專利名稱：皰疹病毒核苷酸還原酶的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗病毒特性的肽衍生物以及使用此衍生物治療病毒感染的方法。更特別地，本發(fā)明涉及顯示出抗皰疹病毒活性的肽衍生物(下文稱為“肽”)，含有此肽的藥物組合物以及使用此肽抑制皰疹病毒的復(fù)制并治療皰疹病毒感染的方法。
皰疹病毒給人和動(dòng)物帶來(lái)的疾病范圍很廣，例如單純性皰疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)可分別引起唇皰疹和生殖器損害；水痘帶狀皰疹病毒(VZV)會(huì)導(dǎo)致水痘和帶狀皰疹；Epstein-Barr病毒(EBV)會(huì)導(dǎo)致傳染性單核細(xì)胞增多癥。
在過(guò)去的二十年間，研究人員在研究新的治療劑以治療皰疹病毒感染的過(guò)程中，對(duì)已知為嘌呤和嘧啶核苷類似物的一類化合物傾注了最多的注意力。結(jié)果已將幾種核苷類似物開發(fā)成抗病毒劑。至今最成功的是無(wú)環(huán)鳥苷，它是治療人生殖器皰疹病毒感染的首選藥物。
然而，雖然有一些重大進(jìn)展，對(duì)治療皰疹病毒感染的有效、安全的治療劑的需要繼續(xù)存在。
為評(píng)論此領(lǐng)域最新的治療劑，可參看M.C.Nahata“抗病毒藥物藥物動(dòng)力學(xué)，副作用和治療作用”，J.Pharm.Technol.，3，100(1987)。
本申請(qǐng)公開了一組具有抗皰疹病毒活性的肽衍生物，這些肽有選擇地抗皰疹病毒的作用，結(jié)合寬限度的安全性使此肽成為對(duì)抗皰疹病毒感染的合乎需要的藥劑。
下列參考文獻(xiàn)公開了與抗皰疹病毒活性相關(guān)的肽或肽衍生物B.M.Dutia等，Nature，321，439(1986)，E.A.Cohen等，Nature，321，441(1986)，J.H.Subak-Sharpe等，英國(guó)專利申請(qǐng)2185024，于1987年7月8日公布，P.Gaudreau等，J.Biol.Chem.，262，12413(1987)，E.A.Cohen等，美國(guó)專利4,795,740，1989年1月3日，R.Freidinger等，美國(guó)專利4,814,432，1989年3月21日，V.M.Garskey等，美國(guó)專利4,837,304，1989年6月6日，R.Colonno等，美國(guó)專利4,845,195，1989年7月4日，P.Gaudreau等，J.Med.Chem.，33，723(1990)，J.Adams等，歐洲專利申請(qǐng)408,973，公布于1991年1月23日，P.L.Beaulieu等，歐洲專利申請(qǐng)411,332，公布于1991年2月6日，J.Adams等，歐洲專利申請(qǐng)411,333，公布于1991年2月6日，J.Adams等，歐洲專利申請(qǐng)411,334，公布于1991年2月6日，R.L.Tolman等，歐洲專利申請(qǐng)412,595，公布于1991年2月13日，W.T.Ashton等，歐洲專利申請(qǐng)438,873，公布于1991年7月31日，P.L.Beaulieu等，歐洲專利申請(qǐng)461,546，公布于1991年12月18日，P.Gaudreau等，J.Med.Chem.，35，346(1992)，R.Deziel和Y.Guindon，加拿大專利申請(qǐng)2,033,488，公布于1992年7月1日以及L.L.Chang等，Biorganic & Medicinal ChemistryLetters，2，1207(1992)。
通過(guò)特征結(jié)構(gòu)和生物學(xué)上的差異可將上述報(bào)告中有關(guān)的肽與本申請(qǐng)的肽區(qū)分開來(lái)。
下文中所用縮寫和符號(hào)在本申請(qǐng)“發(fā)明細(xì)節(jié)”這一節(jié)中有限定。
本發(fā)明的肽或其可用于治療的鹽由式1表示A-B-D-NHCH{CH2C(O)R1}C(O)-NHCH{CR2(R3)C(O)OH}C(O)-E1其中A是雙取代的低級(jí)鏈烷?；?，其中每個(gè)取代基分別選自包括苯基和單取代苯基的一組基團(tuán)，其中該單取代基選自低級(jí)烷基、鹵基、羥基和低級(jí)烷氧基；B是N(CH3)CHR4C(O)其中R4是低級(jí)烷基；D是NH-CHR5C(O)其中R5是低級(jí)烷基或被羧基、羥基、巰基或芐氧基單取代的低級(jí)烷基；R1是低級(jí)烷基、低級(jí)環(huán)烷基、{1-(低級(jí)烷基)-(低級(jí)環(huán)烷基)}，或NR6R7其中R6是氫或低級(jí)烷基而R7是低級(jí)烷基，或者R6和R7與它們共用的氮原子一起形成1-吡咯烷基(Pyrrolidino)、哌啶子基(Piperidino)、嗎啉代(morpholino)或4-甲基1-哌嗪基(4-methylpiperazino)；R2是氫或低級(jí)烷基而R3是低級(jí)烷基，或R2和R3與它們共用的碳原子一起形成低級(jí)環(huán)烷基；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低級(jí)環(huán)烷基；被低級(jí)烷基或(低級(jí)烷基)-(低級(jí)環(huán)烷基)單取代或雙取代的低級(jí)環(huán)烷基；或E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基、低級(jí)環(huán)烷基或(低級(jí)環(huán)烷基)-(低級(jí)烷基)而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是低級(jí)烷基；一組優(yōu)選的本發(fā)明肽或其可用于治療的鹽由式1表示，其中A是被苯基、4-(低級(jí)烷基)苯基、4-鹵苯基或4-(低級(jí)烷氧基)苯基雙取代的低級(jí)烷?；籅是(N-Me)Val、(N-Me)Ile或(N-Me)Tbg；D是(S)-2-氨基-3-羥基-3-甲基丁酸或(R)-2-氨基-3-巰基-3-甲基丁酸的氨基酸殘基或者是選自Val、Ile和Tbg的氨基酸殘基；R1是低級(jí)烷基、低級(jí)環(huán)烷基、{1-(低級(jí)烷基)-(低級(jí)環(huán)烷基)}、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或嗎啉代；R2和R3如上文所定義；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低級(jí)環(huán)烷基；被低級(jí)烷基單取代或雙取代的低級(jí)環(huán)烷基；或(低級(jí)烷基)-(低級(jí)環(huán)烷基)；或者E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基或(低級(jí)環(huán)烷基)甲基而Z如上文所定義；一組更優(yōu)選的肽或其可用于治療的鹽由式1表示，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙?；?