一種hiv抑制劑篩選模型及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種HIV抑制劑篩選模型，該篩選模型由細胞模型I，細胞模型II，細胞模型III組成，其中，細胞模型I為重組質(zhì)粒gp120/pEGFP?N3與CD4/pDsRed?N1共轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞；細胞模型II為重組質(zhì)粒gp120/pDsRed?N1與CXCR4/pEGFP?N3共轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞；細胞模型III為重組質(zhì)粒CD4/pEGFP?N3與CXCR4/pDsRed?N1共轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞；所述的重組質(zhì)粒gp120/pDsRed?N1和gp120/pEGFP?N3中所插入的基因gp120的序列為SEQ ID NO.1所示；所述的重組質(zhì)粒CXCR4/pEGFP?N3和CXCR4/pDsRed?N1中所插入的基因CD4的序列為SEQ ID NO.2所示；所述的重組質(zhì)粒CXCR4/pEGFP?N3和CXCR4/pDsRed?N1中所插入的基因CXCR4的序列為SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明所述的篩選模型具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特征，可用于篩選抗HIV藥物。
【專利說明】
一種ΗIV抑制劑篩選模型及其制備方法和應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學，具體涉及引入外來基因修飾的細胞模型，該細胞模型所組 成的體系可大規(guī)模篩選抗艾滋病藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 艾滋?。╝cquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人類免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的重大傳染性疾病。近些年來，艾滋病在 全球范圍內(nèi)迅速蔓延，日益威脅全球公共健康、社會、經(jīng)濟和政治穩(wěn)定（Β 1 a c k RE.Lancet. 2013;382(9894) :751-753)。由于最有效的艾滋病疫苗還難以在短時期內(nèi)面世， 開發(fā)高效、安全和廉價的抗HIV藥物依然是挽救艾滋病人生命的關(guān)鍵舉措，也是當前艾滋病 防治的當務之急。
[0003] 迄今為止，已有26種抗HIV單體藥物和9個固定配伍復方藥物被美國FDA批準用于 臨床(Este J A，Cihlar T.Antiviral Res.2010;85(l) :25-33)，根據(jù)作用機理，可分為三 類。第一類是抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶活性的藥物，如齊多夫定（zidovudine，ZDV)、拉米夫定 (lamivudine，3TC)、地丹諾辛（didanosine，ddl)、扎西他賓（zalcitabine，ddC)等；第二類 是作用于修飾ΗIV蛋白質(zhì)的蛋白酶抑制劑，如沙奎那韋（s a q u i n a v i r，S Q V)、利托那韋 (ritonavir，RTV)、茚地那韋（indinavir，IDV)等;第三類是阻止病毒進入靶細胞的HIV進入 抑制劑，如恩夫韋肽(enfuvirtide，T20)和麥瑞韋若克(maraviroc，MVC)。由于前兩類藥物 易誘導HIV耐藥性突變，而且對人體有較大的毒副作用，導致越來越多的艾滋病患者無法持 續(xù)地接受抗HIV藥物的治療(Guendel I，et al.J Virol ·2014;88(2) :1189-1208)。理論上 認為，阻止病毒進入細胞的藥物相比針對病毒生活周期的酶類藥物更加有效，因為前者可 提供一種預防性措施，阻止病毒感染宿主細胞，防患于未然。所以，阻止HIV進入藥物被認為 是最富有潛力的HIV治療手段。開發(fā)新的阻止病毒進入靶細胞的第三類抗HIV藥物，已經(jīng)成 為目前艾滋病藥物研究的熱點，在艾滋病的防治上具有更好的應用前景。
