欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

在基因組之間多核苷酸的直接轉(zhuǎn)移的制作方法

文檔序號(hào):9620339閱讀:637來(lái)源:國(guó)知局
在基因組之間多核苷酸的直接轉(zhuǎn)移的制作方法
【專利說(shuō)明】在基因組之間多核苷酸的直接轉(zhuǎn)移
[0001] 對(duì)序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式通過(guò)引用結(jié)合在此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明提供了用于將感興趣重組多核苷酸從原核供體細(xì)胞的染色體直接轉(zhuǎn)移至 其他物種的原核受體細(xì)胞的染色體中的方法,其中該感興趣多核苷酸包括至少一種感興趣 編碼序列,優(yōu)選為一種感興趣基因,以及選擇性標(biāo)記,其中該供體細(xì)胞的染色體中的所述感 興趣多核苷酸的每一側(cè)上的側(cè)翼為衍生自該受體細(xì)胞的染色體的多核苷酸區(qū)域,并且其中 這些側(cè)翼多核苷酸區(qū)域具有足夠的尺寸和序列一致性,以允許與在該受體細(xì)胞的染色體中 的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行雙同源重組。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 在工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域中,尤其是對(duì)于分泌的多肽,例如,酶,當(dāng)要克隆并篩選新的 基因時(shí),枯草芽孢桿菌是目前優(yōu)選的宿主微生物。這是因?yàn)樵撐锓N具有高轉(zhuǎn)化頻率和重組 頻率,其允許將基因快速并輕松的轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主中并且整合至其染色體中,便 于后續(xù)的篩選。
[0006] 眾所周知,這些高頻率還允許通過(guò)用染色體DNA簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)化將來(lái)自一個(gè)枯草芽孢 桿菌的基因輕松地轉(zhuǎn)移至另一個(gè)枯草芽孢桿菌中。然而,一旦在篩選過(guò)程中鑒別了感興趣 基因,枯草芽孢桿菌不一定是最優(yōu)選的表達(dá)宿主,并且,遺憾的是,通常很難并且繁瑣去將 染色體整合的異源DNA再進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至其他所希望用于工業(yè)表達(dá)的物種,例如,至地衣芽 孢桿菌宿主。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明允許在不同物種之間的異源染色體整合的多核苷酸的輕松的轉(zhuǎn)移。
[0009] 在以下實(shí)例中,我們成功地首次克隆了從地衣芽孢桿菌受體細(xì)胞至枯草芽孢桿菌 供體的足夠大的上游和下游側(cè)翼DNA區(qū)域,然后整合枯草芽孢桿菌供體中側(cè)翼DNA區(qū)域之 間的感興趣基因和選擇性標(biāo)記。隨后我們通過(guò)用來(lái)自枯草芽孢桿菌供體的染色體DNA來(lái)轉(zhuǎn) 化地衣芽孢桿菌受體,將感興趣基因轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌受體中,從而通過(guò)在來(lái)自枯草芽 孢桿菌供體的進(jìn)來(lái)的染色體DNA中的兩個(gè)側(cè)翼DNA區(qū)域與在地衣芽孢桿菌染色體中的相應(yīng) 的相同區(qū)域之間的同源重組,將該感興趣基因位點(diǎn)特異性地整合至地衣芽孢桿菌受體的染 色體中。
[0010] 這種技術(shù)可具有針對(duì)轉(zhuǎn)移較大感興趣多核苷酸(例如物種之間的操縱子或功能 性多基因簇)的具體相關(guān)性。
[0011]因此,在一個(gè)方面中,本發(fā)明涉及一種用于將感興趣重組多核苷酸從原核供體細(xì) 胞的染色體直接轉(zhuǎn)移至其他物種的原核受體細(xì)胞的染色體中的方法,其中該感興趣多核苷 酸包括至少一種感興趣編碼序列,優(yōu)選一種感興趣基因,以及選擇性標(biāo)記,其中該供體細(xì)胞 的染色體中的所述感興趣多核苷酸的每一側(cè)上的側(cè)翼為衍生自該受體細(xì)胞的染色體的多 核苷酸區(qū)域,并且其中這些側(cè)翼多核苷酸區(qū)域具有足夠的尺寸和序列一致性,以允許與在 該受體細(xì)胞的染色體中的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行雙同源重組;該方法包括以下步驟:
[0012] a)提供來(lái)自該供體細(xì)胞的染色體DNA,所述DNA包括該感興趣多核苷酸,該感興趣 多核苷酸的每一側(cè)上的側(cè)翼為衍生自該受體原核細(xì)胞的染色體的多核苷酸區(qū)域;
[0013] b)將該受體細(xì)胞用來(lái)自步驟(a)的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化;并且
[0014] c)選擇成功轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞,其中這種包括該選擇性標(biāo)記的感興趣多核苷酸已經(jīng) 被整合至該受體細(xì)胞的染色體中。
[0015] 優(yōu)選地,該選擇性標(biāo)記已經(jīng)在步驟(c)中通過(guò)在DNA的側(cè)翼區(qū)與它們的在該受體 細(xì)胞中的相應(yīng)染色體區(qū)域之間的同源重組而整合至染色體中。
[0016] 因此,在一個(gè)方面中,本發(fā)明涉及用于將感興趣重組多核苷酸從原核供體細(xì)胞的 染色體直接轉(zhuǎn)移至其他物種的原核受體細(xì)胞的染色體中的方法,該方法包括:
[0017] a)提供來(lái)自該供體細(xì)胞的染色體DNA,所述DNA包括該感興趣多核苷酸,該感興趣 多核苷酸的每一側(cè)上的側(cè)翼為衍生自該受體原核細(xì)胞的染色體的多核苷酸區(qū)域,并且所述 多核苷酸區(qū)域具有足夠尺寸和序列一致性,以允許與在該受體細(xì)胞的染色體中的相應(yīng)區(qū)域 進(jìn)行雙同源重組;