、2-{(4-氟苯基)-甲基}-3-(4-氟苯基)丙酰基、2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-苯丙酰基或2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-(4-甲氧苯基)丙酰基；B是(N-Me)-Val或(N-Me)-Ile；D是Val、Ile或Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1，1-二甲基丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、1-甲基環(huán)戊基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或嗎啉代；R2是氫而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基或丙基，承載R2和R3的碳原子是(R)-構(gòu)型，或者R2和R3各自獨(dú)立地是甲基或乙基，或者R2和R3與它們共用的碳原子一起形成環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1(R)，2，2-三甲基丁基、1(R)，3，3-三甲基丁基、1(R)-乙基-3，3-二甲基或環(huán)己基甲基；或者E是NHCH(R9)-Z，其中承載R9的碳原子是(S)-構(gòu)型，R9是1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、2，2-二甲基丙基或環(huán)己基甲基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基；一組最優(yōu)選的肽或其可用于治療的鹽由式1表示，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙酰基；B是(N-Me)Val；D是Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、1-甲基環(huán)戊基、1-吡咯烷基或嗎啉代；R2是氫而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基或丙基，承載R2和R3的碳原子是(R)-構(gòu)型，或者R2和R3各自獨(dú)立地是甲基或乙基，或者R2和R3與它們共用的碳原子一起形成環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)，2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基或1(R)-乙基-3，3-二甲基丁基，或者E是NHCH(R9)-Z，其中承載R9的碳原子是(S)-構(gòu)型，R9是2，2-二甲基丙基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基。
包括在本發(fā)明范圍中的是含有抗皰疹病毒有效量的式1所示的肽或其可用于治療的鹽的藥物組合物以及可藥用或可獸醫(yī)用載體。
還包括在本發(fā)明范圍中的是含有式1所示的肽或其可用于治療的鹽的化妝品組合物以及適于表面施用的生理上可接受的載體。
本發(fā)明重要的一個(gè)方面包括通過(guò)給哺乳動(dòng)物施用抗皰疹病毒有效劑量的式1所示的肽或其可用于治療的鹽以治療哺乳動(dòng)物皰疹病毒感染的方法。
本發(fā)明另一個(gè)重要的方面包括通過(guò)將該病毒與皰疹病毒核苷酸還原酶抑制劑量的式1所示的肽或其可用于治療的鹽接觸以抑制皰疹病毒復(fù)制的方法。
另一個(gè)重要方面包括通過(guò)給哺乳動(dòng)物聯(lián)合施用抗皰疹病毒有效劑量的式1所示的肽或其可用于治療的鹽以及抗病毒的核苷類似物以治療皰疹病毒感染的方法。含有此聯(lián)合的藥物組合物也在本發(fā)明的范圍中。
制備式1所示的肽的方法在下文中描述。
可選擇地，式1可表示為 關(guān)于氨基酸或氨基酸衍生物的“殘基”一詞是指相應(yīng)的α-氨基酸通過(guò)脫去羧基上的羥基和α-氨基上的一個(gè)氫而得到的基團(tuán)。
通常這里用來(lái)標(biāo)明氨基酸和保護(hù)基團(tuán)的縮寫是根據(jù)生物化學(xué)命名IUPACIUB委員會(huì)的建議，見European Journal of Biochemistry138，9(1984)。例如Val、Ile、Asp和Leu分別表示L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-天冬氨酸和L-亮氨酸殘基。
存在于式1肽的主要直鏈軸(即，主鏈)中的不對(duì)稱碳原子。排除末端基團(tuán)A和(E的)Z、但包括承載“R9”的碳原子(當(dāng)E在文中被定義為NHCH(R9)-Z時(shí))，具有S構(gòu)型。
存在于氨基酸或衍生的氨基酸殘基側(cè)鏈的不對(duì)稱碳原子、末端基團(tuán)A以及當(dāng)E如本文定義表示為NHR8時(shí)的末端基團(tuán)E的不對(duì)稱碳原子可以是S或R構(gòu)型。
符號(hào)“Tbg”表示(S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酸的氨基酸殘基。符號(hào)“γMeleu”表示(S)-2-氨基-4，4-二甲基戊酸的氨基酸殘基。符號(hào)“γMeleucinol”表示從α-氨基上脫去一個(gè)氫后的(S)-2-氨基-4，4-二甲基戊醇。
本文所用的另一些符號(hào)是(N-Me)Val是(S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-丁酸的殘基；(N-Me)Ile是(S)-3-甲基-2-(甲基氨基)-戊酸的殘基；(N-Me)Tbg是(S)-2-(甲基氨基)-3，3-二甲基丁酸的殘基；Asp(cyBu)是(S)-α-氨基-1-羧基環(huán)丁烷乙酸的殘基；Asp(cyPn)是(S)-α-氨基-1-羧基環(huán)戊烷乙酸的殘基；而Asp{(R)-Me}是3-(R)-甲基-L-天冬氨酸的殘基(即，{S-(R*，S*)}-2-氨基-3-甲基丁二酸)。
本文所用的“鹵基”一詞是指選自溴、氯、氟或碘的鹵基。
本文所用的“低級(jí)烷?；笔侵负?至6個(gè)碳原子的直鏈1-氧代烷基(1-oxoalkyl)或者含有4至6個(gè)碳原子的支鏈1-氧代烷基；例如，乙?；?、丙?；?1-氧代丙烷)和2-甲基-1-氧代丙烷。
本文所用的“(4-9C)烷基”一詞是指含有4至9個(gè)碳原子的直鏈和支鏈烷基，包括例如1-甲基丙基、2-甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、3，3-二甲基丁基、1-乙基-2，2-二甲基-丁基和4，4-二甲基戊基。
本文所用的“低級(jí)烷基”一詞，無(wú)論是單獨(dú)的或與其它基團(tuán)聯(lián)合，都是指含有1到6個(gè)碳原子的直鏈烷基和含有3至6個(gè)碳原子的支鏈烷基，包括甲基、乙基、丙基、丁基、己基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基和1，1-二甲基乙基。
本文所用的{1-(低級(jí)烷基)-(低級(jí)環(huán)烷基)}一詞是指在位置1處帶有低級(jí)烷基取代基的低級(jí)環(huán)烷基；例如1-乙基環(huán)丙基、1-丙基環(huán)戊基和1-丙基環(huán)己基。
本文所用的“低級(jí)環(huán)烷基”一詞，無(wú)論是單獨(dú)的或是與其它基團(tuán)聯(lián)合，都是指含有3至6個(gè)碳原子的飽和環(huán)烴基，包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。
本文所用的“低級(jí)烷氧基”一詞是指含有1至4個(gè)碳原子的直鏈烷氧基和含有3至4個(gè)碳原子的支鏈烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基和1，1-二甲基乙氧基，后一基團(tuán)即通常所知的叔丁氧基。
本文所用的“可藥用載體”或“可獸醫(yī)用載體”是指無(wú)毒的、通常為活性成分的惰性賦形劑，它對(duì)該成分不造成不利影響。
本文所用的“生理上可接受的載體”一詞是指含一種或多種無(wú)毒賦形劑的可接受的化妝品賦形劑，它不與其中所含的有效成分反應(yīng)，或不會(huì)降低有效成分的效能。
本文所用的“可獸醫(yī)用載體”是指含有一種或多種無(wú)毒藥用可接受賦形劑、供給家養(yǎng)動(dòng)物施用藥物的生理上可接受的賦形劑，它不與藥物反應(yīng)或不降低藥物的效能。
“有效劑量”一詞是指預(yù)定的抗病毒劑的抗病毒劑量，即足夠有效抗御體內(nèi)病毒有機(jī)體的藥劑用量。