[0004] HIV通過三個步驟進入宿主細胞：1)HIV顆粒通過其包膜糖蛋白gpl20與靶細胞表 面的受體分子⑶4黏附；2)gpl20發(fā)生構(gòu)象改變，以適應與靶細胞上的輔助受體CCR5或CXCR4 結(jié)合;3)HIV跨膜蛋白gp41介導病毒包膜與靶細胞膜發(fā)生融合。因此，抑制HIV進入過程中的 任何一個環(huán)節(jié)，就能達到抑制HIV感染和治療艾滋病的目的，這種類型的抗艾滋病藥物被稱 為HIV進入抑制劑（HIV entry inhibitors)(Micewicz ED，Ruchala P.Curr Pharm Des. 2013; 19( 10): 1784-1799) dIV進入抑制劑目前主要有三大類：1)作用于gpl20的黏附 抑制劑;2)作用于輔助受體的拮抗劑;3)靶向gp41的融合抑制劑。目前已被roA批準用于艾 滋病治療的HIV進入抑制劑有2種，分別是Roche和Trimeris公司開發(fā)的融合抑制劑恩夫韋 肽（enfuvirtide,T20)(Mirza RA，Turiansky GW.J Drugs Dermatol.2012;ll(10):e35-38)，Pf izer公司開發(fā)的CCR5詰抗劑麥瑞韋若克（maraviroc，MVC) (Cossar ini F，J Antimicrob Chemother.2012;67(10):2474-2478)〇
[0005] 現(xiàn)有的抗HIV藥物并不能徹底清除患者體內(nèi)的HIV，且長期使用帶來的副作用以及 耐藥性問題日漸突出。因此，開發(fā)新靶點的抗HIV藥物迫在眉睫，然而目前HIV進入抑制劑的 篩選通常以HIV病毒為對象進行篩選，這種篩選方法要在嚴格的三級生物安全實驗室中進 行，操作危險性大，并且作用靶點和機理不明，大大影響了篩選效率。因此，急需研究一種可 以大規(guī)模篩選的有效方法。近年發(fā)展起來的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)已被廣泛應用于 生物分子相互作用分析，而光柵型酶標儀等現(xiàn)代化儀器在FRET檢測中的應用大大提高了樣 品的檢測效率，從而使FRET成為藥物篩選領(lǐng)域里一項不可或缺的新技術(shù)。
[0006]輔助受體CXCR4是一種趨化因子受體，隨著艾滋病病情的發(fā)展，HIV將發(fā)生構(gòu)型改 變，使病毒能夠利用受體CCR5/CXCR4,因而研發(fā)輔助受體CXCR4拮抗劑是十分有必要的。理 想的CXCR4拮抗劑，不僅能阻止HIV的侵入，還不會影響CXCR4介導的下游信號通路調(diào)控。 CXCR4可作為HIV進入細胞的輔助受體，因而是目前研究最多的趨化因子受體之一，以CXCR4 為靶點的抑制劑有可能會成為新型抗HIV藥物。非肽類抑制劑屬于CXCR4抑制劑的重要組成 部分，尤其是雙環(huán)拉胺類化合物及其衍生物表現(xiàn)出了較高的抑制活性。AMD3100(Clercq E D ·Biochem Pharmacol · 2009; 77( 11): 1655-1664 ·)是小分子CXCR4抑制劑，可與CXCR4胞外 環(huán)的天冬氨酸殘基結(jié)合，帶正電荷。研究表明，AMD3100作用于HIV-1感染早期階段，特異性 地以CXCR4受體為靶點阻斷HIV-1進入細胞，不作用于CCR5受體，也不對gpl20蛋白發(fā)生作 用。由于AMD3100分子量較大，結(jié)構(gòu)中的陽離子不利于分子通過細胞膜，導致不易吸收，口服 活性低，所以有人用更小的雜環(huán)取代了 1個或2個環(huán)，改造其結(jié)構(gòu)，試圖改善并提高化合物的 口服藥物利用率。
[0007]焚光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer,FRET)是指在一 對合適的熒光物質(zhì)間，可通過偶極-偶極的相互作用構(gòu)成能量供體（donor)和能量受體 (acceptor)對，供體分子吸收一定頻率的光子后，其電子層被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，且在 電子回到基態(tài)的過程中，發(fā)射出光子能量(hu)，并傳遞至受體分子，后者接收能量后再發(fā)射 出光子hu'（hu>hu'）。在此過程中，供體熒光強度降低(猝滅），而受體熒光強度增強或發(fā)生 猝滅，同時伴隨著熒光壽命的相應縮短或延長的現(xiàn)象。簡單地說熒光共振能量轉(zhuǎn)移是距離 很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光 分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在lOnm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的 能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低得多（熒光猝滅），而受體 發(fā)射的熒光卻大大增強（焚光活化），這也是FRET的直觀表現(xiàn)。而由于FRET效率與供、受體分 子之間的距離存在高度依賴性，對供、受體分子間躍迀偶極相對取向的變化亦特別敏感，因 此該項技術(shù)起初被用于測定供、受體分子之間相互作用，并已在DNA雜交、蛋白構(gòu)象變化以 及蛋白質(zhì)-配體相互作用等生命科學的研究中得到廣泛應用。
