專利名稱：新的單克隆抗體和線蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體及線蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗原。具體地，本發(fā)明涉及對(duì)寄生線蟲(chóng)的第三階段幼蟲(chóng)(L3)的表面抗原具有特異性的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
線蟲(chóng)類動(dòng)物寄生蟲(chóng)，如羊和牛寄生蟲(chóng)的群襲現(xiàn)象在農(nóng)業(yè)上具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)意義，通常用驅(qū)蟲(chóng)藥給藥治療線蟲(chóng)感染。
然而，常規(guī)驅(qū)蟲(chóng)藥的主要的缺點(diǎn)是線蟲(chóng)對(duì)大量的驅(qū)蟲(chóng)藥產(chǎn)生抗性變得越來(lái)越廣泛，因而產(chǎn)生嚴(yán)重困憂(Waller，1997；Sangsteret al，1999；Van Wyk et al，1999)。
已有許多假設(shè)試圖解釋線蟲(chóng)被驅(qū)除出免疫羊的腸道的機(jī)理(Rothwell 1989)。有證據(jù)表明速發(fā)型超過(guò)敏反應(yīng)因素與其有關(guān)，在該反應(yīng)中，抗原刺激IgE敏感性粘膜柱細(xì)胞而使可能影響線蟲(chóng)存活的化合物在粘液積累(Miller 1996；Emery等1997)。粘液的抗線蟲(chóng)屬性與化學(xué)介質(zhì)(Douch等1983；Jones等1990)及抗體(Lee &Ogilvie 1981；Miller 1987；Carlisle等1991)的存在有關(guān)。最近本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)多次截短型感染使羊體免疫后，獲取其腸道粘液與幼蟲(chóng)混合，后注入初次接受免疫的羊的十二指腸，能夠改變幼蟲(chóng)形成的模式(Harrison等1999)。從對(duì)蛇形毛園線蟲(chóng)(Trichostrongyluscolubriforriis)具免疫力的羊的小腸中收集粘液，發(fā)現(xiàn)其具有抗線蟲(chóng)活性，將其與幼蟲(chóng)通過(guò)十二指腸導(dǎo)管注入初次接受免疫的羊后，其使線蟲(chóng)在體外結(jié)塊，從而顯著減少了羊體內(nèi)幼蟲(chóng)形成的數(shù)目。
免疫印跡表明免疫粘液內(nèi)含有IgG和IgA抗體，它們對(duì)分子量約為35kDa的抗原具有識(shí)別優(yōu)勢(shì)。從培養(yǎng)在免疫粘液中的幼蟲(chóng)的表面洗脫得到的抗體也與線蟲(chóng)勻漿物印跡上的35kDa的抗原反應(yīng)。免疫熒光檢測(cè)法和免疫金電鏡顯微實(shí)驗(yàn)表明該35kDa的抗原存在于L3的上表皮，在向L4蛻變過(guò)程中減少。在蟲(chóng)卵、L1、L2、L4及成蟲(chóng)上不存在該抗原，僅僅在感染前及感染后5天內(nèi)的L3提取物中發(fā)現(xiàn)。該結(jié)果表明抗體與幼蟲(chóng)表面結(jié)合防止了幼蟲(chóng)在其偏好部位生長(zhǎng)，并將它們清除出腸道。用部分純化的35kDa的抗原免疫羊，蛇形毛園線蟲(chóng)感染后的蟲(chóng)卵數(shù)目顯著下降，這表明該抗原在疫苗方面的潛在用途。
制備稱為PAB-1的單克隆抗體(PAB-1單抗，MAb PAB-1)來(lái)對(duì)抗幼蟲(chóng)表面抗原。PAB-1單抗與羊粘液抗體均識(shí)別35kDa的蛇形毛圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的抗原，且與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Haemonchuscontortus)和環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)(Ostertagia circumcincta)寄生性線蟲(chóng)的L3提取物印跡上的一種具有相似分子量的抗原及古巴毛樣線蟲(chóng)(Cooperia curticei)和匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)(Nematodirusspathiger)的L3提取物的抗原印跡上的22kDa的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。這表明其他線蟲(chóng)種屬上也存在具有免疫潛力的通用表面抗原，該抗原被PAB-1單抗識(shí)別。35kDa的幼蟲(chóng)抗原及相關(guān)分子可能是宿主免疫應(yīng)答的新靶標(biāo)，因此可在抗線蟲(chóng)感染的疫苗或在其他免疫療法中使用。
PAB-1單克隆抗體在標(biāo)準(zhǔn)親和色譜法中可用來(lái)純化表面抗原。用連結(jié)于諸如瓊脂糖、瓊脂糖凝膠(sepharose)等固相支持物上的PAB-1單克隆抗體與L3粗提物中的表面抗原結(jié)合，使用低pH值的緩沖液可將表面抗原從抗體基質(zhì)上洗脫出來(lái)，經(jīng)SDSPAGE電泳法顯示得到的表面抗原基本已提純。通過(guò)此法提純的表面抗原以羊的免疫粘液抗體印跡法檢測(cè)，并可用檢測(cè)糖類的方法進(jìn)行染色。
已知35kDa的幼蟲(chóng)抗原及其相關(guān)大分子具有糖優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)，該抗原對(duì)蛋白激酶K消化具有抗性的原因是因?yàn)槠湓谀z中不被敏感的蛋白染色劑染色；而被糖類染色劑染色，且能被諸如生物素-酰肼等的糖類標(biāo)記試劑標(biāo)記。
因此，PAB-1單抗可能可用于鑒別及分離表面抗原以研制抗線蟲(chóng)感染的疫苗或其他免疫療法。
感染了蛇形毛圓線蟲(chóng)的羊的血清及腸道粘液中含有能識(shí)別35kDa幼蟲(chóng)抗原及其相關(guān)分子的抗體，因此，當(dāng)存在針對(duì)幼蟲(chóng)抗原的抗體時(shí)，表明感染了寄生蟲(chóng)；所以，PAB-1單抗可能可用于鑒定動(dòng)物感染的有效工具。
包括任何專利或?qū)＠暾?qǐng)?jiān)趦?nèi)的所有本說(shuō)明書(shū)引用的參考文獻(xiàn)均在此被引為參考，這并不是認(rèn)可任何參考文獻(xiàn)都構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。關(guān)于參考文獻(xiàn)提及的其作者的主張的討論，申請(qǐng)人保留對(duì)所引用文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性及妥當(dāng)性提出質(zhì)疑的權(quán)利。需要清楚解釋的是，雖然一些現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)在此被涉及，但是并不認(rèn)為這些文獻(xiàn)在新西蘭或任何其他國(guó)家已經(jīng)成為該領(lǐng)域的公知知識(shí)。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面提供了分離的單克隆抗體mAb PAB-1，該抗體已于2002年1月24日在ATCC保藏，登記號(hào)為PTA-4005，其能與線蟲(chóng)L3表面抗原結(jié)合。
本發(fā)明的第二方面提供了如上所述的分離的單克隆抗體，其中該抗體與源自蛇形毛圓線蟲(chóng)L3的抗原結(jié)合，且還原條件下該抗原在SDS PAGE膠中約35kDa處出現(xiàn)條帶。
本發(fā)明的第三方面提供了如上所述的分離的單克隆抗體，其與L3的表面抗原結(jié)合，該表面抗原選自a)古巴毛樣線蟲(chóng)(C.curticei)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約46kDa處和約22kDa處出現(xiàn)條帶；
b)匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)(N.spathiger)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約22kDa處出現(xiàn)條帶；c)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(H.contortus)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約35kDa處和約22kDa處出現(xiàn)條帶；及d)環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)(O.circumcincta)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約35-39kDa處出現(xiàn)條帶；e)T.axei或T.vitrinus上的表面抗原，其在還原條件下在SDSPAGE凝膠中約35kDa處出現(xiàn)條帶；f)結(jié)節(jié)線蟲(chóng)(O.ostertagi)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約30-45kDa處出現(xiàn)條帶；g)C.oncophera上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約20kDa處和約45kDa處出現(xiàn)條帶；h)巴西奴卡菌(N.brasiliensis)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約9kDa處和約12kDa處出現(xiàn)條帶；i)D.eckerti上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中約30kDa處出現(xiàn)條帶；本發(fā)明的第四方面提供了如上所述的分離的單克隆抗體，其中當(dāng)該抗體與固體支持物連結(jié)時(shí)，其能用于通過(guò)免疫親和色譜法純化表面抗原。
