一種糖核苷酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及糖核苷酸的制備方法，屬于生物藥物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]糖類(lèi)是生物體內(nèi)最基本的組成部分之一，糖結(jié)構(gòu)的表達(dá)異常是腫瘤表型的標(biāo)志之一。結(jié)構(gòu)均一性糖鏈的獲得是破解它們生物功能謎題的先決條件。人們開(kāi)發(fā)了多種合成復(fù)雜糖結(jié)構(gòu)的方法和工藝。這個(gè)前沿領(lǐng)域的發(fā)展等為糖鏈功能的測(cè)定，糖鏈結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的解析，生物合成途徑的闡明，以及基于糖的抗菌抗癌疫苗的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。體外糖合成有兩種常用策略:化學(xué)合成和酶法(包括化學(xué)-酶法)合成。復(fù)雜糖鏈目前依然是有機(jī)化學(xué)合成中具有挑戰(zhàn)性的化合物。
[0003]實(shí)踐檢驗(yàn)，酶法合成被證明是化學(xué)合成的有效替代途徑。與化學(xué)方法相此，酶法合成在更為有效進(jìn)行高度空間和立體化學(xué)特異性的糖基化反應(yīng)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。用于糖合成的酶主要是糖基轉(zhuǎn)移酶。而糖基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)需要糖核苷酸作為糖基供體。
[0004]然而，目前并沒(méi)有一種高效率制備糖核苷酸的方法，仍需人們進(jìn)一步探索。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種糖核苷酸的制備方法，其操作簡(jiǎn)單方便，效率高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
一種糖核苷酸的制備方法，該方法包括如下步驟:
選擇微生物培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物為酶源，其中所述微生物屬于酵母屬或克魯維酵母屬且具有從核魯酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力，所述核苷酸前體選自乳清酸、尿嘧啶、乳清酸核苷以及尿苷；
在含有該酶源、核苷酸前體物質(zhì)和糖的水性介質(zhì)中進(jìn)行酶反應(yīng)，其濃度為0.2-0.4Mm,反應(yīng)PH值為6.5-7.5，使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，在該水性介質(zhì)中產(chǎn)生并蓄積糖核苷酸；并
從該水性介質(zhì)中提取糖核苷酸。
[0007]優(yōu)選的，培養(yǎng)液的處理物為培養(yǎng)液的濃縮物、培養(yǎng)液的千燥物、離心分離培養(yǎng)液得到的細(xì)胞、該細(xì)胞的干燥物、該細(xì)胞的凍干物、該細(xì)胞的表面活性劑處理物、該細(xì)胞的超聲波處理物、該細(xì)胞的機(jī)械磨碎處理物、該細(xì)胞的溶劑處理物、該細(xì)胞的酶處理物、該細(xì)胞的蛋白質(zhì)部分、該細(xì)胞的固定化產(chǎn)物或由該細(xì)胞中提取的酶制品。
[0008]優(yōu)選的，所述糖核苷酸為尿苷二磷酸葡萄糖、尿苦二鱗酸半乳糖、尿香二鱗酸-N-乙醜葡糖胺或尿普二鱗酸-N-乙酰半乳糖胺。
[0009]優(yōu)選的，所述糖選自葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺。
[0010]優(yōu)選的，所述微生物是釀酒酵母或馬克斯克魯維酵母。
[0011]本發(fā)明中微生物的培養(yǎng)可按通常的方法進(jìn)行培養(yǎng)。
[0012]作為培養(yǎng)該微生物的培養(yǎng)基，只要含有該微生物可同化的破源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等物質(zhì)，并能有效地培養(yǎng)該微生物，不管是天然培養(yǎng)基還是合成培養(yǎng)基均可使用。
[0013]作為碳源，只要可為各種微生物同化就可以，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物；丙酮酸、乳酸、枸櫞酸、延胡索酸等各種有機(jī)酸；谷氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等各種氨基酸；乙醇、丙醇、甘油等醇類(lèi)。
[0014]通過(guò)該培養(yǎng)得到的微生物的培養(yǎng)液以及將該培養(yǎng)液經(jīng)種種處理的培養(yǎng)液的處理物為酶源，可以應(yīng)用在水性介質(zhì)中進(jìn)行糖核苷酸的生成。
[0015]糖核苷酸的生成中使用的酶源的量為按濕菌體100 - 800g/l,優(yōu)選50_600g/l。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明不必需使用尿苷核苷酸、糖磷酸等高價(jià)的原料，而可利用乳清酸等廉價(jià)的核苷酸前體物質(zhì)及糖為原料，不必添加高價(jià)的磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸激酶，無(wú)需酶的分離操作，制作簡(jiǎn)單，效率高。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1 UDP-Glc的生產(chǎn)