[0008]要實現(xiàn)有效的FRET，供、受體的空間距離要足夠接近（1~10nm)，且供體的發(fā)射光 譜與受體的激發(fā)光譜要有一定程度的重疊。此外，選擇理想的供、受體分子也是實現(xiàn)FRET的 必要條件，可以選用小分子有機染料、熒光蛋白、化學發(fā)光物質(zhì)和熒光聚合物等作為供、受 體。一對理想的FRET供體-受體熒光對應該具備以下條件：1.供體的熒光量子產(chǎn)率(QD)要盡 量大;2.供體和受體之間光譜串擾(cross-talk)要盡量小;3.供體和受體的光譜重疊較大 (> 30 % ); 4.用于FRET檢測的熒光探針在目的細胞中具有較高的信噪比（S/B); 5 .能量供 體-受體對要有一定強度的光漂白性質(zhì)。CFP-YFP為目前研究蛋白相互作用中應用最廣泛的 FRET供-受體對，但CFP-YFP對也存在一定的不足:如熒光量子產(chǎn)率低、傳遞能量效率低、對 環(huán)境十分敏感，以及CFP不適合用激光作為激發(fā)光等等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種HIV抑制劑篩選模型，該篩選模型具有熒 光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特征，可以實現(xiàn)在沒有HIV病毒參與的情況下，在活細胞中全面、高 效、快速、有針對性篩選以gp 120、CXCR4、⑶4為靶點的抗HI V藥物。
[0010] 本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是：
[0011] -種HIV抑制劑篩選模型，該篩選模型由細胞模型I，細胞模型II，細胞模型III組 成，其中，
[0012] 細胞模型I為重組質(zhì)粒gpl20/pEGFP-N3與CD4/pDsRed-Nl共轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞； [0013] 細胞模型II為重組質(zhì)粒gpl20/pDsRed-Nl與CXCR4/pEGFP-N3共轉(zhuǎn)染的HEK293T細 胞；
[0014] 細胞模型III為重組質(zhì)粒CD4/pEGFP-N3與CXCR4/pDsRed-Nl共轉(zhuǎn)染的HEK293T細 胞；
[0015] 所述的重組質(zhì)粒gpl20/pDsRed-Nl和gpl20/pEGFP-N3是在熒光表達載體pDsRed-N1與pEGFP-N3中分別插入HIV包膜糖蛋白gp 120的編碼基因構(gòu)成的，其中所述的gp 120的堿 基序列為SEQ ID N0.1所不；
[0016] 所述的重組質(zhì)粒CD4/PEGFP-N3和CD4/pDsRed-Nl是在熒光表達載體PEGFP-N3與 pDsRed-Nl中分別插入受體分子⑶4的編碼基因構(gòu)成的，其中所述的⑶4的堿基序列為SEQ ID N0.2所示；
[0017] 所述的重組質(zhì)粒CXCR4/pEGFP-N3和CXCR4/pDsRed-Nl是在熒光表達載體pEGFP-N3 與pDsRed-Nl中分別插入輔助受體分子CXCR4的編碼基因構(gòu)成的，其中所述的CXCR4的堿基 序列為SEQ ID N0.3所示。
[0018] 上述方案中所述的堿基序列為SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 3由上海英濰捷基廣州 分公司根據(jù)本發(fā)明人所提供的序列合成。
[0019] 本發(fā)明所述的一種HIV抑制劑篩選模型的作用機理是：在細胞模型I~細胞模型 III中表達gpl20、⑶4、CXCR4中任意兩種蛋白，這兩種蛋白分別與一種綠色熒光蛋白和一種 紅色熒光蛋白嵌合在一起，各自在細胞中形成gp 120-CD4、gp 120-CXCR4、CD4-CXCR4二聚體， 則綠色熒光減弱，紅色熒光增強，即發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。本發(fā)明所述的HIV抑制 劑篩選模型篩選出的藥物可以影響gp 120-CD4、gp 120-CXCR4、CD4-CXCR4二聚體的形成，導 致熒光共振能量轉(zhuǎn)移減弱，即說明該藥物能夠抑制gpl20-CD4、gpl20-CXCR4、CD4-CXCR4二 聚體的形成，從而降低FRET效率，是一種有效的HIV進入抑制劑。