本文所用的“連接劑”一詞是指能夠使氨基酸或肽的游離羧基與另一氨基酸或肽的游離氨基的脫水連接，從而在反應(yīng)物之間形成酰胺鍵的試劑。同樣，這種試劑可使酸和醇連接，從而形成相應(yīng)的酯。此試劑通過(guò)激活羧基來(lái)促進(jìn)脫水連接或使其易于發(fā)生。對(duì)這種連接劑和激活基團(tuán)的描述可見于肽化學(xué)的一般課本中例如，E.Schroder和K.L.Lubke，“The Peptides”，Vol.l，AcademicPress，New York，N.Y.，1965，pp2-128，和K.D.Kopple，“Peptides and Amino acids”，W.A.Benjamin，Inc.，New York，N.Y.，1966，pp33-51。連接劑的例子有二苯基磷?；B氮化物、1，1-羰基二咪唑、二環(huán)己基碳化二亞胺、N-羥基丁二酰胺、或者在二環(huán)己基碳化二亞胺存在時(shí)的1-羥基-苯并三唑。很實(shí)用的連接劑是(苯并三唑-1-基氧)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽，由B.Castro等人描述，見Tetrahedron Letters，1219(1975)，也可見于D，Hudson，J.Org.Chem.，53，617(1988)，它可獨(dú)自使用，或也可在1-羥基苯并三唑存在下使用。另一個(gè)很實(shí)用的連接劑是可購(gòu)于市場(chǎng)的2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸鹽。
制備式1肽的方法可結(jié)合普通的肽的合成方法，如傳統(tǒng)的液相連接氨基酸殘基和/或肽片段的方法。這種方法的描述例見以上提及的教科書系列，E.Schroder和K.Lubke.“The PeptidesAna-lysis，Synthesis，Biology”，E.Gross等人，Eds.，AcademicPress，New York，N.Y.，1979-1987，卷1至8，和J.M.Stewart和J.D.Young“Solid Phase Peptide Synthesis”，2nd ed.，PierceChem.Co.，Rockford，IL，USA，1984。
以上提及的肽的制備方法的普遍特征是用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)各個(gè)氨基酸殘基或衍生的氨基酸殘基(或者，如有必要，為此肽的非肽片段)的活性側(cè)鏈基團(tuán)，此保護(hù)基團(tuán)可避免在此位點(diǎn)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)直至它最終離開。對(duì)氨基酸或片段的α-氨基的保護(hù)也很普遍，其時(shí)本體在羧基的位置處反應(yīng)，然后通過(guò)選擇性地除去α-氨基保護(hù)基團(tuán)以允許此位置處后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行。另一個(gè)普遍的特征是用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)最先保護(hù)氨基酸殘基或肽片段的C-末端羧基，如果它存在即會(huì)成為肽的C-末端，保護(hù)基團(tuán)會(huì)防止在此位點(diǎn)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，直至所需肽的序列被合成完畢后保護(hù)基團(tuán)被除去時(shí)。
因此，一般來(lái)說(shuō)，式1的肽可通過(guò)逐步連接來(lái)制備，并應(yīng)按照肽的氨基酸或衍生的氨基酸殘基序列，以及肽的非肽片段(如主要中間體)的序列次序連接，如有必要需適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)，如果此保護(hù)存在，在逐步連接完成后還需除去所有的保護(hù)基團(tuán)，然后就可得到式1的肽，在下文的實(shí)施例中將闡明更具體的方法。
大多數(shù)中間體以及制備它們的方法已被J.Adams等描述，見歐洲專利申請(qǐng)411332，于1991年2月6日公布，J.Adams等，歐洲專利申請(qǐng)411,334，于1991年2月6日公布，以及R.Deziel和Y.Guindon，加拿大專利申請(qǐng)2,033,448，于1992年7月1日公布。
制備本發(fā)明肽的N-末端所必需的被苯基或單取代的苯基雙取代的低級(jí)鏈烷酸是已知的或可通過(guò)已知方法制備。例如，可參閱L.L.Chang等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，21207(1992)，二苯乙酸已被M.R.Dolique描述，Ann.Chim.(Paris)，15(10)，425(1931)，也被F.Krollpfeiffer和A.Rosenberg描述于Chem.Ber.，69 465(1936)。
本發(fā)明的式1的肽可以藥用可接受鹽的形式獲得。在一特定的肽中有一殘基有堿的功能的情況下，此堿的鹽是那些與有機(jī)酸，例如乙酸、乳酸、琥珀酸、甲磺酸或P-甲苯磺酸，以及聚合酸，如單寧酸或羧甲基纖維素生成的鹽，也有與無(wú)機(jī)酸如氫鹵酸，如氯化氫、或硫酸、或磷酸生成的鹽。如有必要，可通過(guò)R.A.Boissonnas等，在Helv.Chim.Acta，43，1849(1960)中描述的、經(jīng)過(guò)適當(dāng)離子交換樹脂處理的方法，將特定的酸加成鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N酸加成鹽，如無(wú)毒、可藥用的鹽。
在一特定的肽具有一個(gè)或多個(gè)自由羧基的情況下，這種羧基的鹽是那些與鈉、鉀或鈣陽(yáng)離子，或與有機(jī)堿如三乙胺或N-甲基嗎啉所生成的鹽。
可通過(guò)生物化學(xué)、微生物學(xué)和生物學(xué)方法證實(shí)式1肽對(duì)單純性皰疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)，以及其它皰疹病毒，例如水痘帶狀皰疹病毒(VZV)和Epstein-Barr病毒(EBV)復(fù)制的抑制作用。
在下文實(shí)施例中，描述了作為范例的式1所示的肽對(duì)皰疹病毒核苷酸還原酶的抑制作用。值得注意的是，與對(duì)皰疹病毒核苷酸還原酶的特殊抑制有關(guān)的是此肽對(duì)正常細(xì)胞復(fù)制所需的細(xì)胞核苷酸還原酶活性影響相對(duì)較小或不存在影響。
證實(shí)式1肽對(duì)病毒復(fù)制的抑制效果的方法是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；可參閱，如R.Deziel和Y.Guindon，加拿大專利申請(qǐng)2,033,488，于1992年7月1日公布。
此肽的治療效果可用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物證明，例如，可使用C.R.Brandt等在J.Virol.Meth.，36,209(1992)中描述的、基于被單純性皰疹病毒引發(fā)了眼病的鼠模型測(cè)定方法來(lái)進(jìn)行。
當(dāng)本發(fā)明的肽或它的可藥用鹽的一種被當(dāng)作抗病毒劑使用時(shí)，它可以局部地或全身地施用給溫血?jiǎng)游铮缛?、豬或馬，其賦形劑含有一種或多種藥用可接受載體，它的比例取決于此肽的可溶性和化學(xué)性質(zhì)、所選擇的施用途徑以及標(biāo)準(zhǔn)的生物學(xué)操作。局部施用時(shí)，此肽可在含有0.1至5％，優(yōu)選0.5至2％的活性劑的可藥用賦形劑中成形。這種成形的形式可以是溶液、乳劑或洗劑。
全身施用時(shí)，式1肽可通過(guò)靜脈、皮下或肌肉內(nèi)注射中的任一種施用，其組分中含有可藥用賦形劑或載體。當(dāng)注射施藥時(shí)，優(yōu)選使用無(wú)菌水溶液載體中的肽，此溶液中還可含有其它溶質(zhì)，例如緩沖液或防腐劑以及足夠量的可藥用鹽類或葡萄糖以使此溶液等滲。