本發(fā)明的第五方面提供了源自線蟲(chóng)L3的分離的糖表面抗原，其中該抗原能與的單克隆抗體mAb PAB1結(jié)合，該單克隆抗體已于2002年1月24日在ATCC保藏，登記號(hào)為PTA-4005。
最優(yōu)選的所述抗原在1M NaOH中對(duì)沸騰有抗性。
本發(fā)明的第六方面提供了分離的與上述抗原基本上一致的抗原，其中該抗原在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在20-35kDa間出現(xiàn)條帶；或基本上在9kDa和12kDa處出現(xiàn)條帶。
本發(fā)明的第七方面提供了分離的與上述抗原基本上一致的抗原，其中該抗原源自蛇形毛圓線蟲(chóng)L3。
本發(fā)明的第八方面提供了一種分離的與上述抗原基本上一致的抗原，其中該抗原源自線蟲(chóng)L3，該線蟲(chóng)L3分離自古巴毛樣線蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、T.axei、T.vitrinus、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
本發(fā)明的第九方面提供了含有與上述抗原基本上一致的抗原和藥學(xué)上或獸學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的組合物。
本發(fā)明的第十方面提供了與上述抗原基本上一致的抗原的用途，該用途是生產(chǎn)用于預(yù)防、治療線蟲(chóng)感染或降低線蟲(chóng)感染易感性的組合物。
本發(fā)明的第十一方面提供了與上述組合物基本上一致的組合物用于受線蟲(chóng)感染的易感羊體以預(yù)防、治療線蟲(chóng)感染或降低其感染易感性的用途，這些線蟲(chóng)選自蛇形毛園線蟲(chóng)、古巴毛樣線蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、T.axei、T.vitrinus、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
本發(fā)明的第十二方面提供了與上述組合物基本上一致的組合物，該組合物用于除羊之外的易感動(dòng)物以預(yù)防、治療線蟲(chóng)感染或降低線蟲(chóng)感染易感性；其中這些其它種類的線蟲(chóng)也具有可通過(guò)與上述單克隆抗體PAB-1反應(yīng)來(lái)檢測(cè)的幼蟲(chóng)表面抗原。
優(yōu)選地，這些其它種類動(dòng)物可是任何易感于線蟲(chóng)感染的如前所述的動(dòng)物，還可以是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、馬、豬、犬、貓、雞、牛或鹿等。
本發(fā)明的第十三方面提供了與上述組合物基本上一致的組合物，其中該組合物還含有至少一種佐劑或細(xì)胞因子。
本發(fā)明的第十四方面提供了診斷易感動(dòng)物線蟲(chóng)感染的方法，該方法包含如下步驟a)自動(dòng)物上獲得血液樣品；
b)通過(guò)合適的檢驗(yàn)方法，分析血樣是否存在抗本發(fā)明第三方面所述抗原的抗體。
優(yōu)選地，所述的檢驗(yàn)方法可是ELISA或western印跡法，但這并不能看作是對(duì)可用的其它方法的限制。
本發(fā)明的第十五方面提供了與上述抗體基本相同的分離的抗體，其中該抗體來(lái)源于動(dòng)物的胃腸道粘液，這些動(dòng)物用選自下列的線蟲(chóng)的截短型感染(truncated infection)免疫蛇形毛園線蟲(chóng)、古巴毛樣線蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、T.axei、T.vitrinus、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
本發(fā)明的第十六方面提供了通過(guò)用本發(fā)明的組合物給藥來(lái)預(yù)防或治療動(dòng)物線蟲(chóng)感染的方法。
本發(fā)明的第十七方面提供了本發(fā)明的抗原用于在羊或其他易感動(dòng)物的腸道粘液內(nèi)引起抗體反應(yīng)以預(yù)防、治療線蟲(chóng)感染或降低線蟲(chóng)感染易感性的用途。
本發(fā)明的第十八方面提供與上述單克隆抗體基本一致的抗體用于檢測(cè)羊體內(nèi)線蟲(chóng)感染的用途。
術(shù)語(yǔ)“分離的”的意思是指本發(fā)明的單克隆抗體或糖已經(jīng)從原始環(huán)境中移離，并與提供該抗體或糖的天然系統(tǒng)中的所有或部分共存物質(zhì)分離。
術(shù)語(yǔ)“L3”指的是線蟲(chóng)生活周期中特定的幼蟲(chóng)發(fā)育階段。
除非在上下文中另有指定，35kDa抗原一般指具有基本相同分子量的蛇形毛圓線蟲(chóng)抗原。術(shù)語(yǔ)“易感動(dòng)物”是指容易感染線蟲(chóng)，如蛇形毛園線蟲(chóng)、古巴毛樣線蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、T.axei、T.vitrinus、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti的羊，或指容易感染那些具有用所述PAB-1單抗檢測(cè)出的抗原的線蟲(chóng)的其他動(dòng)物。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的單克隆抗體是一種能夠識(shí)別寄生性線蟲(chóng)L3上的糖類表面抗原的單克隆抗體。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該單克隆抗體與用蛇形毛圓線蟲(chóng)免疫的羊的腸道粘液中存在的抗幼蟲(chóng)抗體具有相同的特異性。能產(chǎn)生單克隆抗體mAb PAB-1的雜交瘤于2002年1月24日在ATCC保藏，相應(yīng)的登記號(hào)為PTA-4005。
下文用通用的非限制性術(shù)語(yǔ)對(duì)本發(fā)明的抗體鑒定步驟進(jìn)行了簡(jiǎn)要描述。
容易遭受線蟲(chóng)感染的羊自出生至4月齡在無(wú)線蟲(chóng)環(huán)境中飼養(yǎng)成長(zhǎng)，四月齡時(shí)一些既定數(shù)目的動(dòng)物被施以一系列的蛇形毛圓線蟲(chóng)截短型感染致免疫。其它的免疫羊繼續(xù)在無(wú)線蟲(chóng)條件下飼養(yǎng)成長(zhǎng)。優(yōu)選地，所用的羊在一段時(shí)間內(nèi)被進(jìn)行3次截短型感染，每次感染在經(jīng)歷一段既定的時(shí)限后停止。優(yōu)選地，這一既定的時(shí)限是14天，再次感染的時(shí)間約是前次結(jié)束后7天，但是這些時(shí)限的數(shù)值不應(yīng)該視為限制。
最后一次感染結(jié)束后，屠殺羊，取其小腸內(nèi)的粘液。這基本上按照Harrison et al，1999的描述進(jìn)行，但是該方法不應(yīng)視為限制，其理由是也可以應(yīng)用其他的一些方法。未感染的未感染羊的粘液也如上法取得。
一旦獲得粘液樣品，分析免疫的和未感染的羊的粘液未感染羊樣品以觀察蛋白差異。例如用SDS PAGE凝膠及Coomassie藍(lán)、銀染分析。
然后特征鑒定粘液抗體，優(yōu)選地通過(guò)免疫印跡均勻混合抗原和碳針檢測(cè)免疫的及未感染羊的粘液樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)抗體的結(jié)合時(shí)，可以通過(guò)與商業(yè)上可用的抗羊免疫球蛋白產(chǎn)生的并與酶結(jié)合的抗血清反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選地，結(jié)合的該抗體可以通過(guò)RAS/IgG-HRP法檢測(cè)。
可以通過(guò)下法制備L3均勻混合物在適合的清潔劑或變性劑的存在或不存在的情況下，借助機(jī)械手段或化學(xué)手段將任何一種在此列出的寄生性線蟲(chóng)的出鞘的(exshealthed)L3裂解；隨后以離心和/或過(guò)濾法使提取物澄清。
最優(yōu)選地，可以通過(guò)裂解冷凍于液氮的蛇形毛圓線蟲(chóng)的出鞘的L3來(lái)制備均勻混合物，即用研鉢及乳槌將冷凍的L3研磨直至裂解。隨后將幼蟲(chóng)的組分提取入中性緩沖液，如含有1～2％諸如CHAPS、去氧膽酸鈉、脲或SDS等助溶劑的、pH7.5的50mM的Tris-HCl緩沖液。以100,000×g離心提取物1小時(shí)，或用孔徑逐漸變小，如5.0μM至0.2μM的系列濾膜過(guò)濾來(lái)使其澄清。
制備單克隆抗體mAb PAB的方法可以是任何合適方法，如Kohler及Milstein(1975)所述的方法。
例如，可以從聚丙烯酰胺凝膠片上切下35kDa片段，用同體積的不完全油佐劑浸泡并混合，然后給藥到需要免疫的動(dòng)物的腹腔、皮下或腳墊等位置，所述動(dòng)物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、綿羊、馬、豬、犬、貓、雞、?；蚵沟?。這些動(dòng)物中優(yōu)選小鼠。
