專利名稱：Φc31整合酶多克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術與基因治療技術領域，具體涉及一種ΦC31整合酶的功能性表達、純化方法和相應的多克隆抗體及其應用。
背景技術：
噬菌體ΦC31整合酶作為絲氨酸重組酶家族的一員，在哺乳動物細胞中，ΦC31整合酶可將外源核苷酸序列定點整合到基因組的特異性位點上，近年來已成為在哺乳動物細胞中進行轉基因位點特異性重組操作和基因治療的有用工具。
1998年，Smith等用硫酸胺沉淀法首次純化出約68KD的原核表達的ΦC31整合酶，其可以與特異性的核苷酸序列attP，attB，attL，attR結合。凝膠漂移實驗證明ΦC31整合酶可以介導不可逆的重組反應。突變分析表明，ΦC31整合酶的12位的絲氨酸突變會失活其催化重組反應的能力，但并不改變其體外結合特異性DNA序列的能力。
Calos等人使用噬菌體ΦC31整合酶的真核表達質粒應用于哺乳動物細胞，表現(xiàn)了長期的目的基因的表達和特異性定點的整合在染色體上。說明其應用于基因治療和轉基因動物方面的可行性前景。Kuhn等加SV40的帶有核定位信號的11氨基酸的多肽到噬菌體ΦC31整合酶的C端，融合蛋白的整合效率提高了大約40％。ΦC31整合酶在哺乳動物細胞內的整合機理，細胞定位和毒性等目前還沒有說明。
本發(fā)明以原核表達系統(tǒng)表達了ΦC31整合酶，經體外檢測其的活性，并以純化的ΦC31整合酶蛋白為抗原，制備了抗ΦC31整合酶的多克隆抗體。該多克隆抗體經證明其可以特異性識別并結合ΦC31，可以用于檢測ΦC31蛋白和封閉ΦC31整合酶的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種ΦC31整合酶多克隆抗體及其制備方法和應用。
本發(fā)明提出的ΦC31整合酶多克隆抗體的制備方法如下使用常規(guī)方法(分子克隆指南，1998年第二版，薩姆布魯克等著，科學出版社)制備ΦC31蛋白的多克隆抗體?；具^程為(1)首先表達和純化ΦC31蛋白。鏈霉菌噬菌體ΦC31的cDNA(Genbank NoX59938)的質粒pCMVint(Calos等構建)為模板，用Spel和Xhol酶切質粒pCMVint，回收1.8kb的DNA片斷，然后連接到經Xbal和Sall酶切回收原核表達載體pMAL-p2X(New England公司)上，連接液轉化大腸桿菌TOP10(Novagen公司)中，經測序鑒定正確后，將質粒p2X-ΦC31轉化到TB1菌株(New England公司)中，進行大量誘導表達。為保證其活性，條件為37℃，4-6小時，IPTG 0.1-0.5mM。對大量誘導表達的菌體經超聲破菌后，用Amylose親和柱(New England公司)純化出MBP-ΦC31蛋白，如圖1的SDS-PAGE檢測所示，細菌裂解液中有116kDa處有預期的條帶。用Micon Ultrafiltration-15(Millipore公司)濃縮純化的蛋白。對濃縮后純化的融合蛋白用Xa Factor(New England公司)進行蛋白酶切，在約68kDa處出現(xiàn)預期的條帶；對經Xa Factor蛋白酶切純化的MBP-ΦC31蛋白后的產物，用過量的Amylose親和柱過柱，流出液即為純化的約68kDa的ΦC31蛋白(見圖1)。
(2)制備鏈霉菌噬菌體ΦC31的多克隆抗體。用純化的約68kDa的ΦC31蛋白直接與佐劑相混合，免疫動物注射(家兔，小鼠，大鼠等)，制得鏈霉菌噬菌體ΦC31多克隆抗體。例如，每次用0.1mg純化的ΦC31蛋白加上弗氏佐劑(Sigma公司)免疫家兔，每隔10天加強免疫共4次，用頸動脈取血法接取兔血清，沉淀離心后得到兔血清。采用10ug/ml的ΦC31蛋白包被滴定板進行ELISA測定抗體的滴度，抗體效價分析表明抗體效價達到1∶5000(見圖2)。
ΦC31整合酶的多克隆抗體的應用。(1)蛋白免疫印記實驗證明多克隆抗體可以特異性的與ΦC31蛋白結合(見圖3)。制備的多克隆抗體可以特異性的識別人類胚腫胃細胞系293細胞經質粒轉染表達的ΦC31整合酶的蛋白。(2)利用免疫熒光組織化學技術，ΦC31的多克隆抗體可以檢測標本中的ΦC31蛋白的分布，用羅丹明標記的羊抗兔抗體顯色表現(xiàn)為紅色(見圖4(c)，圖中為灰色部分)。(3)ΦC31的多克隆抗體在體外封閉ΦC31整合酶的作用?；钚缘摩礐31整合酶蛋白可以在體外結合并催化DNA的重組反應，利用ΦC31的多克隆抗體和活性ΦC31整合酶混合后，檢測ΦC31整合酶的活性，經瓊脂糖凝膠電泳檢測證明封閉后的ΦC31整合酶失去活性(見圖5)。


圖1.噬菌體整合酶ΦC31的表達與純化(SDS-PAGE檢測，考馬斯亮蘭染色)條帶1是未誘導的重組菌，條帶2.誘導后重組菌，條帶3.超聲后上清，條帶4.超聲后沉淀，條帶5.經Amyrose純化后的產物，主要是MBP-ΦC31融合蛋白；條帶6.經Xa Factor因子酶切，親和層析后的最終產物，主要為ΦC31融合蛋白。條帶7是蛋白分子量Markers。
