一種蚯蚓抗損傷制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種蛋白質(zhì)藥物制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 蚯蚓俗稱地龍，作為一種中藥材，具有很高的藥用價值，在我國的應(yīng)用已經(jīng)有幾千 年歷史。據(jù)《本草綱目》記載：蚯蚓能治療瘰疬潰爛、口舌糜瘡，臨床上常用來治療骨折、 創(chuàng)傷、下肢潰爛等疾病。蚯蚓中含高度不飽和脂肪酸、核苷酸、酶類、蛋白質(zhì)、蚯蚓解熱堿等 多種物質(zhì)，具有清熱定驚、止咳平喘、活血通絡(luò)、降壓、抗?jié)?、抗肝纖維化、利尿等功能。此 外，現(xiàn)代分離技術(shù)發(fā)現(xiàn)，蚯蚓中還含有纖溶酶、抗菌肽、多種抗氧化酶等活性成分，因此具有 止血鎮(zhèn)痛、促進創(chuàng)傷愈合、抗氧化、抗血栓、調(diào)節(jié)免疫、抗心律失常、抗癌等作用。近幾年蚯蚓 藥用價值越來越受到重視，臨床研究和應(yīng)用也日益廣泛。蚯蚓不僅在臨床中用于藥物治療， 而且在動物營養(yǎng)飼料、土壤改良、環(huán)境治污、保護生態(tài)環(huán)境、物質(zhì)循環(huán)以及維持自然界生態(tài) 平衡等方面發(fā)揮著特殊作用。
[0003]目前，治療創(chuàng)傷的藥物主要以化學(xué)合成藥和中藥內(nèi)服和中藥外敷為主?；瘜W(xué)合成 藥對用藥者易產(chǎn)生藥物的依賴性和耐藥性，存在長期殘留在動物和人體內(nèi)的弊端，人們經(jīng) 常食用藥物殘留的動物肉質(zhì)，都會帶來對身體潛在的傷害，從而引發(fā)不可逆轉(zhuǎn)的后果。中藥 一般由多種藥物組成，成分復(fù)雜，內(nèi)服或外敷使用均存在藥理作用不明、藥效欠佳、藥效存 在不可控性、煎煮麻煩以及攜帶不便等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種藥效明顯、使用方便、安全可 靠、無毒副作用的蚯蚓抗損傷制劑及其制備方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種蚯蚓抗損傷制劑，該制劑的配方按體積比 為：蚯蚓有效成分85%，1-2丙二醇10%，吐溫-80 3~4%，0. 3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl 1 ~2%〇
[0006] 優(yōu)選地，所述蚯蚓有效成分按照以下步驟制備：（1)取鮮蚯蚓進行清洗，隔夜吐凈 泥沙，次日清水反復(fù)清洗干凈；（2)取等體積緩沖液與蚯蚓進行組織研磨，研磨時保證操作 處于4°C環(huán)境；（3)研磨后組織液在冰浴中進行細胞的超聲破碎；（4)冷凍離心三次，棄沉淀 得到蚯蚓粗提物；（5)使用30 kD和100 kD的超濾管進行超濾處理。
[0007] 優(yōu)選地，所述的鮮蚯蚓為太平二號蚯蚓。
[0008] 優(yōu)選地，該制劑按配方混合后進行過濾除菌再投入使用。
[0009] 優(yōu)選地，所述4丘蝴有效成分的分子量為30-100 kD。
[0010] 優(yōu)選地，該制劑為液狀，給藥方式為噴涂。
[0011] 優(yōu)選地，所述組織研磨在冰水環(huán)境下進行，蚯蚓有效成分的整個制備過程在4°C環(huán) 境下進行，從而防止酶變性。
[0012] 優(yōu)選地，所述組織研磨的具體操作為：將4°C、0. 2mol/L、pH=7.2的現(xiàn)配PBS緩沖 液與蚯蚓等體積混合置于組織研磨器中研磨。
[0013] 優(yōu)選地，所述離心條件為4°C、12000r/min離心lOmin，且重復(fù)離心三次。
[0014] 優(yōu)選地，該制劑具有創(chuàng)傷愈合作用，用于制備抗損傷藥物。
[0015] 優(yōu)選地，該制劑具有抑菌作用。
[0016] 本發(fā)明還提供一種蚯蚓抗損傷制劑的制備方法，包括以下步驟： 取鮮蚯蚓進行清洗，隔夜吐凈泥沙，次日清水反復(fù)清洗干凈； 取等體積緩沖液與蚯蚓進行組織研磨，研磨時保證操作處于4°C環(huán)境； 研磨后組織液在冰浴中進行細胞的超聲破碎； 冷凍離心三次，棄沉淀得到蚯蚓粗提物； 使用30 kD和100 kD的超濾管進行超濾處理得到蚯蚓有效成分； 按配方蚯蚓有效成分85%，1-2丙二醇10%，吐溫-80 3~4%，0. 3mol/L蔗糖和甘油以及 NaCl 1~2%混合。