以上提到的成形所用的適當(dāng)賦形劑或載體在一般的藥學(xué)教科書中有所描述，例“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，18thed，Mack Publishing Company，Easton，Penn.，1990。
此肽的劑量隨施用的方式和所選擇的特殊的活性劑的不同而不同，而且還隨所治療的特定宿主的不同而不同。通常治療以小增量開始直至達(dá)到此情況下的最佳效果。一般此肽最合乎需要的施用濃度水平是一般能夠保證抗病毒的效果同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致任何有害或有毒的副作用。
至于局部使用，此肽以適當(dāng)?shù)耐庥门浞绞┯糜隗w表受感染的皮膚區(qū)域，例如皮膚或口腔的一部分或生殖器腔，所用劑量應(yīng)足以履蓋受感染的區(qū)域。治療應(yīng)該重復(fù)進(jìn)行，例如每四至六小時(shí)一次直至損害被治愈。
至于全身施用，式1肽施用的劑量為每公斤體重每天10μg至500μg，盡管上述差異也會(huì)存在。然而為了達(dá)到效果，最合乎需要的使用劑量水平處于每公斤體重每天約10μg至200μg的范圍之中。
本發(fā)明的另一方面包括化妝品組合物，它含有皰疹病毒預(yù)防劑量的式1肽，或者它的治療用可接受鹽，同時(shí)還含有生理上可接受的化妝品載體。配方中還可包括附加成分，例如皮膚軟化劑。本發(fā)明的化妝品配方被用來(lái)預(yù)防皮膚皰疹病毒損害的發(fā)生。此配方可每晚施用于皮膚的易感區(qū)域。通常，化妝品組合物所含的肽比相應(yīng)的局部使用的藥物組合物中的肽要少?；瘖y品組合物中肽的優(yōu)選的量的范圍是重量的0.01％至0.2％。
盡管上述公開的配方被證明是治療皰疹病毒感染有效而相對(duì)安全的藥物，但并不排除這些配方與其它抗病毒藥物或試劑一起施用會(huì)得到更好效果的可能性。這些其它的抗病毒藥物或試劑包括抗病毒的核苷，例如無(wú)環(huán)鳥苷，以及抗病毒的表面活性劑或抗病毒的干擾素，如由S.S.Asculai和F.Rapp，1985年3月26日公開于美國(guó)專利4,507,281中。
有關(guān)通過(guò)同時(shí)施用來(lái)治療皰疹病毒感染的更具體的情況是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗病毒的核苷類似物經(jīng)與式1肽聯(lián)合施用，其抗皰疹病毒的活性可被協(xié)同增強(qiáng)，而沒有相伴隨的毒作用的增強(qiáng)。因而，本文提供了治療哺乳動(dòng)物皰疹病毒感染的藥物組合物，它含有可藥用或可獸醫(yī)用的載體以及有效劑量的抗病毒的核苷類似物或其可藥用的鹽與可抑制核苷酸還原酶的式1肽或其可藥用鹽。
本文還提供了治療哺乳動(dòng)物皰疹病毒感染的方法。此方法包括給哺乳動(dòng)物施用抗皰疹病毒有效劑量的式1化合物或其可治療用鹽以及抗病毒的核苷類似物或其可治療用鹽。
組合物中的抗病毒核苷類似物可經(jīng)酶轉(zhuǎn)變成(體內(nèi))皰疹病毒DNA聚合酶的病毒DNA聚合酶抑制劑，和/或其可選擇的底物?？共《镜暮塑疹愃莆锟蛇x自已知的核苷類似物。本發(fā)明優(yōu)選的核苷類似物包括無(wú)環(huán)鳥苷及其類似物；例如式2的化合物及其可藥用鹽。 其中R11是氫、羥基或氨基，(當(dāng)R11是羥基時(shí)，式2表示無(wú)環(huán)鳥苷)。
根據(jù)本發(fā)明使用的其它優(yōu)選的抗病毒的核苷類似物包括阿糖腺苷(vidarabine)、碘苷(idoxuridine)、trifluridine、gangciclovir、edoxudine、brovavir、fiacitabine、penciclovir、famciclovir以及rociclovir。
“協(xié)同作用”一詞用于描述上述定義的核苷類似物和式1肽組合物的抗病毒或抗皰疹病毒活性時(shí)，意味著它的抗病毒或抗皰疹病毒的作用比所預(yù)料的組合物中兩個(gè)單獨(dú)成分相加的作用要大。
當(dāng)使用本發(fā)明的組合物治療皰疹病毒感染時(shí)，該組合物是在含有一種或多種可藥用載體的賦形劑中被施用給溫血?jiǎng)游?，例如人、豬或馬，其比例取決于核苷類似物和式1肽的可溶性以及化學(xué)特性、所選擇的施用途徑、標(biāo)準(zhǔn)的生物學(xué)操作，以及為提供協(xié)同抗病毒效果的兩種活性成分的相對(duì)量。該組合物最好局部施用，例如兩種活性成分(即抗病毒的核苷類似物以及式1肽，或它們的可治療用鹽)可在可藥用賦形劑中配制成溶液、乳濁液、乳劑或洗劑。這樣的配方可含有占重量0.01％至1.0％的核苷類似物或其可治療用的鹽，以及可含有占重量約0.05％至1％的式1肽或其可藥用鹽。
在任何情況下，存在于藥物組合物的兩種活性劑的量要能提供協(xié)同的抗皰疹病毒的作用。
以下實(shí)施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明，所給溫度是攝氏溫度，溶液百分含量或比率表示的是體積對(duì)體積的關(guān)系，除非有特別說(shuō)明。核磁共振光譜由Bruker200或400MHz分光計(jì)來(lái)記錄(開始時(shí)記下了400MHz的光譜)；化學(xué)移動(dòng)(δ)由每百萬(wàn)分之幾來(lái)表示。實(shí)施例中所用的縮寫包括Boc叔丁基氧化羰基；Bzl芐基；EtOH乙醇；EtOAc乙酸乙酯；Et2O乙醚；HPLC高效液相色譜；MeOH甲醇；THF四氫呋喃。實(shí)施例1連接反應(yīng)的一般步驟{也見R.Knorr等，Tetrahedron Letters，30，1927(1989)}將第一個(gè)反應(yīng)物，即游離的胺(或其鹽酸鹽)溶解于CH2Cl2或乙腈中，并將該溶液冷卻至4℃。在氮?dú)庀录尤?當(dāng)量的N-甲基嗎啉于攪拌著的溶液中。20分鐘后加入1當(dāng)量第二反應(yīng)物，即游離的羧酸以及1.05當(dāng)量的連接劑。針對(duì)此目的的實(shí)用而有效的連接試劑是(苯并三唑-1-基氧)三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽或優(yōu)選為2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸鹽。反應(yīng)由TLC監(jiān)測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)減壓蒸發(fā)掉CH2Cl2(或乙腈)，將殘留物溶于EtOAc，依次用1N檸檬酸水溶液、10％Na2CO3水溶液和鹽水洗滌溶液，將有機(jī)相干燥(MgSO4)、過(guò)濾并通過(guò)減壓濃縮成干品。根據(jù)Still的閃光色譜技術(shù){W.C.Still等，J.Org.Chem.，43，2923(1978)}，將殘留物經(jīng)硅膠(SiO2)純化。實(shí)施例2制備中間體H-Asp(cyPn)(Bzl)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl(a)(S)-α-疊氮基-1-{(苯甲氧基)羰基}-環(huán)戊烷乙酸此化合物由M.N.Aboul-Enein等人在Pharm.Acta Helv.，55，50(1980)中描述的2-氧螺[4，4]壬烷-1，3-二酮制備得到，所根據(jù)的是使用Evan氏輔助劑的不對(duì)稱疊氮化法，見D.A.Evans等，J.Amer.Chem.Soc.，112，4011(1990)。
更明確地說(shuō)，將丁基鋰的(469ml，750mmol)1.6M己烷溶液在氬氣下滴加至手性輔助劑、4(S)-(1-甲基乙基)-2-噁唑烷酮{96.8g，750mmol，由L.N.Pridgen和J.Prol.描述于J.Org.Chem.，54，3231(1989)}于-40℃下干THF中的溶液里，將混合物在-40℃下攪拌30分鐘，然后冷卻至-78℃，在冷卻的混合物中滴加2-氧螺[4，4]壬烷-1，3-二酮，再將此混合物在0℃下攪拌1小時(shí)。然后在混合物中加入20％(W/V)檸檬酸水溶液(600ml)。分離有機(jī)相，并用EtOAc抽提水相。結(jié)合的有機(jī)相經(jīng)鹽水洗滌、干燥(MgSO4)以及在減壓下濃縮可得到3-{2-(1-羧基-環(huán)戊基)-1-氧代乙基)}-4-(S)-(1-甲基乙基)-2-噁唑烷酮(Oxazolidinone)的粉紅色固體(300g)。