諸如脾細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、外周血細(xì)胞等的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，可以從免疫動(dòng)物上收集，與骨髓瘤細(xì)胞(一種腫瘤細(xì)胞株)融合后形成雜交瘤。優(yōu)選脾細(xì)胞作為抗體產(chǎn)生細(xì)胞。
細(xì)胞融合用的骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選那些與免疫動(dòng)物異源的細(xì)胞系，但是各種動(dòng)物的細(xì)胞系均可使用。
優(yōu)選地，NS-1細(xì)胞可以用作骨髓瘤細(xì)胞，但是這不應(yīng)該視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
雖然本發(fā)明所述的單克隆抗體一般是一種通過(guò)雜交瘤產(chǎn)生的抗體，但是通過(guò)諸如血漿酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等不具降解抗原結(jié)合位點(diǎn)(Fab)能力的蛋白水解酶與抗體相互作用獲得的抗體片段，如Fab，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)acb等，或通過(guò)分子克隆技術(shù)生產(chǎn)的抗體片段均包括在本發(fā)明的單克隆抗體之內(nèi)，條件是只要它們具備本發(fā)明的單克隆抗體的性質(zhì)。
本發(fā)明的糖類表面抗原存在于蛇形毛園線蟲(chóng)、古巴毛樣線蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、T.axei、T.vitrinus、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti的L3表面。
下文用通用的非限制性術(shù)語(yǔ)對(duì)本發(fā)明的抗體鑒定步驟進(jìn)行了簡(jiǎn)要描述。
本發(fā)明的糖類表面抗原可以從此處列出的線蟲(chóng)L3提取物中分離出。優(yōu)選地，糖類抗原從如上所述的蛇形毛圓線蟲(chóng)L3的提取物中分離。PAB-1單克隆抗體先與固體支持介質(zhì)相連結(jié)，優(yōu)選地與蛋白A-瓊脂糖或蛋白G-并共價(jià)連結(jié)以防止抗體從凝膠上脫落。
隨后將凝膠裝塞入色譜柱，采用L3提取物。用中性緩沖液沖洗后，優(yōu)選用含有0.05％Tween 20的PBS沖洗以防止非特異性結(jié)合后，用高pH值或低pH值或高鹽水平的洗脫緩沖液使結(jié)合的糖類抗原從柱上洗脫，優(yōu)選地，用pH2.5-2.8的甘油-鹽酸緩沖液洗脫抗原。洗脫后糖類抗原的pH值可以用添加1M Tris的方法提高到中性，隨后電泳法和免疫羊粘液抗體的印跡法進(jìn)行進(jìn)一步分析鑒定該糖類抗原。用檢測(cè)糖類的銀染法染色和結(jié)合糖類的生物素-酰肼試劑進(jìn)行印跡，可以檢測(cè)糖類抗原的性質(zhì)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解其他檢測(cè)糖類的方法也可以使用，這些方法包括但不限于凝集素結(jié)合、HPLC、TLC、熒光基團(tuán)輔助的糖電泳、MS及NMR。
制備藥劑組合物的方法及藥學(xué)載體是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，正如教科書(shū)Remington′s Pharmaceutical Sciences，19th Edition，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，USA)所述。
本發(fā)明所述物質(zhì)、疫苗或組合物可以用任何合適的途徑給藥，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地根據(jù)治療的情況確定最合適的給藥途徑及劑量。劑量由相關(guān)的內(nèi)科醫(yī)生或獸醫(yī)審慎判斷后決定，取決于治療情況的狀態(tài)和性質(zhì)、治療對(duì)象的的年齡、總體健康狀況、給藥途徑及給藥的前期治療。
所述的載體或稀釋劑、及其他賦形劑取決于給藥途徑，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)個(gè)案能夠容易地確定最合適的配方。
為了實(shí)現(xiàn)本說(shuō)明書(shū)的目的，很明顯“包含”一詞的意思是“包括但不局限于”，與“含有”的意思相同。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明通過(guò)實(shí)施例并參考如下附圖，下文將對(duì)本發(fā)明的其它方面座更清除的說(shuō)明。


圖1顯示了在將幼蟲(chóng)與不同量的未感染羊粘液或免疫羊粘液共孵育后在未感染的羊中的幼蟲(chóng)數(shù)量；圖2顯示了顯示了在將幼蟲(chóng)與未感染羊粘液或免疫羊粘液共孵育不同時(shí)間后在未感染的羊中的幼蟲(chóng)數(shù)量；圖3顯示了用未感染的或免疫的粘液中的L3混合物灌輸未感染的受體羊后未感染羊的最近部分和最遠(yuǎn)部分的幼蟲(chóng)數(shù)量；圖4顯示了在免疫不同時(shí)間后免疫粘液的抗幼蟲(chóng)活性；圖5顯示了免疫的和未感染的粘液的SDS PAGE分析結(jié)果；圖6顯示了免疫的和未感染的粘液的植物凝集素印跡結(jié)果，AUEA-1(α-L-果糖) BJAC(α-gal-Me-吡喃糖苷)CWGA(N-乙酰氨基葡萄糖)DLL(甘露糖，葡萄糖)；圖7顯示了免疫的和未感染的粘液的植物凝集素印跡結(jié)果，APNA(β-半乳糖-N-乙酰氨基半乳糖)BEcorA(β-半乳糖-N-乙酰氨基半乳糖)
CSBA(N-乙酰氨基半乳糖)DECA(β-半乳糖-N-乙酰氨基半乳糖)；圖8顯示了免疫的和未感染的粘液的植物凝集素印跡結(jié)果，ASNA(唾液酸)B用RAS/IgG-HRP免疫印跡探查圖9顯示了蛇形毛園線蟲(chóng)L3抗原的免疫印跡結(jié)果，其中的L3抗原用免疫羊(第1、5、10、11、12和19道)或未感染羊(第13-18道)的腸粘液、免疫粘液的100 000×g離心上清(第3道)、從蛋白G-瓊脂糖純化出的免疫粘液上清(第4和7道)、從出鞘的蛇形毛園線蟲(chóng)L3洗脫出的抗體(第6和20道)、來(lái)自免疫羊的硫酸胺沉淀的腸道內(nèi)腔液體的抗體(第8和9道)探測(cè)。第2道顯示了用膠體金著色的蛇形毛園線蟲(chóng)L3蛋白，用RAS/IgG-HRP檢測(cè)IgG抗體(第1-18道)，用MAS/IgA，接著用RAS/IgG-HRP檢測(cè)IgA抗體(第19和20道)；圖10顯示了用未感染的或免疫的粘液探查的蛇形毛園線蟲(chóng)L3抗原的免疫印跡結(jié)果，抗原帶與未感染的粘液或免疫的粘液反應(yīng)，然后與RAS/IgG、抗IgG1的mAB、抗IgG2的mAB、抗IgA的mAB、抗IgM的mAB反應(yīng)；圖11顯示了蛇形毛園線蟲(chóng)L3抗原，古巴毛樣線蟲(chóng)L3抗原和匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)L3抗原的免疫印跡結(jié)果；圖12顯示了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、古巴毛樣線蟲(chóng)和蛇形毛園線蟲(chóng)的L3的抽提物的免疫印跡分析的結(jié)果；圖13顯示了蛇形毛園線蟲(chóng)L3抗原的腸粘液IgG和IgA抗體滴度與抗感染保護(hù)作用的關(guān)系；圖14顯示了腸粘液中的IgG和IgA抗體滴度隨時(shí)間的推移逐漸降低；
圖15顯示了與免疫的或未感染的粘液反應(yīng)的出鞘的蛇形毛園線蟲(chóng)L3(上圖)，并顯示了在感染并與免疫粘液反應(yīng)后第5天收集的蛇形毛園線蟲(chóng)的幼蟲(chóng)(下圖)；圖16顯示了在與未感染的(A)或免疫的(B)粘液反應(yīng)后出鞘的蛇形毛園線蟲(chóng)L3的電子顯微照片。圖C-F顯示了在感染并與免疫的粘液反應(yīng)后第2、3、4或5天收集的蛇形毛園線蟲(chóng)的幼蟲(chóng)；圖17顯示了對(duì)蛇形毛園線蟲(chóng)卵漸近線SDS PAGE和免疫印跡分析的結(jié)果。圖A、C和D與免疫粘液反應(yīng)，圖B是銀染色蛋白；圖18顯示了感染前和感染后不同時(shí)間的蛇形毛園線蟲(chóng)L3的SDS PAGE和免疫印跡分析結(jié)果；圖19顯示了與免疫粘液或單克隆抗體PAB-1反應(yīng)的蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物和蛋白酶K消化的L3抽提物的免疫印跡分析結(jié)果；圖20顯示了來(lái)自與單克隆抗體PAB-1反應(yīng)的5個(gè)線蟲(chóng)種的L3抗原抽提物和蛋白酶K消化的L3抽提物的印跡分析結(jié)果；圖21顯示了與對(duì)照的單克隆抗體(左和中間的圖)或與單克隆抗體PAB-1(右圖)反應(yīng)的出鞘蛇形毛園線蟲(chóng)L3的表面熒光；圖22顯示了Tc幼蟲(chóng)表面抗原的分析結(jié)果，該抗原用單克隆抗體PAB-1進(jìn)行免疫親和色譜來(lái)純化；圖23顯示了加熱、氧化、消化或用有機(jī)溶劑沉淀后的蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫印跡分析結(jié)果；圖24顯示了用蛋白酶或脂酶消化后蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫分析結(jié)果；圖25顯示了用蛋白酶消化后蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫分析結(jié)果；