[0018] b)將該受體細(xì)胞用來(lái)自步驟(a)的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化;并且
[0019] c)選擇轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞,其中這種包括該選擇性標(biāo)記的感興趣多核苷酸已經(jīng)被整 合至該受體細(xì)胞的染色體中。
[0020] 在第二方面中,本發(fā)明涉及針對(duì)感興趣編碼活性進(jìn)行基因文庫(kù)篩選的方法,所述 方法包括以下步驟:
[0021] a)提供包括在其染色體中的感興趣多核苷酸的原核供體細(xì)胞,該感興趣多核苷酸 進(jìn)而包括基因文庫(kù)和選擇性標(biāo)記,其中所述感興趣多核苷酸的每一側(cè)上的側(cè)翼為衍生自另 一種物種受體原核細(xì)胞的染色體的多核苷酸區(qū)域,并且其中該側(cè)翼多核苷酸區(qū)域具有足夠 尺寸和序列一致性,以允許與在該受體細(xì)胞的染色體中的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行雙同源重組;
[0022] b)在編碼活性存在于該原核供體細(xì)胞的染色體中時(shí),針對(duì)該編碼活性對(duì)該基因文 庫(kù)進(jìn)行篩選,并且選擇感興趣的原核供體克隆,
[0023] c)提供來(lái)自步驟(b)的克隆細(xì)胞的染色體DNA ;
[0024] d)將該受體細(xì)胞用來(lái)自步驟(C)的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化;并且
[0025] e)選擇成功轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞,其中這種包括該選擇性標(biāo)記的感興趣多核苷酸已經(jīng) 被整合至該受體細(xì)胞的染色體中。
[0026] 優(yōu)選地,該選擇性標(biāo)記已經(jīng)在步驟(e)中通過(guò)在DNA的側(cè)翼區(qū)與它們的在該受體 細(xì)胞中的相應(yīng)染色體區(qū)域之間的同源重組而整合至染色體中。
[0027] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0028] -圖1示出了來(lái)自實(shí)例1的具有基因和引物位置的SOE-片段。
[0029] -圖2示出了來(lái)自實(shí)例3的具有基因和引物位置的SOE-片段。
[0030] -圖3示出了來(lái)自實(shí)例5的具有基因和引物位置的SOE-片段。
[0031] -圖4示出了具有針對(duì)實(shí)例5中SOE PCR的基因和引物位置的枯草芽孢桿菌 M0L3034ara 基因座;總大?。?8218bp。
[0032] -圖5示出了具有針對(duì)實(shí)例7中SOE PCR的基因和引物位置的枯草芽孢桿菌 M0L3041ara 基因座;總大?。?4889bp。
[0033] -圖6示出了具有針對(duì)實(shí)例9中SOE PCR的基因和引物位置的枯草芽孢桿菌 M0L3053ara~aprH 盒;總大小:17505bp。
[0034] -圖7示出了來(lái)自實(shí)例15的具有針對(duì)PCR驗(yàn)證的基因和引物位置的地衣芽孢桿菌 TaHy9轉(zhuǎn)化體。
[0035] -圖8示出了針對(duì)來(lái)自實(shí)例15的轉(zhuǎn)化體的PCR驗(yàn)證的PCR分析瓊脂糖凝膠電泳的 圖片。
[0036] -圖9示出了來(lái)自實(shí)例16的具有針對(duì)PCR驗(yàn)證的基因和引物位置的地衣芽孢桿菌 TaHy9轉(zhuǎn)化體。
[0037] -圖10示出了針對(duì)來(lái)自實(shí)例16的轉(zhuǎn)化體的PCR驗(yàn)證的PCR分析瓊脂糖凝膠電泳 的圖片。
[0038] 定義
[0039] 編碼序列:術(shù)語(yǔ)"編碼序列"意指直接指定一個(gè)多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編 碼序列的邊界一般由一個(gè)開(kāi)放閱讀框架決定,該開(kāi)放閱讀框架從一個(gè)起始密碼子(如ATG、 GTG或TTG)開(kāi)始并且以一個(gè)終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是一種 基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0040] 破壞:術(shù)語(yǔ)"破壞"意指參照基因的編碼區(qū)和/或控制序列被部分或完全修飾(例 如通過(guò)缺失、插入和/或取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸),從而使得編碼的多肽的表達(dá)不存在(失 活)或降低,和/或編碼的多肽的酶活性不存在或降低??梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)測(cè)量破 壞效果,如使用在此參照的無(wú)細(xì)胞提取物測(cè)量值檢測(cè)酶活性的不存在或降低;或通過(guò)對(duì)應(yīng) 的mRNA的不存在或降低(例如,至少25 %降低、至少50 %降低、至少60 %降低、至少70 % 降低、至少80%降低或至少90%降低);具有酶活性的對(duì)應(yīng)多肽的量的不存在或降低(例 如,至少25 %降低、至少50 %降低、至少60 %降低、至少70 %降低、至少80 %降低或至少 90%降低);或具有酶活性的對(duì)應(yīng)多肽的比活性的不存在或降低(例如,至少25%降低、至 少50 %降低、至少60 %降低、至少70 %降低、至少80 %降低或至少90 %降低)??梢酝ㄟ^(guò) 本領(lǐng)域已知的方法破壞感興趣的具體基因,例如通過(guò)定向同源重組(directed homologous recombination)(參見(jiàn)酵母遺傳學(xué)方法(Methods in Yeast Genetics) (1997 版),亞當(dāng) 斯(Adams),戈特斯科林(Gottschling),凱澤(Kaiser)及施特姆斯(Stems),冷泉港出版 社(Cold Spring Harbor Press) (1998))。在此描述了用于破壞芽孢桿菌屬基因的技術(shù) 并且已經(jīng)在本領(lǐng)域中證實(shí)(參見(jiàn)斯特爾(Stahl)&法拉利(Ferrari),1984,細(xì)菌學(xué)雜志 (J. Bacteriol.)158,411-418)。