將所得到的固體(ca750mmol)溶解于乙腈中(1L)。在此溶液中加入芐基溴(128.3g，89.2ml，750mmol)和1，8-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]-十一碳-7-烯(114g，112ml，75mmol)，在氬氣下攪拌此混合物16小時(shí)。減壓除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘留物溶于H2O/EtOAc中。分離有機(jī)相，用10％(W/V)檸檬酸水溶液、鹽水洗滌，減壓干燥(MgSO4)并濃縮為干品可得到一油狀物。將此油狀物從己烷/EtOAc中結(jié)晶可得到相應(yīng)芐基酯的白色固體(204g，73％)。
將所得化合物(70g，187mmol)于干THF(200ml)中的溶液冷卻至-78℃。在15分鐘的期間內(nèi)在冷卻的溶液中加入含有6％(W/V)異丙基苯的0.66M鉀1，1，1，3，3，3-六甲基二硅氮烷(286ml，189mmol)的THF溶液。將該混合物在-78℃下攪拌45分鐘。在冷的混合物中加入一份于干THF(100ml)中的2，4，6-三異丙基苯磺酰疊氮化物(67g，216mmol)溶液，2分鐘后再加入冰醋酸(50ml，860mmol)。將該混合物在35-45℃下保溫并攪拌1小時(shí)。減壓除去揮發(fā)性物質(zhì)。用己烷/EtOH(4∶1，1.7L)研制黃色殘留物。用濾膜收集所得白色固體。將濾過(guò)液與SiO2混合(230-240目)。減壓除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘留固體在35℃下減壓干燥以除去異丙基苯。然后再將殘留固體置于SiO2柱上。用己烷-EtOAc(9∶1)洗脫殘留的固體和SiO2，濃縮洗脫液即可得到3-{{2(S)-疊氮基-1-氧代-2-{1-{(苯甲氧基)-羰基}環(huán)戊基}-乙基}-4(S)-(1-甲基乙基)-2-噁唑烷酮(66g，86％)。
將所得化合物(13.42g，32.4mmol)于THF/H2O(3∶1，608ml)中的溶液冷卻至0℃。在冷卻的溶液中加入過(guò)氧化氫/H2O(3∶7，16.3ml，518mmol的H2O2)，再加入LiOH·H2O(2.86g，68.2mmol)。
將混合物在0℃攪拌45分鐘，再用10％(W/V)的亞硫酸鈉水溶液(400ml)使之驟冷。加入NaHCO3(1.93g)后，減壓濃縮此混合物。通過(guò)持續(xù)抽提(NaHCO3水溶液/氯仿)20小時(shí)可得到手性輔助劑。然后將水相冷卻至0℃，通過(guò)加入濃HCl使之變?yōu)樗嵝裕儆肊tOAc抽提。
將抽提物用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)并減壓濃縮就能得到所需化合物的白色固體(8.2g，84％)。該化合物的1H NMR(CDCl3)顯示δ1.6-1.8(m，5H)，1.95-2.05(m，2H)，2.20-2.30(m，1H)，4.55(s，1H)，5.12(s，2H)和7.4(m，5H)。
該化合物用于本實(shí)施例的(C)部分。(b)NH2-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzL根據(jù)A.Gian-nis和K.Sandhoff，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，28，218(1989)中的方法，用LiBH4/Me3SiCl還原H-γMeLeu-OH可得氨基醇NH2-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OH。將所得化合物(812mg，6.2mmol)與三乙胺(659mg，6.51mmol)及二叔丁基碳酸氫鹽(1.42g，6.51mmol)于干THF(15ml)中的混合物在氮?dú)庀隆?℃時(shí)攪拌15分鐘，再于室溫下攪拌4小時(shí)。減壓使THF揮發(fā)。將殘留物溶于EtOAc。將該溶液用10％檸檬酸水溶液、5％NaHCO3水溶液及鹽水洗滌。將有機(jī)相干燥(MgSO4)，并在減壓下濃縮成干品。殘留物用閃光色譜法純化(SiO2，洗脫劑己烷-EtOAc，2∶1)可得到Boc-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OH(1.23g，86％)。
將四丁銨亞硫酸鹽(106mg)和50％NaOH水溶液(3ml)依次加入Boc-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OH(1.23g，5.35mmol)于芐基氯(13ml)的溶液中。將所得混合物在35-40℃下攪拌90分鐘，用EtOAc稀釋，用H2O和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)有機(jī)相并通過(guò)減壓除去揮發(fā)性物質(zhì)。將殘留物溶于己烷。把該溶液倒在SiO2柱上。用己烷洗脫柱子以除去芐基氯，再用己烷-EtOAc(2∶1)洗脫可得到Boc-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl。所得化合物的1H NMR(CDCl3)顯示δ0.95(s，9H)、1.42(s，9H)、1.30-1.55(m，2H)、3.42(d.J＝4Hz，2H)、3.88(broad，1H)、4.54(m，3H)、7.23-7.4(m，5H)。將所得化合物(1.28g，3.99mmol)溶于6N HCl/二烷中(10ml)。
將該溶液在氮?dú)庀隆?℃時(shí)攪拌45分鐘。將溶劑揮發(fā)可得到所需化合物的鹽酸鹽(1.05g)。此化合物在本實(shí)施例的下一步驟中不需進(jìn)一步純化即可使用。(c)本實(shí)施例的標(biāo)題化合物按照實(shí)施例1的連接步驟，使用上一部分的NH2-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl的鹽酸鹽作為第一反應(yīng)物，本實(shí)施例(a)部分的(S)-α-疊氮基-1-{(苯甲氧基)羰基}-環(huán)戊烷乙酸作為第二反應(yīng)物即可得到N-{(S)-1-芐氧甲基-3，3-二甲基-丁基}-(S)-α-疊氮基-1-{(苯甲氧基)羰基}-環(huán)戊烷乙酰胺。根據(jù)N.Maiti等、Tetrahedron Letters，27，1423(1986)中的方法，用溶于MeOH中的氯化錫(II)還原所得化合物即可得到本實(shí)施例的標(biāo)題化合物。該化合物的1H NMR(CDCl3)顯示δ0.98(s，9H)、1.22-2.25(m，12H)、3.4(d.J＝4Hz，2H)、3.64(s，1H)、4.18(broad m，1H)、4.52(s，2H)、5.12(s，2H)、7.18(d，J＝7Hz，1H)、7.22-7.38(broad m，10H)。實(shí)施例3制備(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-γMeleucinol(式1，A＝2-(苯甲基)-3-苯丙酰基，B＝N-Me-Val，D＝Tbg，R1＝1-吡咯烷基，R2和R3和與它們結(jié)合的碳原子一起形成環(huán)戊基，而E＝NHCH(R9)-Z其中R9是2，2-二甲基丙基，Z＝CH2OH)(a)制備中間體Boc-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)(Bzl)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl根據(jù)P.L.Beaulieu等在1991年12月18日的歐洲專利申請(qǐng)461,546中的描述，按照實(shí)施例1中的連接步驟，將實(shí)施例2的標(biāo)題化合物(第一反應(yīng)物)與Boc-Asp(1-吡咯烷基)-OH(第二反應(yīng)物)相連接可得到Boc-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl。依次將所得化合物脫保護(hù)(6N HCl/二噁烷，45分鐘，4℃)并在類似條件下與Boc-Tbg-OH相連接可得到Boc-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-NH-(S)-CH{CH2C(CH3)3}CH2OBzl。隨后將所得化合物除去Boc保護(hù)基團(tuán)(6N HCl/二噁烷，4℃，45分鐘)可得到以其相應(yīng)鹽酸加成鹽形式存在的相應(yīng)的游離N-末端氨基衍生物。然后將所得氨基衍生物在類似條件下與Boc-(N-Me)-Val-OH相連接可得到所需的中間體。(b)制備標(biāo)題化合物將上述(a)部分的產(chǎn)物在6N HCl/二噁烷(4℃，45分鐘)中轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的游離N-末端氨基衍生物。將該氨基衍生物的鹽酸加成鹽(447mg，0.490mmol)溶解于CH2Cl2(1.5ml)中。在氮?dú)庀孪蛉芤褐屑尤隢-甲基嗎啉(200μl，1.83mmol)和二芐基乙?；?269mg，1.04mmol)。將混合物在室溫下攪拌7小時(shí)，然后減壓蒸發(fā)掉揮發(fā)性物質(zhì)。將殘留物溶于EtOAc中。依次用1N HCl水溶液、NaHCO3的飽和水溶液以及鹽水洗滌此溶液，干燥(MgSo4)并減壓濃縮。將殘留物溶于EtOH(5ml)中。在氫氣下(1大氣壓)，10％(W/V)Pd(OH)2/C(100mg)存在時(shí)，將溶液攪拌(磁力攪拌)22小時(shí)。在濾膜上收集催化劑，將濾過(guò)液濃縮成干品。將殘留物通過(guò)C-18反相柱HPLC純化，所使用的是乙腈和H2O的梯度，每種溶劑含有0.06％三氟乙酸，最終可得標(biāo)題化合物的白色固體(220mg)；1HNMR(DMSO-d6，400MHz，需說(shuō)明此化合物在DMSO中存在方式為4∶1的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體混合物)δ0.16(d，J＝6.5Hz，0.6H)、0.22(d，J＝6.5Hz，2.4H)、0.71(d，J＝6.5Hz，2.4H)、0.75(d，J＝6.5Hz，0.6H)、0.80(s，1.8H)、0.82(s，7.2H)、0.87(s，9H)、1.40-1.55(m，7H)、1.65-2.00(m，8H)、2.52-3.90(m，13H)、2.70(s，2.4H)、2.89(s，0.6H)、4.21(d，J＝9.5Hz，0.8H)、4.34(d，J＝9.5Hz，0.2H)、4.43(d，J＝11Hz，與來(lái)自較少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的信號(hào)相重疊，1H)，4.65-4.73(m，1H)、4.82(d，J＝10Hz，與來(lái)自較少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的信號(hào)相重疊，1H)、7.04-7.40(m，10.8H)、7.57(d，J＝8.5Hz，1H)、8.01(d，J＝10Hz，與來(lái)自較少的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的信號(hào)相重疊，1H)、8.25(d，J＝9.5Hz，0.2H)、8.30(d，J＝7.5Hz，0.8H)、8.51(d，J＝7.5Hz，0.2H)；FAB質(zhì)譜m/z939(M＋Na)+。實(shí)施例4制備一些典型的中間體以詳細(xì)描述式1肽的C-末端(a)NH2-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3在4，4-二甲基-3-戊酮(106g，0.928mol)、三乙胺(513ml，3.68mol)和(R)-α-甲芐胺(114g，0.940mol)于干苯(1L)的冷卻溶液內(nèi)加入苯(200ml)溶液中的TiCl4(50.5ml，0.459mol)，加入的速率應(yīng)使混合物的溫度低于10℃。然后將混合物在40℃機(jī)械攪拌3小時(shí)，冷卻至室溫并用硅藻土過(guò)濾。用Et2O洗滌硅藻土。濃縮合并的濾過(guò)液及洗液。將殘留物溶于無(wú)水MeOH(2L)中。將溶液冷卻至0℃。分批加入NaBH4(20g，0.53mol)，同時(shí)將混合物的溫度保持在5℃以下。加入約2ml10％HCl水溶液并蒸發(fā)掉MeOH。將殘留物溶于Et2O中。將溶液用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)至干品可得到帶紅色的油狀物(由NMR顯示出它為18∶1的非對(duì)映異構(gòu)體混合物)。用閃光色譜法純化此油狀物(SiO2、洗脫液EtOAc/己烷、7∶93)可得到N-(1(R)-苯乙基)-1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基胺的液體(110g，54％)。將此物質(zhì)溶于己烷(1.5L)中。在15分鐘的期間內(nèi)向溶液中加入于二噁烷中的6N HCl(90ml)。將所得白色固體收集在濾膜上，然后用己烷洗滌即可得到N-(1(R)-苯乙基)-1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基氯化氫(125g，97％)。1H NMR(CDCl3)δ0.55(t，J＝7.5Hz，3H)、1.14(s，9H)、1.54-1.95(m，2H)、2.23(d，J＝6.5Hz，3H)、2.36-2.44(m，1H)、4.31-4.49(m，1H)、7.30-7.48(m，3H)、7.74-7.79(m，2H)。
將溶于MeOH(120ml)中的所得化合物(41.5g)溶液與10％(W/W)Pd/C(4.0g)相混合，將混合物置于帕爾氫氣發(fā)生器上，在室溫下，50psi的氫氣中振蕩48小時(shí)。過(guò)濾混合物并濃縮濾過(guò)液即可得到所需NH2-(R)-CH(C2H5)C-(CH3)3的鹽酸加成鹽形式的白色固體(25g，100％)。1H NMR(CDCl3δ1.10(s，9H)、1.22(t，J＝7Hz，2H)、1.58-1.90(m，2H)、2.70-2.85(m，1H)、8.10-8.40(broad s，3H)。
在上述步驟中，以同樣的方式，只是用3，3-二甲基-2-丁酮取代4，4-二甲基-3-戊酮即可得到NH2-(R)-CH(CH3)C(CH3)3·HCl。實(shí)施例5對(duì)單純性皰疹病毒1型(HSV-1)的核苷酸還原酶的抑制作用(a)酶的制備根據(jù)E.A.Cohen等，J.Gen.Virol.，66，733(1985)的描述從被HSV-1F品系病毒感染的靜止期的BHK-21/C13細(xì)胞中可得到HSV-1核苷酸還原酶(部分被純化)，感染率為每個(gè)細(xì)胸10個(gè)噬菌斑形成單位。(b)測(cè)定P.Gaudreau等在J.Biol.Chem.，262，12413(1987)中描述的測(cè)定法被用來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物抑制HSV-1核苷酸還原酶的活力。結(jié)果表示為引起酶活性最大抑制50％(IC50)時(shí)的化合物濃度，根據(jù)酶制品的特殊活性，在每次測(cè)定中所用酶制品的單位數(shù)是不變的。該結(jié)果是相對(duì)于沒有待測(cè)化合物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中所得活性來(lái)說(shuō)的，代表它們之間相差不到10％的四次測(cè)定的平均值。