圖26顯示了用糖苷酶消化后蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫分析結(jié)果；圖27顯示了顯示了堿分解后蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫分析結(jié)果；圖28顯示了加熱或堿或酸分解后蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫印跡分析結(jié)果；圖29顯示了加熱或堿或酸分解后蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫分析結(jié)果；圖30顯示了加熱或堿分解或蛋白酶消化后蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫分析結(jié)果；圖31顯示了在原始條件下或在脲或去氧膽酸鈉存在的條件下電泳后蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫印跡分析和蛋白染色結(jié)果；圖32顯示了在二維電泳后蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物的免疫印跡分析和蛋白染色結(jié)果；圖33顯示了在6只其它線蟲(chóng)的L3抽提物中存在糖著色分子；圖34顯示了蛇形毛園線蟲(chóng)L3抽提物(L3)和在非變性條件下(無(wú)去污劑或還原劑)電泳純化的糖基幼蟲(chóng)抗原(C)的凝膠電泳(8％PAGE)和免疫印跡分析結(jié)果。
實(shí)現(xiàn)發(fā)明的最佳方式1.材料與方法1.1截短型感染對(duì)羊的免疫所有的羊的實(shí)驗(yàn)均按照Wallaceville動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定進(jìn)行。Romney羊自出生開(kāi)始就在無(wú)線蟲(chóng)的條件下成長(zhǎng)，圈養(yǎng)并飼以市售羊飼料，干草及水，自由進(jìn)食。羊在進(jìn)行免疫感染時(shí)至少4月齡。以40000只蛇形毛圓線蟲(chóng)L3截短型感染免疫羊，至少進(jìn)行三次。每次感染均在14天后通過(guò)口腔灌喂奧芬達(dá)唑(Systamex，Schering Plough Ltd.，4.5mg kg-1)中止，羊在灌喂7天后重復(fù)進(jìn)行感染操作。在一些實(shí)驗(yàn)中，羊還被給予第四次的感染(加強(qiáng)劑量)，此時(shí)不用灌喂給藥法中止，而是在加強(qiáng)給藥2-3天后將羊屠殺。
1.2.采樣羊以槍殺及放血法被屠殺。羊的小腸被打結(jié)成5米的片段，每個(gè)片段用4×150毫升的生理鹽水沖洗以收集幼蟲(chóng)。為了供生化分析及體內(nèi)注射用，收集小腸前6米處的粘液，以哈里森(Harrison等1999)所述的方法改良后處理，改良如下述。在輕柔地用100毫升生理鹽水淋洗去除腸的內(nèi)容物后，在4℃放置小腸2小時(shí)，然后以拇指和食指用力擠壓小腸使流出粘液，隨后以2×5毫升的生理鹽水洗滌。收集粘液和洗液，并以哈里森(Harrison等1999)所述方法處理，貯存在-20℃。
對(duì)于進(jìn)行了4次截短型感染的羊，在最后一次免疫后的第3，16，35天收集粘液的活組織檢查樣本。在手術(shù)時(shí)，定位十二指腸并用手術(shù)鉗輕柔夾取分離一段5厘米的片段。應(yīng)用具鈍端的18規(guī)格的針頭注入3毫升生理鹽水。液體前后搖蕩10次使粘液與生理鹽水混合后，取樣2-3毫升?？p合切口，使羊逐漸康復(fù)。
1.3不同方法處理對(duì)粘液體外活性的影響通過(guò)幼蟲(chóng)結(jié)塊實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)粘液結(jié)合幼蟲(chóng)的能力，將2000只出鞘的L3放入一個(gè)置于振動(dòng)平臺(tái)的Eppendorf管中，37℃下與0.4毫升的粘液共孵育。四小時(shí)后，檢驗(yàn)樣本并估算幼蟲(chóng)結(jié)塊的程度，以與未感染的粘液或生理鹽水共孵育的L3為對(duì)照，與對(duì)照比較。
免疫粘液以多種不同的方法處理，然后分析其幼蟲(chóng)結(jié)塊的效力。等分取1毫升免疫粘液IP5置于4℃生理鹽水中透析24小時(shí)，在10000×g、10000×g或100000×g下離心，60℃加熱或100℃加熱5分鐘，在10mM的DTT中還原或烷基化1小時(shí)，然后在冰上與20mM碘乙酰胺反應(yīng)30分鐘，再以pH7.4的TBS水解過(guò)夜，以除去多余的鹽分。以胃蛋白酶處理時(shí)，粘液以1MHCl調(diào)節(jié)pH至4.5，在3毫升粘液中加入含3毫克胃蛋白酶的pH4.5的0.1M乙酸緩沖液，于振動(dòng)平臺(tái)上37℃共孵育20小時(shí)，加入Tris至濃度為2M令反應(yīng)停止。以蛋白水解酶處理時(shí)，于每毫升粘液中加入溶于pH7.5的0.1M Tris的1毫克鏈蛋白酶，于振動(dòng)平臺(tái)上37℃共孵育20小時(shí)，反應(yīng)通過(guò)加入蛋白水解酶抑制劑而停止。粘液以脂肪酶處理時(shí)，每毫升粘液用1毫克的脂肪酶處理，于pH7.2的PBS中37℃下孵育20小時(shí)，然后冷凍貯存。粘液氧化處理時(shí)，以醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.5，加入高碘酸鹽于pH4.5的50mM醋酸鈉緩沖液中至120mM，并于室溫?cái)嚢柘卤芄夥跤?小時(shí)，加入硼氫化鈉至50mM，攪拌下孵育1小時(shí)。超濾粘液時(shí)，將5毫升免疫粘液IP5稀釋至250毫升的pH7.2的PBS中，然后在Filtron 100000mw的膜上濃縮至5毫升，隨后將濾液在10000mw的膜上濃縮至5毫升，然后將濾液在3000mw的膜上濃縮至5毫升。凍干低mw膜的濾液，重溶于5毫升的蒸餾水中，置入1000mw管中蒸餾水透析。
通過(guò)上述步驟處理后，冷凍儲(chǔ)存粘液樣品直至測(cè)定。
1.4體內(nèi)粘液實(shí)驗(yàn)40000只出鞘的L3與2.5-10ml未感染羊體積的免疫羊或未感染羊的粘液共孵育24小時(shí)，然后通過(guò)一個(gè)特別的外科植入導(dǎo)管(Harrison等.1999)注入到未經(jīng)線蟲(chóng)感染的羊的十二指腸。一周后殺死羊，對(duì)每5米小腸片段內(nèi)的生長(zhǎng)的線蟲(chóng)的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。
40000只出鞘的L3于37℃下與10ml體積的免疫羊或未感染羊的粘液，或與經(jīng)100000×g離心后的2×10ml體積的粘液上清共孵育4小時(shí)。未感染羊孵育后取一等分的未感染羊及免疫羊的上清在200×g離心3分鐘以沉淀幼蟲(chóng)。立即去除上清，以10ml生理鹽水清洗L3，如上法離心，去除上清，將L3在10ml生理鹽水重混懸。每10ml未感染羊等量的液體通過(guò)十二指腸管注入未感染羊腸道。一周后，殺死羊，計(jì)幼蟲(chóng)數(shù)目。
1.5粘液生化分析以SDS-PAGE法和Coomassie藍(lán)染未感染羊或銀染染色法分析免疫羊組和未感染羊組樣品的蛋白差異。以凝集素印跡法檢查糖基化的差異，其中凝集素以生物素標(biāo)記，以抗生蛋白鏈菌素-過(guò)氧化物酶檢測(cè)。粘液中IgG的存在與否通過(guò)RAS/IgG-HRP印跡法顯示。
1.6粘液抗體的特征鑒定對(duì)免疫羊及未感染羊的樣品進(jìn)行L3均勻混合抗原的免疫印跡法探查?？贵w的結(jié)合通過(guò)對(duì)羊的IgG1，IgG2，IgA，及IgM的RAS/IgG-HRP或mAb檢測(cè)及隨后的GAM/Ig-HRP法進(jìn)行測(cè)定。
出鞘的L3與粘液上清在37℃下孵育4小時(shí)，用45％硫酸銨從粘液中沉淀抗體，或用蛋白G從粘液中純化抗體。孵育后幼蟲(chóng)用TBS-Tw清洗3次，通過(guò)在pH2.4的0.1M甘油-鹽酸緩沖液中孵育5分鐘洗脫全部結(jié)合態(tài)抗體。洗脫液以1M tris中和，用于探查T(mén)c，Ns，Cc中的L3抗原的印跡。
體積為500毫升的免疫羊腸道內(nèi)容物用45％硫酸銨處理以回收抗體。在透析后將抗體用于探查L(zhǎng)3抗原，從蛋白G-Sepharose上洗脫的粘液上清或粘液抗體與幼蟲(chóng)共孵育2小時(shí)，用TBS-Tw清洗3次后，與FITC-RAS/IgG反應(yīng)。清洗后用熒光顯微法檢查幼蟲(chóng)。
幼蟲(chóng)在羊經(jīng)感染后的不同時(shí)間收集，用上述免疫熒光及免疫印跡法和免疫金電鏡檢查法進(jìn)行分析。將幼蟲(chóng)固定在BGPA固定劑(90℃的含1％戊二醛及15％飽和苦味酸的0.1M磷酸緩沖液)中。埋入部分以蛋白G純化的粘液抗體進(jìn)行染色，隨后用金標(biāo)記抗羊抗體。
用于體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)的粘液樣本的抗體滴度以EIA法估算。微滴度板以Tc L3抗原包被，并與粘液稀釋液反應(yīng)。經(jīng)清洗后，結(jié)合態(tài)抗體通過(guò)對(duì)羊的IgA的RAS/IgG-HRP或mAb檢測(cè)及隨后的GAM/Ig-HRP法進(jìn)行測(cè)定。
1.7單克隆抗體PAB-1的制備小鼠以含有Tc幼蟲(chóng)表面抗原的多聚酰胺凝膠膠片進(jìn)行免疫，該抗原在膠中的位置通過(guò)印跡相鄰泳道和檢測(cè)所述的粘液抗體來(lái)確定。浸泡含有抗原的凝膠膠片，將其與等量的不完全油佐劑混合，并注射入小鼠，共注射2次，每次相隔兩周。十天后取受試血液，篩選Tc L3抗原的粗產(chǎn)品，并對(duì)表面抗原進(jìn)行部分純化。采用制備單抗的標(biāo)準(zhǔn)方法將陽(yáng)性反應(yīng)最強(qiáng)的小鼠的脾細(xì)胞與NS-1細(xì)胞融合，使用ELISA及印跡法進(jìn)行初級(jí)和次級(jí)篩選以證實(shí)特異性。制備出的大量mAb PAB-1培養(yǎng)物，以等分在-20℃保存。