[0017] 優(yōu)選地，所述的鮮蚯蚓為太平二號蚯蚓。
[0018] 本發(fā)明提供的一種蚯蚓抗損傷制劑所產(chǎn)生的有益效果如下：（1)該制劑經(jīng)科學(xué) 方法制取，保證了動物和人體復(fù)雜生命系統(tǒng)以及復(fù)雜疾病防治的客觀要求，具有多肽類藥 物的優(yōu)點，如具有明顯的創(chuàng)傷愈合作用，是一種療效可靠、毒副作用小、無環(huán)境污染的制劑； (2)該制劑屬于蛋白類藥物制劑，藥效高，副作用低，不蓄積中毒，因為蛋白質(zhì)類藥物本身 是人體內(nèi)源性物質(zhì)或針對生物體內(nèi)調(diào)控因子研發(fā)而得，通過參與、介入、促進或抑制人體內(nèi) 或細菌病毒中生理生化過程而發(fā)揮作用，副作用低，藥效高，針對性強，不會蓄積于體內(nèi)而 引起中毒；（3)本發(fā)明可以帶動蚯蚓養(yǎng)殖業(yè)及其附屬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，改善日益惡化的環(huán)境，為 社會提供大量的就業(yè)崗位，緩解當下的就業(yè)壓力，增加當?shù)卣亩愂帐杖搿?br>【具體實施方式】
[0019] 下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0020] 首先，通過查閱大量文獻可知，目前被學(xué)者探明的蚯蚓蛋白有多種，包括：抗菌肽、 蚓激酶、纖溶酶、過氧化物酶系、鎮(zhèn)痛成分、促進創(chuàng)傷愈合成分等，對于提取蚯蚓蛋白方法 很多，檢測到的目的蛋白分子量也較為明確，范圍存在于1KD-600KD之間。因此選擇合適 的蚯蚓蛋白進行提純顯得尤為重要。蚯蚓纖溶酶的分子量范圍大致為16KD-50KD之間， 但分子量在29KD-34KD之間的體內(nèi)纖溶、體外止血的溶栓凝血效果較強；蚯蚓抗菌肽分子 量主要范圍為1KD-1.6 KD、5. 5KD-45 KD、510KD-536KD之間；蚯蚓過氧化物酶系分子量在 30KD-98KD以及230KD-340KD之間；鎮(zhèn)痛、促進創(chuàng)傷愈合作用的蛋白分子量在90KD以下。
[0021] 因此，結(jié)合以上蛋白范圍，根據(jù)實際可行性分析，篩除一部分較小的和分子量較大 的蛋白，實驗最終確定提取蚯蚓抗損傷蛋白有效成分分子量范圍為：3KD-100KD之間，本范 圍內(nèi)的蚯蚓蛋白既保證了純度、療效，同時兼顧了提取工藝的方便、快捷、可控性。
[0022] 其次，制備蚯蚓抗損傷制劑。
[0023] 具體步驟如下： (1)取太平二號蚯蚓，清水洗凈，隔夜吐凈泥沙，次日清水反復(fù)清洗干凈，將太平二號蚯 蚓至于濾紙上吸除殘余水分。
[0024] (2)將4°C、0. 2mol/L、pH=7. 2的現(xiàn)配PBS緩沖液與蚯蚓等體積混合置于組織研磨 器中研磨，組織研磨器中應(yīng)加入冰水混合物，保證在4°C環(huán)境下進行，以防止酶變性。充分研 磨好的蚯蚓研磨液及皮渣液利用超聲波破碎儀充分破碎細胞，所得液體倒入普通EP管置 于4°C超低溫冷凍離心機12000r/min，離心10min，取上清液，重復(fù)離心三次，再取上清液， 4°C保存蚯蚓粗提物。
[0025] (3)取30kD和lOOkD超濾管，將蚯蚓粗提物分別放入超濾管超濾，截取蚯蚓有效成 分。
[0026] (4)將蚯蚓有效成分、1-2丙二醇、吐溫-80、0. 3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl按比 例混合。
[0027] (5)混合液用0.22微米濾菌篩過濾保存即可。
[0028] 通過以上步驟得到抗損傷制劑。