當(dāng)根據(jù)上述測(cè)定法評(píng)價(jià)實(shí)施例3中的(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-γMeLeucinol時(shí)，導(dǎo)致HSV-1核苷酸還原酶活性降低50％的化合物濃度，即IC50，為0.17μm。實(shí)施例6對(duì)單純性皰疹病毒2型(HSV-2)在細(xì)胞培養(yǎng)中復(fù)制的抑制測(cè)檢將BHK-21/C13細(xì)胞(ATCC CCL 10)在150cm2三角錐瓶(1.5×106個(gè)細(xì)胞/瓶)中培育兩天，所用培養(yǎng)基為加有8％(V/V)小牛血清(FBS.Gibco Canada Inc.)的α-MEM培養(yǎng)基(Gibco Canada Inc.，Burlington，Ontario，Canada)。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化再轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)板的新鮮培養(yǎng)基中以使每孔750μl的培養(yǎng)基中有2.5×105個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)6小時(shí)以使它們附著在培養(yǎng)板上。然后，用500μl加有0.5％(V/V)FBS的α-MEM將細(xì)胞洗滌一次，再用750μl同樣的培養(yǎng)基(低血清)培養(yǎng)3天。血清饑餓期過(guò)后，除去低血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞在500μl BBMT中培養(yǎng)2至3小時(shí){BBMT培養(yǎng)基由P.Brazeau等描述于Prac.Natl.Acad.Sci.USA，79，7909(1982)}。然后，在100μl BBMT培養(yǎng)基中用HSV-2感染細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)＝0.02空斑形成單位/細(xì)胞)(注所用HSV-2為HG-52品系，見Y.Lange-lier和G.Buttin，J.Gen.Virol.，57，21(1981)；該病毒被保存于-80℃下。)在37℃下進(jìn)行病毒吸收1小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，用BBMT(3×250μl)洗滌細(xì)胞。每孔中的細(xì)胞與或不與(對(duì)照)溶于200μl BBMT培養(yǎng)基中的適當(dāng)濃度的待檢測(cè)劑一起溫育。在37℃下培養(yǎng)29小時(shí)后，通過(guò)先在-80℃下冷凍培養(yǎng)板，再解凍來(lái)收獲被感染的細(xì)胞。由于融化的冰晶的作用，可將孔中的細(xì)胞從孔表面刮下來(lái)。解凍完成后，收集細(xì)胞懸浮液，用150μl BBMT培養(yǎng)基沖洗每個(gè)孔。將病毒樣品(懸浮液加上洗滌液)在4℃下輕微超聲處理4分鐘。通過(guò)離心(1000g，4℃，10分鐘)除去細(xì)胞碎片。收集上清液，保存于-80℃下直至測(cè)定病毒效價(jià)。
病毒的滴定是通過(guò)R.Deziel和Y.Guindon(前述文獻(xiàn))詳細(xì)描述的經(jīng)修改的比色測(cè)定法進(jìn)行的，比色測(cè)定法是經(jīng)M.Langlois等人描述于Journal of Biological Standardization，14，201(1986)。
因而，可測(cè)定不同濃度待檢測(cè)劑對(duì)病毒生長(zhǎng)抑制的百分率，并可計(jì)算出能達(dá)到病毒復(fù)制50％抑制的待檢測(cè)劑(即式1肽)的濃度，即EC50。
當(dāng)根據(jù)本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法來(lái)測(cè)定實(shí)施例3中的(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp(cyPn)-γMeLeucinol時(shí)，發(fā)現(xiàn)能達(dá)到HSV-1病毒復(fù)制的50％抑制的濃度，即EC50，為3μM。
根據(jù)本發(fā)明所用的式1化合物的其它特別的例子為(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
權(quán)利要求
1.式1肽或其可用于治療的鹽，A-B-D-NHCH{CH2C(O)R1}C(O)-NHCH{CR2(R3)C(O)OH}C(O)-E1其中A是雙取代的低級(jí)烷?；?，其中該每個(gè)取代基分別選自含有苯基和單取代苯基的一組基團(tuán)，其中該單取代基選自含有低級(jí)烷基、鹵基、羥基和低級(jí)烷氧基的一組基團(tuán)；B是N(CH3)CHR4C(O)其中R4是低級(jí)烷基；D是NH-CHR5C(O)其中R5是低級(jí)烷基或被羧基、羥基、巰基或芐氧基單取代的低級(jí)烷基；R1是低級(jí)烷基、低級(jí)環(huán)烷基、{1-(低級(jí)烷基)-(低級(jí)環(huán)烷基)}，或NR6R7其中R6是氫或低級(jí)烷基而R7是低級(jí)烷基，或者R6和R7與它們共用的氮原子一起形成1-吡咯烷基、哌啶子基、嗎啉代或4-甲基1-哌嗪基；R2是氫或低級(jí)烷基而R3是低級(jí)烷基，或R2和R3與它們共用的碳原子一起形成低級(jí)環(huán)烷基；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低級(jí)環(huán)烷基；被低級(jí)烷基或(低級(jí)烷基)-(低級(jí)環(huán)烷基)單取代或雙取代的低級(jí)環(huán)烷基；或E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基、低級(jí)環(huán)烷基或(低級(jí)環(huán)烷基)-(低級(jí)烷基)而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是低級(jí)烷基。
2.一種如權(quán)利要求1所述的肽或其可用于治療的鹽，其中A是被苯基、4-(低級(jí)烷基)苯基、4-鹵苯基或4-(低級(jí)烷氧基)苯基雙取代的低級(jí)烷酰基；B是(N-Me)Val、(N-Me)Ile、(N-Me)Tbg；D是(S)-2-氨基-3-羥基-3-甲基丁酸或(R)-2-氨基-3-巰基-3-甲基丁酸的氨基酸殘基或者是選自Val、Ile和Tbg的氨基酸殘基；R1是低級(jí)烷基、低級(jí)環(huán)烷基、{1-(低級(jí)烷基)-(低級(jí)環(huán)烷基)}、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或嗎啉代；R2和R3如權(quán)利要求1中所述；而E是NHR8其中R8是(4-9C)烷基；低級(jí)環(huán)烷基；被低級(jí)烷基單取代或雙取代的低級(jí)環(huán)烷基；或(低級(jí)烷基)-(低級(jí)環(huán)烷基)；或者E是NHCH(R9)-Z其中R9是(4-9C)烷基或(低級(jí)環(huán)烷基)甲基而Z如權(quán)利要求1中所述。
3.一種如權(quán)利要求2中所述的肽或其可用于治療的鹽，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙?；?、2-{(4-氟苯基)甲基}-3-(4-氟苯基)丙酰基、2-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-苯丙?；?-{(4-甲氧苯基)甲基}-3-(4-甲氧苯基)丙酰基；B是(N-Me)-Val或(N-Me)-Ile；D是Val，Ile或Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1，1-二甲基丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、1-甲基環(huán)戊基、N，N-二甲基氨基、N，N-二乙基氨基、1-吡咯烷基或嗎啉代；R2是氫而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基或丙基，承載R2和R3的碳原子是(R)-構(gòu)型，或者R2和R3各自獨(dú)立地是甲基或乙基，或者R2和R3與它們共用的碳原子一起形成環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1(R)，2，2-三甲基丁基、1(R)，3，3-三甲基丁基、1(R)-乙基-3，3-二甲基或環(huán)己基甲基；或者E是NHCH(R9)-Z，其中承載R9的碳原子是(S)-構(gòu)型，R9是1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、2，2-二甲基丙基或環(huán)己基甲基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基。