用單克隆抗體PAB-1探查幼蟲(chóng)抗原的印跡，用RAM/IgG-HRP檢測(cè)結(jié)合態(tài)抗體。在90℃加熱出鞘的幼蟲(chóng)20分鐘使其固定，與PAB-1反應(yīng)，以TBS-Tw全面清洗，與RAM/IgG-FITC反應(yīng)，并在紫外光下檢驗(yàn)。針對(duì)非相關(guān)蛋白(羊細(xì)胞因子)的且具有相同PAB-1亞型的單克隆抗體用作陰性對(duì)照。
1.8幼蟲(chóng)抗原的免疫親和純化單克隆抗體與蛋白A-瓊脂糖反應(yīng)從而使該抗體結(jié)合，在PBS清洗去除未結(jié)合抗體之后，結(jié)合態(tài)抗體通過(guò)與交聯(lián)劑DSS(disuccinimidyl suberate)反應(yīng)而永久地固定在蛋白A上。再次清洗后，L3提取物流過(guò)用含有0.05％Tween 20的PBS液全面清洗過(guò)的PAB-1-蛋白A-瓊脂糖柱，以pH2.5的0.2M甘油-鹽酸液洗脫全部的結(jié)合抗原。洗脫液以1M Tris中和，在pH8.0的5mMTris中透析，在Speedvac濃縮器中濃縮?？贵w柱以PBS全面清洗重平衡。
從柱上洗脫的抗原樣本以SDS PAGE法及印跡法分析(圖23)。凝膠中的糖類以改良銀染法檢測(cè)(Kittelberger等，1993)；印跡上的糖類以生物素-酰肼反應(yīng)法檢測(cè)(Bouchez-Mahiout等，1999)。
1.9幼蟲(chóng)抗原的特征鑒定將出鞘的Tc L3以液氮冷凍，以研鉢及鉢槌磨碎，蛋白質(zhì)以2％Chaps+2％Tween 20、1％脫氧膽酸鈉、2％SDS，或9M脲溶解提取。提取物在10000g離心，上清在-20℃下貯存。蟲(chóng)卵、L1、L2、成蟲(chóng)線蟲(chóng)直接溶解于SDS PAGE樣品緩沖液(含有2％SDS，20mM DTT的pH6.8的50mM Tris-HCl)中。將SDS抗原提取物用于電泳法及印跡法研究，將Chaps及脲提取物用于二維電泳，脲提取物在pH7.4的50mM tris-HCl中透析2天后，去除脲，隨后進(jìn)行化學(xué)或酶學(xué)處理?？乖?jīng)適當(dāng)方法溶解后，也僅在緩沖液，即0.5％DOC或6M urea中進(jìn)行電泳。
在Tc L3脲提取物的二維電泳分析中，在以IPGphor(Pharmacia)固定于pI3-10長(zhǎng)條的IEF上進(jìn)行，隨后行SDS PAGE電泳。蛋白質(zhì)或以Coomassie藍(lán)染/銀染，或與粘液抗體印跡發(fā)生反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗原。Tc L3脲溶解抗原以上述方法透析，通過(guò)加入等體積的10％TCA、10倍體積的冷凍丙酮、9倍體積的氯仿∶甲醇(2∶1)或9倍體積的己烷∶異丙醇(3∶2)來(lái)使其沉淀。漩渦樣品并振動(dòng)10分鐘，隨后在10000g離心10分鐘，并應(yīng)用免疫印跡法分析離心出的沉淀，通過(guò)化學(xué)法及酶法降解分析糖?？乖?0mM的高碘酸在37℃處理24小時(shí)，或在60℃以1M NaOH及8MNaBH4處理18小時(shí)。樣品在電泳之前進(jìn)行透析。抗原在100℃下以肼處理7和14天，或在4℃下以三氟乙酸處理4和16小時(shí)，隨后化合物用一個(gè)Speedvac離心機(jī)揮發(fā)，剩余的抗原重溶解在SDS PAGE樣品緩沖液中。將各種酶溶解于生產(chǎn)商推薦的緩沖液中，并在37℃下與抗原溫浴22小時(shí)以進(jìn)行酶消化。所用的酶是N-糖苷酶F，胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，鏈霉蛋白酶，蛋白水解酶K，枯草桿菌蛋白酶，脂肪酶，溶菌酶，彈性蛋白酶，膠原蛋白酶，磷酸肌醇-磷脂酶C，磷脂酶A2，磷脂酶D。顯色底物酪蛋白-試鹵靈及彈性蛋白-剛果紅作為顯示蛋白酶及彈性蛋白酶的活性的對(duì)照。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，抗原在90℃下加熱變性20分鐘，隨后以胰蛋白酶或氫氧化鈉消化。在0.5％SDS、15mM DTT、50mM EDTA或2mM CaCl2存在或不存在的條件下于50℃下維持18小時(shí)來(lái)進(jìn)行蛋白酶K的消化。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、古巴毛樣線蟲(chóng)和匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)的幼蟲(chóng)提取物也在相似的條件下用蛋白酶K處理。
1.10用35kDA的抗原進(jìn)行的免疫用溶于含有Span 85、Tween 85及蓖麻油(比例是5.4∶4.6∶90)的菜油佐劑中的35kDa抗原，對(duì)5只12月齡的Romney羊進(jìn)行腹腔注射，如每2周一次，共3次?？乖瓘碾娪痉蛛x出的TcL3凝膠膠片上得到。電泳后將每一個(gè)凝膠的條帶轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素上與免疫粘液反應(yīng)以檢測(cè)35kDa的抗原。用RAS/IgG-HRP進(jìn)一步處理后，將印跡與凝膠的主要部分重新一一對(duì)應(yīng)，切下與35kDA抗原位置相對(duì)應(yīng)的凝膠片段。將取下的膠片置入裝有100mM pH7.8的trisHCl的透析管中，將透析管置入轉(zhuǎn)印槽中在50v下維持3小時(shí)以對(duì)凝膠中的抗原進(jìn)行電洗脫。收集多個(gè)洗脫液，通過(guò)BCA實(shí)驗(yàn)估計(jì)蛋白產(chǎn)出率約是0.2mg/ml。用Ultraturrax超聲勻漿器將抗原與同等量的菜油佐劑相混合。每一只羊每次注射時(shí)接受0.2毫克左右的總蛋白量，但是糖類抗原的量未知。對(duì)照羊腹腔注射生理鹽水加佐劑。在第三次注射結(jié)束2周之后所有的羊通過(guò)口服感染40000只Tc L3。在感染3-4周后獲取糞便中蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)資料。
2.結(jié)果2.1.體外實(shí)驗(yàn)所有的粘液或經(jīng)不同處理的粘液在體外引起幼蟲(chóng)結(jié)塊的能力如表1所示，結(jié)果顯示透析或低速離心不影響免疫粘液使幼蟲(chóng)結(jié)塊的能力，100000×g離心使幼蟲(chóng)結(jié)塊的效應(yīng)降低，但是洗滌劑Tx-100或CHAPS存在時(shí)例外。粘液在60℃加熱5分鐘后使幼蟲(chóng)結(jié)塊的能力仍然存在，但是在100℃加熱后消失。粘液經(jīng)蛋白酶消化或高碘酸氧化之后失去活性，但是脂肪酶消化無(wú)失活作用。這種幼蟲(chóng)結(jié)塊作用與粘液中大分子量的成分相關(guān)。
2.2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)L3與遞增體積的粘液共孵育后使未感染受體羊中的幼蟲(chóng)排出或數(shù)目減少的效應(yīng)如圖1所示。幼蟲(chóng)與5或10毫升未感染羊的粘液共孵育后仍然能夠在小腸前5米腸段正常生長(zhǎng)。與免疫羊的粘液共孵育的幼蟲(chóng)隨共孵育粘液體積的增加而逐漸地移位或消失。與未感染羊的粘液相比較，與10毫升免疫羊粘液共孵育的幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)數(shù)目減少82％，且在腸道的前5米腸段幼蟲(chóng)排出率達(dá)100％。
L3與10毫升粘液共孵育不同時(shí)間后的效果如圖2所示。幼蟲(chóng)與免疫羊粘液共孵育的時(shí)間低至1小時(shí)的情況下，幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)數(shù)目減少46％，且在腸道的前5米腸段處幼蟲(chóng)排出率達(dá)81％。共孵育的時(shí)間為4，10，24小時(shí)時(shí)的減少超過(guò)94％，排出超過(guò)93％。
L3與16份未感染羊的粘液樣品及25份免疫羊的粘液樣品共孵育后對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的效應(yīng)如圖3所示。總體上，接受L3+免疫羊粘液的受體的幼蟲(chóng)減少率達(dá)67％(范圍0-95％)；給予L3+免疫羊粘液的羊的腸道前5米腸段的幼蟲(chóng)生長(zhǎng)率減少80％(p＜0.001)。
粘液收集時(shí)間對(duì)其抗幼蟲(chóng)性質(zhì)的影響如圖4所示。在最后一次以幼蟲(chóng)免疫2-3天后收集到的粘液的活性大致上比一周后或更晚時(shí)刻收集的粘液的活性強(qiáng)?；貧w分析表明免疫后粘液收集時(shí)間與其保護(hù)作用間呈顯著的陰性相關(guān)關(guān)系。
L3與未感染羊或免疫羊粘液的經(jīng)清洗/未經(jīng)清洗過(guò)的100000×g離心上清共孵育后的效應(yīng)如表2所示。結(jié)果顯示L3與未感染羊粘液的上清或經(jīng)清洗后的上清共孵育后能夠在未感染的受體羊上生長(zhǎng)。與此相反，L3與免疫羊粘液的上清或經(jīng)清洗后的上清共孵育后大部分不能夠在未感染羊接受者上生長(zhǎng)，與未感染羊粘液組相比較數(shù)目減少了91％。
2.3粘液生物化學(xué)粘液的電泳分離結(jié)果如圖5所示。免疫羊及未感染羊粘液的蛋白總體情況高度復(fù)雜，兩系列的粘液間未見(jiàn)清楚明了的差異，凝集素印跡也表明兩系列顯示含有糖基的粘液都具有復(fù)雜的糖蛋白性質(zhì)(圖6，7，8)。另外凝集素對(duì)免疫羊粘液或未感染羊粘液的結(jié)合的差異也不明顯，而花生凝集素對(duì)大部分的免疫羊樣品在與Ig的重鏈及輕鏈對(duì)應(yīng)的約70000及28000mw處染色增強(qiáng)(圖7A)。然而，當(dāng)粘液與RAS/IgG-HRP反應(yīng)時(shí)，所有樣品均見(jiàn)55000及27000的主要條帶，其可能與IgG的重鏈及輕鏈對(duì)應(yīng)(圖8B)。