圖2.噬菌體整合酶ΦC31的多克隆抗體效價測定整合酶ΦC31兔多克隆抗體的效價為1∶5000。
圖3.兔多克隆抗體特異性識別人293細胞表達的整合酶ΦC31。
圖4.整合酶ΦC31多克隆抗體檢測COS-7細胞表達的ΦC31分布，圖4(c)中灰色表示ΦC31主要分布在COS-7細胞的細胞質中。圖4(B)中灰色表示DAPI染色所示的細胞核。
圖5.ΦC31多克隆抗體封閉體外ΦC31活性圖示。其中，A為整合酶ΦC31檢測活性的策略。B為活性的ΦC31作用瓊脂糖電泳的結果。C為活性ΦC31作用后轉化細菌和藍白斑檢測結果。D為ΦC31抗體封閉其活性后的玉脂糖電泳的檢測結果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例子，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例子僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如分子克隆指南(1998年第二版，薩姆布魯克等著，科學出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
1.噬菌體整合酶ΦC31蛋白的構建，表達，純化噬菌體整合酶ΦC31的表達質粒的構建用SpeI和XhoI酶切質粒pCMVint，回收1.8kb的片斷，用博大泰克公司的試劑盒純化.XbaI和SalI雙酶切并回收7.3kb的表達載體pMAL-p2X(New England公司產品)。用連接試劑盒(TAKARA公司)連接上述兩個DNA片斷。連接產物轉化用氯化鈣法大腸桿細菌TOP10，在含氨芐青霉素(終濃度50μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進行測序。DNA序列分析結果表明DNA序列與鏈霉菌噬菌體ΦC31的cDNA(Genbank NoX59938)序列完全相同。
噬菌體整合酶ΦC31的表達純化然后用氯化鈣法將測序正確的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產品)。宿主菌BL21(p2X-ΦC31)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG為0.1-0.3mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時。離心收集菌體，經超聲波破碎菌體，離心收集上清，用能與麥芽糖結合蛋白(MBP)結合的親和層析柱Amyrose(New England公司產品)進行層析，得到了純化的MBP-ΦC31融合蛋白。融合蛋白被Factor Xa酶切后，用過量的Amylose親和柱層析，流出液主要為ΦC31蛋白，經SDS-PAGE電泳，在68kDa處得到一單一的條帶。
2.噬菌體整合酶ΦC31蛋白的多克隆抗體制備及其效價測定多克隆抗體的生產可用純化的ΦC31蛋白直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
用0.1mg上述ΦC31蛋白加上完全弗氏佐劑免疫家兔，每隔10天后再用ΦC31蛋白加不完全弗氏佐劑加強免疫四次。采用經10μg/ml的ΦC31蛋白包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharosc從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離多克隆抗體。ELISA實驗的抗體效價分析表明，抗體效價達到5000∶1。
3.噬菌體整合酶ΦC31蛋白的多克隆抗體的特異性檢測制備表達ΦC31蛋白的293細胞裂解液105的293細胞(ATCC細胞庫)，接種培養(yǎng)在25cm2的培養(yǎng)板上，細胞培養(yǎng)基為DMEM(Gibco公司產品)，含氨芐青霉素50ug/ml，鏈霉素25ug/ml，小牛血清10％，5％CO2，37℃培養(yǎng)。當細胞鋪板率達到90％時，利用脂質體試劑(Invitrogen公司產品)混合5ug的pCMVint質粒轉染細胞，7-10小時后換新的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48-60小時后，收獲細胞。加蛋白質電泳上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，離心后進行SDS-PAGE。
蛋白免疫印記檢測上述制備的細胞裂解液按照常規(guī)方法的SDS-PAGE以后，電轉印制備印記膜。10％小牛血清封閉非特異性結合位點，加入ΦC31的多克隆抗體(1∶500)，在37℃放置1小時，PBS溶液清洗后，常規(guī)DAB試劑顯色(Tiangen公司)。Western blot實驗證明多克隆抗體可特異性地與ΦC31結合。