4.一種如權(quán)利要求3所述的肽或其可用于治療的鹽，其中A是2-(苯甲基)-3-苯丙?；籅是(N-Me)Val；D是Tbg；R1是1-甲基乙基、1，1-二甲基乙基、1-甲基丙基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、1-甲基環(huán)戊基、1-吡咯烷基或嗎啉代；R2是氫而R3是甲基、乙基、1-甲基乙基或丙基，承載R2和R3的碳原子是(R)-構(gòu)型，或者R2和R3各自獨(dú)立地是甲基或乙基，或者R2和R3與它們的共用碳原子一起形成環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基；而E是NHR8其中R8是2，2-二甲基丙基、1(R)，2，2-三甲基丙基、1(R)-乙基-2，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丁基或1(R)-乙基-3，3-二甲基丁基，或者E是NHCH(R9)-Z，其中承載R9的碳原子是(S)-構(gòu)型，R9是2，2-二甲基丙基而Z是CH2OH、C(O)OH、C(O)NH2或C(O)OR10其中R10是甲基、乙基或丙基。
5.一種如權(quán)利要求1所述的肽選自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
6.一種藥物組合物，包含抗皰疹病毒有效劑量的如權(quán)利要求1所述的肽或其可用于治療的鹽和可藥用或可獸醫(yī)用的載體。
7.一種如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中該肽選自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
8.一種化妝品組合物，包含權(quán)利要求1所述肽或其可用于治療的鹽以及適于局部施用的生理上可接受的載體。
9.一種治療哺乳動(dòng)物皰疹病毒感染的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用抗皰疹病毒有效劑量的如權(quán)利要求1所述的肽或其可用于治療的鹽。
10.一種如權(quán)利要求9的方法，其中該肽選自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
11.一種抑制皰疹病毒復(fù)制的方法，通過(guò)將病毒與皰疹病毒核苷酸還原酶抑制劑量的權(quán)利要求1所述肽或其可用于治療的鹽相接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)。
12.一種如權(quán)利要求11的方法，其中肽選自(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeu-OH，(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NHCH2C(CH3)3，以及(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-NH-(R)-CH(C2H5)C(CH3)3。
13.一種藥物組合物，包含可藥用或可獸醫(yī)用載體，以及有效劑量的抗病毒的核苷類似物或其可用于治療的鹽與可抑制核苷酸還原酶的如權(quán)利要求1所述的肽或其可用于治療的鹽。
14.一種如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中該核苷類似物是式2所示的化合物或其可用于治療的鹽 其中R11是氫、羥基或氨基。
15.一種如權(quán)利要求13的藥物組合物，其中該抗病毒核苷類似物是選自阿糖腺苷、碘苷、trifluridine、ganciclovir、edoxudine、brovavir、fiacitabine、penciclovir、famciclovir以及rociclovir。
16.一種治療哺乳動(dòng)物中皰疹病毒感染的方法，包括施用有效劑量的抗病毒核苷類似物或其可用于治療的鹽與可抑制核苷酸還原酶的如權(quán)利要求1的式1肽或其可用于治療的鹽的聯(lián)合。
17.一種如權(quán)利要求16的方法，其中該核苷類似物以及式1肽可依次施用或同時(shí)施用。
18.一種如權(quán)利要求16的方法，其中該組合物被局部施用。
19.一種如權(quán)利要求16的方法，其中抗病毒的核苷類似物選自無(wú)環(huán)鳥苷、6-脫氧無(wú)環(huán)鳥苷、2，6-二氨基-9-{(2-羥基乙氧基)甲基}嘌呤、阿糖腺苷、碘苷、trifluridine、gangciclovir、edoxudine、brovavir、fiacitabine、penciclovir、famciclovir以及rociclovir。
20.一種治療哺乳動(dòng)物中單純性皰疹病毒1型或2型感染的方法，包括施用有效劑量的如權(quán)利要求6的藥物組合物，其中該組合物中的肽是(PhCH2)2CHC(O)-(N-Me)-Val-Tbg-Asp(1-吡咯烷基)-Asp-(cyPn)-γMeLeucinol。
21.一種制備如權(quán)利要求1所述肽或其可用于治療的鹽的方法，包括a)按照肽的序列逐步連接氨基酸或衍生的氨基酸殘基以及此肽的非肽片段，其中i)將殘基或片段的活性側(cè)鏈基團(tuán)用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)以防止該位點(diǎn)化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，直至逐步連接完成后保護(hù)基團(tuán)最終被除去；ii)將連接反應(yīng)物的α-氨基基團(tuán)用α-氨基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，而該反應(yīng)物的游離羧基與第二反應(yīng)物的游離α-氨基基團(tuán)相連接；該α-氨基保護(hù)基團(tuán)為一個(gè)可被選擇性地除去的保護(hù)基，以使隨后的連接步驟可在此α-氨基基團(tuán)處發(fā)生；以及iii)將要成為被保護(hù)肽的C-末端的氨基酸殘基或肽片段的C-末端羧基，如果存在，需用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)以防止此位點(diǎn)化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，直至此肽合乎需要的氨基酸序列被組裝完畢；以及b)連接完成后，除去任何保護(hù)基團(tuán)以及，如有必要，使之進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化以得到如權(quán)利要求1所述的肽；以及如有必要將此肽轉(zhuǎn)變?yōu)槠淇捎糜谥委煹柠}。
全文摘要
此處公開了如式A-B-D-NHCH{CH
文檔編號(hào)C07K7/06GK1118601SQ94191343
公開日1996年3月13日 申請(qǐng)日期1994年2月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月3日
發(fā)明者羅伯特·德茲伊爾, 尼爾·莫斯 申請(qǐng)人:比奧-梅加/貝林格爾·英格海姆研究公司