2.4粘液印跡用粘液或自粘液回收的抗體探查T(mén)c L3的免疫印跡結(jié)果如圖9所示。6個(gè)未感染羊的樣本(第13-18道)不與L3抗原反應(yīng)。免疫羊的粘液樣本主要和35kDa的條帶反應(yīng)，且兩只羊的腸內(nèi)容物通過(guò)硫酸銨沉淀得到的抗體的表現(xiàn)與此相同(第8，9道)。免疫羊粘液上清在蛋白G-瓊脂糖上純化后的抗體以及L3與免疫羊粘液共孵育后酸透析得到的抗體也與35kDa條帶反應(yīng)(第4，7道及第6，20道)。接受3次Tc截短型感染的羊的血清還包括識(shí)別35kDa抗原和許多其他抗原的抗體(未顯示)。與35kDa條帶反應(yīng)的粘液抗體的亞型特異性如圖10所示。存在IgG1及IgA亞型抗體，但是IgG及IgM未檢出。
用Tc免疫羊粘液探查腸道感染性線蟲(chóng)匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)(Ns)和古巴毛樣線蟲(chóng)(Cc)的L3抗原提取物的免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)它主要與22kDa的條帶反應(yīng)(圖11，第9，13道)。接受Ns截短型感染的羊的粘液與Ns及Cc的抗原反應(yīng)(第12及16道)，也與Tc的35kDa條帶反應(yīng)(第8道)。將260000只出鞘的Tc L3與2ml免疫粘液共孵育使粘液內(nèi)抗體完全消失(第1道)。用膠體金蛋白染色法檢測(cè)印跡上的蛋白(第4道)，在與免疫粘液的抗體檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的區(qū)域并未發(fā)現(xiàn)染色(第3，4道)。腸道線蟲(chóng)匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)及古巴毛樣線蟲(chóng)和胃線蟲(chóng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)及環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)的L3提取物以Tc免疫羊粘液探查，發(fā)現(xiàn)在Tc和Hc的35kDa處，Oc的39kDa處；Cc的46kDa和22kDa和Ns的22kDa發(fā)生發(fā)應(yīng)(圖12)。圖33示腸道線蟲(chóng)T.axei(Ta)、T.vitrinus(Tv)、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)(Ooi)、C.oncophera(Co)、D.eckerti(De)、胃線蟲(chóng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Hc)及環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)(Oc)的1M NaOH提取物以Tc免疫羊粘液探查的結(jié)果，顯示在Ta、Tv和Hc的35kDa處，Oo的45，35，33和30kDa處，Co的45kDa和20kDa，Nb的12kDa和9kDa處，以及De的30kDa處發(fā)生反應(yīng)。
粘液IgG及IgA抗體滴度與粘液體內(nèi)給予時(shí)所提供的保護(hù)作用之間的相互關(guān)系以線性回歸法分析(圖13)?？筁3抗原的IgG及IgG抗體的滴度與其保護(hù)作用之間存在著明顯的關(guān)系(R2＝0.6，P＜0.01)粘液活組織檢查發(fā)現(xiàn)樣本的抗體滴度自免疫3天后達(dá)到高水平(圖14)，然而，IgG及IgA的滴度到16天后下降，但是至免疫后第37天時(shí)仍然處于高于基線的水平。
幼蟲(chóng)的免疫熒光染色結(jié)果如圖15所示。出鞘的L3在與免疫羊粘液共孵育后顯示強(qiáng)的表面熒光，但是與未感染羊的粘液共孵育并不能(上圖)。在感染羊2，3，4天后獲得的幼蟲(chóng)也顯示出表面染色(未圖示)，但是感染第5天許多幼蟲(chóng)不被抗體染色，且發(fā)現(xiàn)一些處于蛻皮階段(下圖)。蛻皮的L3的表皮與來(lái)自免疫羊粘液的抗體反應(yīng)，但是出現(xiàn)的L4不被染色。在感染的6，7天獲得的L4不顯示表面染色。
免疫金電鏡檢查的結(jié)果與此類似，L3階段在表皮出現(xiàn)表面標(biāo)記(圖16，B)。感染后第2天再觀察金標(biāo)記，在第3，4天變?nèi)?，?天消失(分別見(jiàn)圖C，D，E和F)。
在蟲(chóng)卵、L1、L2、L3、及免疫羊感染不同時(shí)間后獲取的幼蟲(chóng)的抗原提取物以粘液抗體探查進(jìn)行免疫印跡(圖17及18)。L3在感染前至感染5天后發(fā)現(xiàn)存在35kDa的抗原，但是在蟲(chóng)卵期、L1或L2、感染后7～14天的L4、或線蟲(chóng)成蟲(chóng)上無(wú)此抗原。
2.5PAB-15單克隆抗體
PAB-1單克隆抗體及Tc免疫羊粘液的抗體與Tc L3抗原的印跡反應(yīng)的對(duì)比在圖19中顯示。單抗在35kDa處與主要的Tc L3抗原，在30-40kDa處與離散抗原和一些更低分子量的抗原反應(yīng)。
其他種屬的線蟲(chóng)的抗原的鑒定結(jié)果如圖20所示。腸道線蟲(chóng)匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)和古巴毛樣線蟲(chóng)及胃線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)和環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)的L3提取物以單克隆抗體PAB-1探查，發(fā)現(xiàn)在Tc及Hc的大約35kDa處，Oc的39kDa處，Cc的46kDa及22kDa處，Ns的22kDa處發(fā)生反應(yīng)(圖20)。將L3提取物用蛋白酶K消化后，以取自免疫羊粘液的抗體或單克隆抗體MAB-1進(jìn)行免疫印跡發(fā)現(xiàn)該酶不消化幼蟲(chóng)抗原(圖19和20)。
以抗鼠FITC結(jié)合物染色與出鞘的Tc L3反應(yīng)的mAb PAB-1，發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)的表面熒光(圖21)，IgG3對(duì)照單抗不與幼蟲(chóng)表面反應(yīng)。
2.6幼蟲(chóng)抗原的免疫親和純化使用鍵合在蛋白A-瓊脂糖上的單抗PAB-1來(lái)免疫親和純化幼蟲(chóng)抗原的結(jié)果如圖22所示。對(duì)洗脫物進(jìn)行銀染發(fā)現(xiàn)沒(méi)有蛋白染色帶在幼蟲(chóng)抗原的可能電泳區(qū)域出現(xiàn)。在洗脫物中檢測(cè)出一個(gè)單一的糖染色條帶，其位置與以免疫羊粘液抗體免疫印跡法檢出的抗原在相同的分子量的位置上。用一種能與經(jīng)高碘酸氧化后暴露的糖基相結(jié)合的生物素-酰肼試劑也在原位標(biāo)記了該條帶。
2.7幼蟲(chóng)抗原的特征鑒定L3抗原的各種化學(xué)或酶處理對(duì)35kDa抗原與粘液抗體的免疫印跡反應(yīng)的影響如圖23-30所示?？乖?7℃下加熱18小時(shí)對(duì)其中的35kDa抗原的免疫印跡反應(yīng)無(wú)影響(圖23，第2道)，用高碘酸或脂肪酶處理輕微降低信號(hào)強(qiáng)度(圖23，第3，5道)，但是鏈霉蛋白酶無(wú)作用(第4道)，35kDa抗原在酸沉淀或溶劑沉淀后發(fā)現(xiàn)存在于沉淀物中(第6-9道)。
以胰蛋白酶，胃蛋白酶，蛋白水解酶K，磷脂酶A2處理L3抗原使印跡反應(yīng)變得更加分散，但是不降低分子量(圖24，第2，3，5，11道)。以木瓜蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，裂解酶處理L3抗原引起信號(hào)強(qiáng)度降低，但是不改變分子量(第6-8道)。鏈霉蛋白酶，脂肪酶，溶菌酶，磷酸肌醇-磷脂酶C，磷脂酶D沒(méi)有作用(第4，9，10，12，13道)。以彈性蛋白酶處理產(chǎn)生分子量稍微降低的條帶(圖25，第1道)。膠原蛋白酶、蛋白水解酶K在37℃下無(wú)作用(第2，3，4道)。在多種條件下蛋白水解酶K在50℃處理18小時(shí)也不能毀壞35kDa抗原，仍能夠在印跡上檢測(cè)到(第6-9道)。以N-糖苷酶F處理L3抗原引起35kDa抗原印跡信號(hào)強(qiáng)度降低，但是不改變分子量(圖26，第4道)，而在此條件下對(duì)照糖蛋白胎球蛋白被降解(第2道)，這說(shuō)明酶具有活性。以1M氫氧化鈉在60℃處理18小時(shí)后，印跡上分子量稍微降低的條帶的數(shù)目增加，但是在35kDa處的反應(yīng)仍然是主要的(圖27，第2道)。用NaOH加NaBH4處理，銀染后未見(jiàn)任何的蛋白，但是35kDa抗原的印跡反應(yīng)與對(duì)照抗原比較未見(jiàn)減弱(圖27，第3道)。
L3抗原以氫氟酸在4℃處理48小時(shí)，或以酰肼在20℃處理16小時(shí)不能毀壞35kDa抗原(圖28)。以酰肼在100℃處理7或14天，與未處理的對(duì)照抗原相比印跡的強(qiáng)度降低(圖29，第1，2道)。以氫氟酸處理4或16小時(shí)毀壞了抗原(圖29，第4，5道)。
如免疫印跡所示(圖30)，L3抗原以下列程序處理不能毀壞35kDa抗原蛋白酶K+SDS在50℃下處理4小時(shí)或20小時(shí)(第1及2道)；0.1-1.0M NaOH在37℃下處理18小時(shí)(圖30，第3，6，7，8道)；在90℃下進(jìn)行20分鐘的熱變性，然后以1M NaOH消化(第4道)；不論其是否在90℃下進(jìn)行了20分鐘的熱變性都在37℃下用胰蛋白酶消化22小時(shí)(第10及14道)；蛋白酶K+SDS+DTT在50℃下處理22小時(shí)(第12道)。來(lái)自5個(gè)種屬的線蟲(chóng)的L3抗原以蛋白酶K消化都不能破壞35kDa抗原，或其他種屬的46、35或22kDa的交叉反應(yīng)抗原(圖20)。