4.利用ΦC31多克隆抗體檢測ΦC31的細胞內位置和分布對表達ΦC31蛋白的哺乳動物細胞標本，經PBS清洗，多聚甲醛固定后，使用ΦC31的多克隆抗體包被，羅丹明標記的第二抗體作用和DAPI對細胞核染色。標本利用蔡司公司的雙光子激光共聚焦顯微鏡檢測細胞圖像表明ΦC31多克隆抗體能夠用免疫細胞組織化學的方法，很好的定位和跟蹤各種途徑表達的ΦC31整合酶?？功礐31蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術以及免疫學的試驗中，也可以用于檢測跟蹤活體標本中的ΦC31蛋白和突變修飾的ΦC31蛋白的位置和分布。
5.ΦC31多克隆抗體體外封閉ΦC31活性的方法噬菌體整合酶ΦC31蛋白具有重組酶的功能，在體外和體內試驗中能夠識別特異性的DNA序列(attP 34bp和attB 39bp)，重組形成不能被整合酶ΦC31識別的attL和attR序列(各包含attP和attB序列的一半組成)。整合酶ΦC31介導的重組反應受識別特異性的DNA序列的方向的影響，當attP和attB在兩個DNA分子上時，重組整合成為一個分子。當attP和attB同在一個DNA分子上時，依賴他們序列中的TTG為方向，同向重組刪除，反向顛倒attP和attB之間的DNA序列。根據(jù)整合酶ΦC31介導同在一個DNA分子同向的attP和attB重組的原理，我們用pBCBP+分子(Calos等構建)作底物，由整合酶ΦC31介導重組刪除反應，形成兩個小的DNA分子，pBC-attL和pBC-attR(見圖5-A)。探索的條件為20mmol/L HEPES(PH8.5)，0100mmol/L KCl，10mM Dithiothreitol，0.01％BSA)在30℃孵育20小時后，經轉化細菌后的藍白斑鑒定，白斑代表重組的產物pBC-attL的細菌(見圖5-C)。另外還可以對體外重組產物在進行過量的限制性內切酶的作用，使得產物線性化，進行瓊脂糖電泳鑒定結果(見圖5-B)
ΦC31多克隆抗體可以特異性與ΦC31蛋白結合，從而可以封閉ΦC31活性。利用體外將ΦC31多克隆抗體與純化的活性ΦC31蛋白共孵育后，再進行整合酶ΦC31蛋白介導DNA體外重組實驗(實施步驟見上述)，結果表明抗體在體外完全封閉了ΦC31活性，使其失去介導DNA重組反應的能力(見圖5-D)。
權利要求
1.一種ФC31整合酶多克隆抗體，其特征在于由純化的約68Kda的ФC31蛋白直接與佐劑相混合后注射免疫動物而制備獲得。
2.一種ФC31整合酶多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟如下用純化的約68Kda的ФC31蛋白直接與佐劑相混合，然后注射免疫動物，制得所需多克隆抗體。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述純化的約68Kda的ФC31蛋白的制備步驟如下鏈霉菌噬菌體ФC31的cDNA的質粒pCMVint為模板，用SpeI和XhoI酶切質粒pCMVint，回收1.8kb的DNA片斷，然后連接到經XbaI和SalI酶切回收原核表達載體pMAL-p2X上，連接液轉化大腸桿菌TOP10中，經測序鑒定正確后，將質粒p2X-ФC31轉化到TB1菌株中，進行大量誘導表達；對大量誘導表達的菌體經超聲破菌后，用Amylose親和柱純化出MBP-ФC31蛋白，用Micon Ultrafiltration-15濃縮純化的蛋白；對濃縮后純化的融合蛋白用Xa Factor進行蛋白酶切，在約68kDa處出現(xiàn)預期的條帶；對經Xa Factor蛋白酶切純化的MBP-ФC31蛋白后的產物，用過量的Amylose親和柱過柱，流出液即為純化的約68kDa的ФC31蛋白。
4.根據(jù)權利要求1所述的ФC31整合酶多克隆抗體用于特異性識別人胚胎胃細胞系293細胞經質粒轉染表達的ФC31整合酶蛋白，或者用于檢測標本中的ФC31蛋白的分布，或者用于封閉ФC31整合酶的體外活性。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術和基因治療技術領域，具體為一種ΦC31整合酶的多克隆抗體及其制備方法和應用。首先表達和純化ΦC31蛋白，然后由純化的ΦC31蛋白直接與佐劑相混合，注射免疫動物，如家兔、小鼠、大鼠等，即制得ΦC31多克隆抗體。該多克隆抗體可用于特異性的識別人類293細胞經質粒轉染表達的ΦC31整合酶的蛋白，也可用于檢測標本中的ΦC31蛋白的分布，或用于封閉ΦC31整合酶的體外活性。
文檔編號G01N33/53GK1827648SQ200510112199
公開日2006年9月6日 申請日期2005年12月29日 優(yōu)先權日2005年12月29日
發(fā)明者張茂祥, 陳金中, 朱煥章, 薛京倫, 賈韋國 申請人:復旦大學