體。42.包含權(quán)利要求35的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體，所述多核苷酸與至少一種調(diào)控序列可操作地連接。43.轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，所述方法包括用權(quán)利要求35的多核苷酸來(lái)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。44.包含權(quán)利要求42的重組DNA構(gòu)建體的細(xì)胞。45.用于生產(chǎn)植物的方法，所述方法包括用權(quán)利要求35的多核苷酸來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并從所述轉(zhuǎn)化過(guò)的植物細(xì)胞中再生出植物。在其他實(shí)施方案中，載體和重組構(gòu)建體包含任一前述的多核苷酸并且細(xì)胞包含所述重組構(gòu)建體。全文摘要本發(fā)明描述了尤其可用于改變植物的根構(gòu)造的分離的多核苷酸和多肽及重組DNA構(gòu)建體、包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(例如植物或種子)，以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接在植物中有功能的啟動(dòng)子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼可用于改變植物根構(gòu)造的多肽。文檔編號(hào)C12N9/12GK101815432SQ200880104809公開(kāi)日2010年8月25日申請(qǐng)日期2008年8月29日優(yōu)先權(quán)日2007年8月29日發(fā)明者D·托姆斯,G·塔拉米諾,H·薩凱,S·M·艾倫,S·V·廷蓋,S·拉克,牛小牧申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司;先鋒高級(jí)育種國(guó)際公司