[0029] 取第（3)步所得的蚯蚓有效成分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)及蛋白質(zhì) 雙向電泳的圖譜掃描、ImageMaster相關(guān)軟件進行圖譜差異分析，最終得出實驗中蚯蚓提取 物的蛋白分子量主要集中在15-35KD之間、45-55KD之間以及60-70KD之間。15-35KD之間 的條帶表現(xiàn)為不連續(xù)性，60-70KD之間的條帶最為明亮、且具有連續(xù)性。由于提取過程始終 保持pH=7.2、4°C，確保了提取蛋白的活性，結(jié)果與之前確定的目的蛋白范圍相一致。
[0030] 其次，通過實驗觀察蚯蚓蛋白復(fù)合物在治療創(chuàng)傷愈合和抗菌方面的應(yīng)用 實驗例1 :創(chuàng)面愈合實驗觀察蚯蚓抗損傷藥物的創(chuàng)傷愈合作用效果 具體操作如下： (1)實驗動物準備和分組 60只雌雄各半、大小相似、健康的KM小鼠實驗前一周放入飼養(yǎng)籠中給予充足的食 物和水進行飼養(yǎng)，使之適應(yīng)環(huán)境，減少應(yīng)激反應(yīng)對實驗的影響。其中飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在 22±2°(：，濕度為65%-75%，1211明暗交替進行。
[0031] 實驗小鼠被隨機分成三組，每組20只，A代表空白對照組，不用任何藥物進行治 療；B代表蚯蚓抗損傷組，給予蚯蚓提取物進行治療；C組代表京萬紅組，給予京萬紅燙傷膏 (主要中藥成分：地黃、當歸、乳香、黃連、木鱉子、血竭等）進行治療。
[0032] (2)對小鼠進行機械組織損傷 用8%硫化鈉脫去小鼠背部區(qū)域的毛發(fā)，溫水清洗擦干，小鼠用1%戊巴比妥鈉（lg/ l〇〇ml)按公斤體重35mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，5%的碘酒及75%的酒精局部消毒術(shù)區(qū)，于小 鼠后背距脊柱兩側(cè)lcm處用自制打孔器切割直徑為lcm的圓形創(chuàng)傷口各1個，深度從皮膚 到肌層，肌層傷口的厚度約為0. 3cm，用生理鹽水沖洗傷口、消毒。開放創(chuàng)面，充分止血，待清 醒后單籠飼養(yǎng)，分別做好組間標記。
[0033] (3)對創(chuàng)傷后小鼠進行給藥處理 空白對照組小鼠創(chuàng)面直接暴露空氣中，不做任何處理；京萬紅組創(chuàng)面外涂0. lg京萬 紅；蚯蚓抗損傷組創(chuàng)面噴涂0. lml蚯蚓提取物；三組早晚八點各換一次藥物。墊料及鼠籠前 期進行殺菌消毒。
[0034] (4)對實驗中小鼠進行臨床觀察和創(chuàng)面愈合計算 每次觀察記錄小鼠毛色，進食，活動、精神狀態(tài)，創(chuàng)面色澤、質(zhì)地、有無滲液、是否感染， 創(chuàng)周紅腫變化，肉芽組織的生長情況、有無分泌物、周圍組織水腫等情況。
[0035] 創(chuàng)面愈合率：采用透明紙片描記加稱重法計算。小鼠于傷后3、7、ll、15d記錄創(chuàng)面 愈合率。首先將創(chuàng)面面積描繪在透明薄膜上，再以此為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙片剪成同樣 大小，然后用分析天平稱質(zhì)量。以硬紙片質(zhì)量間接地表示創(chuàng)面面積大小。按下列公式計算 創(chuàng)面愈合率：創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積xl〇〇%。
[0036] 愈后瘢痕面積：造模后第30d，用薄膜覆蓋于創(chuàng)面，記錄創(chuàng)面大小，并在計算紙上 計算出創(chuàng)面面積，作為愈后瘢痕面積。
[0037] 創(chuàng)面愈合時間：以肉芽完全覆蓋創(chuàng)面為治愈標準，達到創(chuàng)面愈合標準的時間為創(chuàng) 面愈合時間。
[0038] (5)臨床觀察的實驗結(jié)果表明蚯蚓蛋白復(fù)合物具有治療創(chuàng)傷，增強創(chuàng)傷愈合的效 果，具體表現(xiàn)如下： 造模和臨床試驗期間，無麻醉過量、創(chuàng)傷感染等原因造成小鼠死亡情況的發(fā)生。所有小 鼠無休克、腹瀉、拒食、絕飲等病理性應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。造模后第Id :所有小鼠創(chuàng)面均有出 血、周圍組織水腫、