[0041] 控制序列:術(shù)語(yǔ)"控制序列"意指表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該多肽的多核苷酸來(lái)說(shuō)可以是天然的(即,來(lái)自相同基 因)或外源的(即,來(lái)自不同基因),或相對(duì)于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括 但不限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少, 控制序列包括啟動(dòng)子,以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與編碼 一種多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的,這些控制序列可以提供 有多個(gè)接頭。
[0042] 表達(dá):術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟,包括但不限于,轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0043] 表達(dá)載體:術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"意指一種直鏈或環(huán)狀DNA分子,該分子包括編碼一種 多肽的一種多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達(dá)的控制序列。
[0044] 宿主細(xì)胞:術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"意指易于用包括本發(fā)明的一種多核苷酸的一種核酸構(gòu) 建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋由于復(fù)制 期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0045] 分離的:術(shù)語(yǔ)"分離的"意指處于非天然存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物 質(zhì)的非限制性實(shí)例包括:(1)任何非天然存在的物質(zhì);(2)至少部分地從與其天然相關(guān)聯(lián)的 一種或多種或所有天然存在的成分中去除的任何物質(zhì),包括但不限于任何酶、變體、核酸、 蛋白質(zhì)、肽或輔因子;(3)相對(duì)于在自然界中發(fā)現(xiàn)的那種物質(zhì)通過(guò)人工修飾的任何物質(zhì);或 (4)通過(guò)相對(duì)于與其天然相關(guān)聯(lián)的其他組分增加該物質(zhì)的量(例如,宿主細(xì)胞中的重組體 產(chǎn)量;編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝;以及比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子更 強(qiáng)的啟動(dòng)子的使用)而修飾的任何物質(zhì)。
[0046] 核酸構(gòu)建體:術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"意指單-鏈或雙鏈核酸分子,其分離自天然存在 的基因,或其被修飾成以本來(lái)在自然界中不存在的方式含有核酸的區(qū)段,或其為合成的,其 包括一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0047] 可操作地連接:術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"意指一種配置,其中一個(gè)控制序列相對(duì)于一 種多核苷酸的編碼序列放置在一個(gè)適當(dāng)位置處,以使得控制序列指引編碼序列的表達(dá)。 [0048] 序列一致性:兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)"序列 一致性"描述。出于本發(fā)明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟 件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite),賴斯(Rice)等人, 2000,遺傳學(xué)趨勢(shì)(Trends Genet.) 16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德?tīng)?(Needle)程序中所實(shí)施的尼德?tīng)柭?翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德?tīng)?曼)和Wunsch (翁施),1970,分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 48:443-453)來(lái)確定兩個(gè)氨 基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10,空位延伸罰分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出 (使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性,并且如下計(jì)算:
[0049] (一致的殘基X 100)八比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))
[0050] 出于本發(fā)明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS :歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件, 賴斯(Rice)等人,2000,見(jiàn)上文)(優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本)的尼德?tīng)柍绦蛑兴鶎?shí)施的尼 德?tīng)柭?翁施算法(尼德?tīng)柭∟eedleman)和翁施(Wunsch),1970,見(jiàn)上文)來(lái)確定兩個(gè) 脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10,空位拓展罰分 0. 5,和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。尼德?tīng)枠?biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的 輸出(使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性,并且如下計(jì)算:
[0051] (一致的脫氧核糖核苷酸X 100)八比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))
[0052] 發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明
[0053] 在一個(gè)方面中,本發(fā)明涉及一種用于將感興趣重組多核苷酸從原核供體細(xì)胞的染 色體直接轉(zhuǎn)移至其他物種的原核受體細(xì)胞的染色體中的方法,其中該感興趣多核苷酸包括 至少一種感興趣編碼序列,優(yōu)選一種感興趣基因,以及選擇性標(biāo)記,其中該供體細(xì)胞的染色 體中的所述感興趣多核苷酸的每一側(cè)上的側(cè)翼為衍生自該受體細(xì)胞的染色體的多核苷酸 區(qū)域,并且其中這些側(cè)翼多核苷酸區(qū)域具有足夠的尺寸和序列一致性,以允許與在該受體 細(xì)胞的染色體中的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行雙同源重組;該方法包括以下步驟:
[0054] a)提供來(lái)自該供體細(xì)胞的染色體DNA,所述DNA包括該感興趣多核苷酸,該感興趣 多核苷酸的每一側(cè)上的側(cè)翼為衍生自該受體原核細(xì)胞的染色體的多核苷酸區(qū)域;
[0055] b)將該受體細(xì)胞用來(lái)自步驟(a)的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化;并且
[0056] c)選擇成功轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞,其中這種包括該選擇性標(biāo)記的感興趣多核苷酸已經(jīng) 被整合至該受體細(xì)胞的染色體中。
[0057] 優(yōu)選地,該選擇性標(biāo)記已經(jīng)在步驟(c)中通過(guò)在DNA的側(cè)翼區(qū)與它們的在該受體 細(xì)胞中的相應(yīng)染色體區(qū)域之間的同源重組而整合至染色體中。
[0058] 多核苷酸的來(lái)源
[0059] 對(duì)具有本發(fā)明的感興趣活性的多肽進(jìn)行編碼的多核苷酸或基因可以從任何屬的 微生物獲得。出于本發(fā)明的目的,如在此結(jié)合一種給定的來(lái)源使用的術(shù)語(yǔ)"從...獲得"應(yīng) 意指由多核苷酸編碼的多肽是由該來(lái)源或者由其中已經(jīng)插入來(lái)自該來(lái)源的多核苷酸的一 種菌株產(chǎn)生的。
[0060] 該多核苷酸可以是細(xì)菌多核苷酸。例如,該多核苷酸可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多 核苷酸,如芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、 土芽抱桿菌屬(Geobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、 海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬 (Streptococcus)、或鏈霉菌屬(Streptomyces)多核苷酸;或革蘭氏陰性細(xì)菌多核苷酸, 如彎曲桿菌屬(Campylobacter)、大腸桿菌(E. coli)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭 桿菌屬(Fusobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏 菌屬(Neisseria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)或脲原體屬 (Ureaplasma)多核昔酸。
[0061] 在一方面,該多核苷酸是嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢 桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillu
當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 4 5 6 
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
马公市| 梁平县| 华坪县| 江川县| 谢通门县| 双桥区| 紫阳县| 瑞昌市| 新津县| 邛崃市| 治县。| 称多县| 石河子市| 休宁县| 岳西县| 宁南县| 射洪县| 海宁市| 麟游县| 稷山县| 甘孜| 灌云县| 九龙县| 科技| 阜宁县| 井陉县| 陆丰市| 遂溪县| 高邮市| 南皮县| 高碑店市| 昌江| 新泰市| 赣榆县| 邛崃市| 葫芦岛市| 江门市| 鄱阳县| 萨迦县| 岑巩县| 梁山县|