Tc L3提取物在原生條件下和在0.5％DOC或6M脲存在下以電泳法及印跡法分析?？乖诖藯l件下電泳出高分子量的模糊帶(圖32)。向樣品加入還原劑(20mM DTT)和電泳緩沖液不改變這些結(jié)果(未圖示)。
Tc L3脲提取物進(jìn)行二維電泳分析顯示了35kDa處的強(qiáng)免疫印跡反應(yīng)，其超出pH3-10范圍(圖33)。盡管印跡強(qiáng)度大，但相應(yīng)區(qū)域未見(jiàn)蛋白。
3.6羊免疫實(shí)驗(yàn)FEC(糞便線蟲(chóng)計(jì)數(shù))數(shù)據(jù)如表3所示。在感染3周后，組間FEC無(wú)顯著差異，但是免疫組第四周的計(jì)數(shù)顯著下降(p＜0.05)。綜合兩周的計(jì)數(shù)值，免疫組FEC總值具顯著的下降(p＜0.05)。
圖34顯示了蛇形毛圓線蟲(chóng)L3提取物及純化的糖類幼蟲(chóng)抗原(c)在非變性條件(無(wú)洗滌劑及還原劑)下的凝膠電泳(8％PAGE)及免疫印跡分析結(jié)果。凝膠進(jìn)行了蛋白質(zhì)或糖染色。印跡與PAB-1單抗反應(yīng)后，與兔抗鼠Ig-HRP結(jié)合物或免疫羊粘液反應(yīng)，最后與免疫羊Ig-HRP結(jié)合物反應(yīng)。
表1.免疫羊粘液經(jīng)不同處理后的體外抗L3活性處理方法 幼蟲(chóng)結(jié)塊*未處理+++透析 +++10000×g離心，上清+++50000×g離心，上清++100000×g離心，上清 +100000×g離心，上清，DTT -100000×g離心，上清，TX100++100000×g離心，上清，CHAPS++還原并烷基化 ++60℃加熱 ++100℃加熱 -胃蛋白酶 +鏈霉蛋白酶-高碘酸-脂肪酶++＞100000mw滯留物 +++10-100000mw -3-10000mw -*結(jié)塊分值+++＝大部分幼蟲(chóng)成大團(tuán)狀結(jié)塊；++＝一些結(jié)塊；+＝輕微結(jié)塊；-＝無(wú)結(jié)塊。
表2.L3與未感染羊/免疫羊的粘液、經(jīng)100000×g離心的粘液上清或經(jīng)上述離心后清洗過(guò)的上清共孵育，注入未感染的受體羊一周后小腸5米腸段內(nèi)生長(zhǎng)的蛇形毛圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的數(shù)目樣品 0-5米 5-10米 10-15米總計(jì)減少率％*未感染羊的粘液10664 1400 10804上清 24978 5900 25568上清+清洗 8140 1480 8288免疫羊的粘液 148 7700 918 91上清 130 0 396526 98上清+清洗 224 4200 644 92*％與未感染羊的粘液的總計(jì)量相比幼蟲(chóng)數(shù)目的減少量。
表3.用35kDA抗原免疫的羊的FEC數(shù)據(jù)組別 各自的FEC 平均值SD第3周對(duì)照 600 700 1300 1500 1700 1800 2500 2500 1575 715免疫的300 400 800 1900 24001160 940第4周對(duì)照 900 1100 1300 1700 1800 2200 2500 40001938 993免疫的600 600 900 1100 1300 900 308*與對(duì)照有明顯差別(P＜0.023，Kruskall-Wallis測(cè)試)3.討論免疫羊粘液影響線蟲(chóng)存活的能力已經(jīng)在先期的工作中發(fā)現(xiàn)，如果將幼蟲(chóng)與粘液共孵育，幼蟲(chóng)出篩遷徙就會(huì)受抑制(Douch等1983)。最近我們觀察到幼蟲(chóng)與免疫粘液共孵育后常成團(tuán)結(jié)塊，且這種幼蟲(chóng)若通過(guò)十二指腸導(dǎo)管注入未感染羊后不能正常生長(zhǎng)(Harrison等1999)。這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了本研究，結(jié)論性地表明免疫粘液能夠有效防止幼蟲(chóng)生長(zhǎng)，這種對(duì)感染的保護(hù)程度取決于免疫后收集粘液的時(shí)間及劑量?？贵w下降的水平與時(shí)間的關(guān)系在粘液或組織檢查樣本中可以觀察到，該樣本取自免疫5星期后的截短型感染羊。免疫粘液的100000×g離心上清也能防止幼蟲(chóng)生長(zhǎng)，該發(fā)現(xiàn)表明這種作用存在于粘液的可溶性成分中，而不是由于粘液的物理阻礙性，如粘性引起。共孵后清洗幼蟲(chóng)并不影響免疫粘液上清防止幼蟲(chóng)生長(zhǎng)的效果，這表明活性因子與幼蟲(chóng)發(fā)生了結(jié)合。
免疫粘液經(jīng)透析、離心或分子篩過(guò)濾處理后體外進(jìn)行幼蟲(chóng)結(jié)塊分析，結(jié)果表明其結(jié)塊能力與粘液中的高分子量成分相關(guān)。熱處理、蛋白酶消化表明結(jié)塊需要粘液中的蛋白組分。然而，SDSPAGE分析及Coomassie藍(lán)染/銀染法檢測(cè)蛋白并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)免疫羊和未感染羊樣品組中的粗蛋白存在差異。與此相似，凝集素印跡法也未發(fā)現(xiàn)兩組粘液的糖蛋白組分存在差異。例外的是免疫粘液樣本中的花生凝集素，其可以檢測(cè)到存在于重鏈及輕鏈上的糖，重鏈為70kDa，表明IgA存在。印跡法也顯示了所有粘液樣本中存在IgG。
上述發(fā)現(xiàn)和免疫粘液中存在IgG及IgA表明是識(shí)別線蟲(chóng)抗原的抗體導(dǎo)致了幼蟲(chóng)結(jié)塊并在體內(nèi)提供保護(hù)。以免疫粘液探查幼蟲(chóng)抗原的免疫印跡發(fā)現(xiàn)存在IgG1及IgA抗體，這些抗體主要與主抗原的35kDa反應(yīng)，也和9、12、20、30-45kDa的離散區(qū)域反應(yīng)。重要的是，與免疫粘液共孵育后，用從完整出鞘幼蟲(chóng)中洗脫下的抗體探查L(zhǎng)3抗原的印跡也表明該抗原是優(yōu)勢(shì)反應(yīng)抗原。這些結(jié)果與表面熒光染色法及免疫金電鏡法的結(jié)果一起說(shuō)明了抗原表型存在于幼蟲(chóng)表面，抗35kDa抗體存在于用于體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)的粘液樣本中，而且IgG、IgA的滴度與免疫粘液提供的保護(hù)程度存在明顯相關(guān)。蛇形毛圓線蟲(chóng)免疫羊的粘液抗體也識(shí)別其它腸道線蟲(chóng)古巴毛樣線蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、T.axei、T.vitrinus、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)、C.oncophera、巴西奴卡菌、D.eckerti和胃線蟲(chóng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)及環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)的幼蟲(chóng)提取物印跡上的抗原。這種交叉反應(yīng)顯示其他種屬線蟲(chóng)表面存在與蛇形毛圓線蟲(chóng)抗原功能類似的表面分子，可以是免疫反應(yīng)的標(biāo)靶。PAB-1單抗也與這些抗原反應(yīng)，因此能用來(lái)鑒定與純化這些種屬寄生性線蟲(chóng)的表面抗原。所有產(chǎn)生交叉反應(yīng)的受試抗原對(duì)蛋白酶K的消化具有抗性的發(fā)現(xiàn)證明了它們同樣也不是蛋白質(zhì)，而是與蛇形毛圓線蟲(chóng)的35kDa抗原的性質(zhì)相似。
與蛋白A-瓊脂糖相連結(jié)的PAB-1單抗能純化蛇形毛圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)表面抗原，發(fā)現(xiàn)這種蛇形毛圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)表面抗原主要是糖類，這通過(guò)其對(duì)蛋白酶K等蛋白酶消化具有抗性，對(duì)糖基進(jìn)行銀染改良法染色和用能與暴露的糖基結(jié)合的生物素-酰肼試劑標(biāo)記得到證實(shí)。該抗原不被諸如銀染/Coomassie藍(lán)染法等的蛋白質(zhì)檢測(cè)術(shù)所染色。該抗原對(duì)脂肪酶降解有抗性，且不溶于有機(jī)溶劑，這表明脂類成分不存在或不能進(jìn)入。用N-糖苷酶F處理不影響抗原，這說(shuō)明糖不是N-連接的，或者說(shuō)明酶不能進(jìn)入而產(chǎn)生攻擊作用。堿處理或酰肼廣泛水解不毀壞抗原，表明其糖結(jié)構(gòu)不常見(jiàn)。以三氟乙酸進(jìn)行強(qiáng)酸水解，抗原遭毀壞。