裝有 2.5L 由葡萄糖 100g/l、MgSO4-7H20 lg/1、K2HPO4 35g/L 乳清酸(鉀鹽)3g/l 組成的反應(yīng)液，容積為5L的培養(yǎng)槽中加市售的面包酵母的干燥處理物懸浮成100g/l (干燥重量換算)，在28°C下，以600rpni攪拌、通氣量為2L/min的條件進(jìn)行6小時(shí)的反應(yīng)。
[0019]該反應(yīng)中，用4N KOH維持反應(yīng)液的pH值在6.5-7.5。
[0020]反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液上清中的UDP-Glc進(jìn)行定量，結(jié)果生成UDP-Glc 7.4g/l。
[0021]利用經(jīng)離心分離該反應(yīng)液去除菌體后得到的上清2L，精制UDP-Glc，得到含有高純度m)P-Gic的溶出液。
[0022]濃縮該溶出液后添加過(guò)量的99%乙醇，生成的沉淀物經(jīng)真空干燥后得到6.8g白色粉末。該白色粉末為高純度(純度97%以上)的UDP-Glc。
[0023]實(shí)施例2 UDP-GlcNAc 的生產(chǎn)
除了用100g/l麥芽糖代替葡萄糖，在反應(yīng)液中新添加葡糖胺鹽酸鹽3.5g/l以外，在與實(shí)施例1同樣的條件下生產(chǎn)UDP- GlcNAc0
[0024]反應(yīng)結(jié)束后按上述的HPLC法對(duì)反應(yīng)液上清中的UDP-GlcNAc進(jìn)行定量，結(jié)果生成UDP-GlcNAc 7g/l (2Na鹽換算)利用經(jīng)離心分離該反應(yīng)液去除菌體后得到的上清2L，按與實(shí)施例I同樣的方法進(jìn)行精制，得到高純度(97%以上)的UDP-GlcNAc白色粉末。
[0025]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種糖核苷酸的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 選擇微生物培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物為酶源，其中所述微生物屬于酵母屬或克魯維酵母屬且具有從核魯酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力，所述核苷酸前體選自乳清酸、尿嘧啶、乳清酸核苷以及尿苷； 在含有該酶源、核苷酸前體物質(zhì)和糖的水性介質(zhì)中進(jìn)行酶反應(yīng)，其濃度為0.2-0.4Mm,反應(yīng)PH值為6.5-7.5，使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，在該水性介質(zhì)中產(chǎn)生并蓄積糖核苷酸；并 從該水性介質(zhì)中提取糖核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖核苷酸的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)液的處理物為培養(yǎng)液的濃縮物、培養(yǎng)液的千燥物、離心分離培養(yǎng)液得到的細(xì)胞、該細(xì)胞的干燥物、該細(xì)胞的凍干物、該細(xì)胞的表面活性劑處理物、該細(xì)胞的超聲波處理物、該細(xì)胞的機(jī)械磨碎處理物、該細(xì)胞的溶劑處理物、該細(xì)胞的酶處理物、該細(xì)胞的蛋白質(zhì)部分、該細(xì)胞的固定化產(chǎn)物或由該細(xì)胞中提取的酶制品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖核苷酸的制備方法，其特征在于，所述糖核苷酸為尿苷二磷酸葡萄糖、尿苦二鱗酸半乳糖、尿香二鱗酸-N-乙醜葡糖胺或尿普二鱗酸-N-乙酰半乳糖胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖核苷酸的制備方法，其特征在于，所述糖選自葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖核苷酸的制備方法，其特征在于，所述微生物是釀酒酵母或馬克斯克魯維酵母。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種糖核苷酸的制備方法，該方法包括如下步驟：選擇微生物培養(yǎng)液或該培養(yǎng)液的處理物為酶源，其中所述微生物屬于酵母屬或克魯維酵母屬且具有從核魯酸前體物質(zhì)和糖生成糖核苷酸能力，所述核苷酸前體選自乳清酸、尿嘧啶、乳清酸，核苷以及尿苷；在含有該酶源、核苷酸前體物質(zhì)和糖的水性介質(zhì)中進(jìn)行酶反應(yīng)，其濃度為0.2-0.4Mm,反應(yīng)pH值為6.5-7.5，使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，在該水性介質(zhì)中產(chǎn)生并蓄積糖核苷酸；并從該水性介質(zhì)中提取糖核苷酸。本發(fā)明不必需使用尿苷核苷酸、糖磷酸等高價(jià)的原料，而可利用乳清酸等廉價(jià)的核苷酸前體物質(zhì)及糖為原料，不必添加高價(jià)的磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸激酶，無(wú)需酶的分離操作，制作簡(jiǎn)單，效率高。
【IPC分類(lèi)】C12P19-30, C12R1-645, C12R1-865
【公開(kāi)號(hào)】CN104694598
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510071303
【發(fā)明人】戴祖新
【申請(qǐng)人】海門(mén)市潤(rùn)圣紡織品有限公司
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年2月11日