以PAB-1單抗探查蛇形毛圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)提取物，觀察到印跡上的低分子量抗原以階梯狀條帶形式出現(xiàn)多級(jí)條帶圖案，這表明35kDa抗原的結(jié)構(gòu)含有由更小單元組成的多聚體。但是，在存在于幼蟲(chóng)表面時(shí)的原生狀態(tài)下，抗原是一個(gè)高分子量的復(fù)合物，正如非變性條件下進(jìn)行的電泳結(jié)果所顯示。將該復(fù)合物溶解于SDS+DTT使其降解為一種在印跡的35kDa處能檢測(cè)到的抗原，表明該復(fù)合物是一種35kDa抗原的多聚物或35kDa抗原與其他未明組分的異聚體。該抗原在以等電聚焦分離時(shí)顯示出帶電異質(zhì)性，這再次說(shuō)明它是一個(gè)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明了這種存在于幼蟲(chóng)外表面的分子復(fù)合物可能對(duì)線蟲(chóng)宿主的胃腔、腸道內(nèi)所能有的物理?xiàng)l件所致的降解具有抗性。線蟲(chóng)表面抗原的這些性質(zhì)所隱含的功能性作用尚未確定，但是個(gè)復(fù)合物可能在幼蟲(chóng)通過(guò)宿主系統(tǒng)內(nèi)的敵對(duì)環(huán)境達(dá)到其嗜好的小腸時(shí)發(fā)揮臨時(shí)保護(hù)作用。35kDa抗原僅僅在L3感染前直至感染后5天內(nèi)出現(xiàn)，這表明這種覆層是幼蟲(chóng)通過(guò)胃腔時(shí)保護(hù)所需要的。當(dāng)在小腸內(nèi)蛻皮成L4過(guò)程中，由于不需要，因而這種保護(hù)性覆層蛻離。很明顯針對(duì)該保護(hù)性覆層的免疫反應(yīng)能嚴(yán)重?fù)p壞線蟲(chóng)在宿主體內(nèi)成功生長(zhǎng)的能力，因此對(duì)線蟲(chóng)控制具有廣泛意義。在對(duì)羊的初級(jí)疫苗試驗(yàn)中，用含有部分純化35kDa抗原和油佐劑的疫苗對(duì)動(dòng)物免疫，與對(duì)照組比較，免疫組的糞便蟲(chóng)卵數(shù)量顯著減少。
本發(fā)明的所有方面僅以實(shí)施例的形式描述，需說(shuō)明的是，在不超出所附權(quán)利要求的范圍的情況下可以對(duì)其進(jìn)行的修改與增加。
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Waller，Anthelmintic Resistance.Veterinary Parasitology，1997，391-41權(quán)利要求
1.分離的單克隆抗體mAb PAB-1，于2002年1月24日在ATCC保藏，登記號(hào)為PTA-4005，其能夠與線蟲(chóng)L3表面的抗原結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體，其中該抗體與源自蛇形毛圓線蟲(chóng)(T.colubriformis)L3的抗原結(jié)合，且在還原的條件下該抗原在SDS PAGE凝膠中約35kDa處出現(xiàn)條帶。
3.如權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體，其與L3的表面抗原結(jié)合，該表面抗原選自a)古巴毛樣線蟲(chóng)(C.curticei)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在46kDa處和22kDa處出現(xiàn)條帶；b)匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)(N.Spathiger)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在22kDa處出現(xiàn)條帶；c)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(H.contortus)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在35kDa處出現(xiàn)條帶；d)環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)(O.circumcincta)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在約35-39kDa處出現(xiàn)條帶；e)T.axei或T.vitrinus上的表面抗原，其在還原條件下SDSPAGE凝膠中基本上在35kDa處出現(xiàn)條帶；f)結(jié)節(jié)線蟲(chóng)(O.ostertagi)上的表面抗原，其在還原條件下在SDS PAGE凝膠中基本上在30-45kDa處出現(xiàn)條帶；g)C.oncophera上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在20kDa處和約45kDa處出現(xiàn)條帶；h)巴西奴卡菌(N.brasiliensis)上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在9kDa處和約12kDa處出現(xiàn)條帶；i)D.eckerti上的表面抗原，其在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在30kDa處出現(xiàn)條帶。
4.如權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體，其中當(dāng)該抗體與固體支持物連結(jié)時(shí)，其能用于通過(guò)免疫親和色譜法純化表面抗原。
5.源自線蟲(chóng)L3的分離的糖表面抗原，其中該抗原能與單克隆抗體mAb PAB1結(jié)合，該單克隆抗體已于2002年1月24日在ATCC保藏，登記號(hào)為PTA-4005。
6.基本上如權(quán)利要求5所述的分離的抗原，其中該抗原在還原條件下SDS PAGE凝膠中基本上在20-35kDa間出現(xiàn)條帶，或基本上在9kDa和12kDa處出現(xiàn)條帶。
7.如權(quán)利要求5所述的分離的抗原，其中該抗原源自蛇形毛圓線蟲(chóng)L3。
8.如權(quán)利要求5所述的分離的抗原，其中該抗原源自線蟲(chóng)L3，該線蟲(chóng)L3分離自古巴毛樣線蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、T.axei、T.vitriyzus、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)、C.oncophera、巴西奴卡菌或D.eckerti。
9.含有如權(quán)利要求5所述的抗原和藥學(xué)上或獸學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的組合物。
10.如權(quán)利要求5所述的抗原在制備用于預(yù)防、治療線蟲(chóng)感染或降低線蟲(chóng)感染易感性的組合物的用途。
11.如權(quán)利要求9所述的組合物用于受線蟲(chóng)感染的易感羊，以預(yù)防、治療線蟲(chóng)感染或降低其感染易感性，這些線蟲(chóng)選自蛇形毛園線蟲(chóng)、古巴毛樣線蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、T.axei、T.vitrinus、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
12.如權(quán)利要求9所述的組合物，該組合物用于除羊之外的易感動(dòng)物以預(yù)防、治療線蟲(chóng)感染或降低線蟲(chóng)感染易感性，其中這些其它種類的線蟲(chóng)也具有可通過(guò)與上述單克隆抗體PAB-1反應(yīng)來(lái)檢測(cè)的幼蟲(chóng)表面抗原。
13.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中的組合物還包含至少一種佐劑或細(xì)胞因子。
14.診斷易感動(dòng)物線蟲(chóng)感染的方法，該方法包括如下步驟a)自動(dòng)物獲得血液樣品；b)通過(guò)合適的檢驗(yàn)方法，分析血樣是否存在抗如權(quán)利要求3所述抗原的抗體。
15.如權(quán)利要求3所述的分離的抗體，其中該抗體來(lái)源于動(dòng)物的胃腸道粘液，這些動(dòng)物用選自下列的線蟲(chóng)的截短型感染免疫蛇形毛園線蟲(chóng)、古巴毛樣線蟲(chóng)、匙狀細(xì)頸毛樣線蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、環(huán)頸奧斯他胃蟲(chóng)、T.axei、T.vitrinus、結(jié)節(jié)線蟲(chóng)、C.oncophera、巴西奴卡菌和D.eckerti。
16.通過(guò)用如權(quán)利要求9所述的組合物給藥來(lái)預(yù)防、治療動(dòng)物線蟲(chóng)感染或降低線蟲(chóng)感染易感性的方法。
17.如權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的抗原用于在羊或其他易感動(dòng)物的腸道粘液內(nèi)引起抗體反應(yīng)以預(yù)防、治療線蟲(chóng)感染或降低線蟲(chóng)感染易感性的用途。
18.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗體用于檢測(cè)羊體內(nèi)線蟲(chóng)感染的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及到分離的單克隆抗體mAb PAB－1，該抗體于2002年1月24保藏于ATCC，登記號(hào)為PTA－4005，其能與線蟲(chóng)L3的表面抗原結(jié)合。本發(fā)明還涉及到能與該單克隆抗體結(jié)合的抗原以及該單克隆抗體和抗原在診斷和治療或預(yù)防線蟲(chóng)感染方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P33/00GK1625567SQ03802969
公開(kāi)日2005年6月8日 申請(qǐng)日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月30日
發(fā)明者加文·伯納德·李爾·哈里森, 韋恩·羅伯特·海恩, 休·道格拉斯·普爾福德, 查理·比克斯·舒梅克 申請(qǐng)人:奧維塔有限公司