[0020] 上述HIV抑制劑篩選模型的制備方法包括以下步驟：
[0021] (1)將gp 120、CD4、CXCR4的編碼基因分別插入熒光表達載體pEGFP-N3和pDsRed-N1，構(gòu)建出 6 個重組質(zhì)粒 gpl20/pDsRed-Nl、gpl20/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-Nl、CXCR4/ PEGFP-N3、CD4/pDsRed-Nl和CD4/pEGFP-N3;
[0022] (2)以重組質(zhì)粒gpl20/pEGFP-N3與CD4/pDsRed-Nl共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，得到細胞 模型I;以重組質(zhì)粒gp 120/pDsRed-Nl與CXCR4/pEGFP-N3共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，得到細胞模型 II;以重組質(zhì)粒CD4/pEGFP-N3與CXCR4/pDsRed-Nl共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，得到細胞模型III。
[0023] 本發(fā)明所述HIV抑制劑篩選模型具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移特征，可用于篩選HIV抑制 劑，本發(fā)明人推薦的篩選方法由以下步驟組成：
[0024] (1)用所述的重組質(zhì)粒 gpl20/pDsRed-Nl、gpl20/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-Nl、 CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-Nl 和 CD4/pEGFP-N3 分別轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞，制得 6 個細胞;然 后將6個細胞分別接種在帶有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，放在37°C和充入體積濃度為5% C02氣體的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，再用PBS洗滌三次，用體積濃度為4 %多聚甲醛溶液固定 細胞15-20min，然后將載有細胞的蓋玻片固定于載玻片上，用封面劑封片，得到6個陰性對 照細胞；
[0025] (2)將所述的篩選模型接種在帶有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，放在37°C和充入 體積濃度為5 % C〇2氣體的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46h;接著，將培養(yǎng)后篩選模型分別分成兩份， 往其中一份加入待篩選藥物作用2h;然后，將兩份培養(yǎng)后篩選模型分別用PBS洗滌三次，用 體積濃度為4 %多聚甲醛溶液固定細胞15-20min，然后將載有細胞的蓋玻片固定于載玻片 上，用封面劑封片，得到加藥細胞與空白對照細胞(分別為細胞模型I的加藥細胞與空白對 照細胞、細胞模型Π 的加藥細胞與空白對照細胞和細胞模型III的加藥細胞與空白對照細 胞)；
[0026] (3)將所得到的陰性對照細胞、空白對照細胞和加藥細胞分別置于激光共聚焦顯 微鏡下采用敏化發(fā)射法進行FRET檢測，將所得到的檢測數(shù)據(jù)用FV10-ASW2.1View er軟件計 算出蛋白間的FRET效率E;能使蛋白間FRET效率E降低的藥物即為目標篩選物，否則為非目 標篩選物。
[0027] 上述制備方法中，所述的敏化發(fā)射法檢測的操作步驟為：以每種重組質(zhì)粒表達的 EGFP為供體，以每種重組質(zhì)粒表達的DsRED為受體，首先拍攝僅表達供體的對照細胞和僅表 達受體的對照細胞，設(shè)置共聚焦顯微鏡的供體、受體熒光的掃描參數(shù)，即選擇DsRED通道激 發(fā)光波長488nm，HV為500v，EGFP通道激發(fā)光波長559nm，HV為400v，用調(diào)整好的參數(shù)拍攝供 受體共表達的細胞模型;每個細胞模型分別拍攝如下的7張照片：（1 )488nm激發(fā)僅表達供體 的對照細胞在供體通道成像；（2)488nm激發(fā)僅表達供體的對照細胞在受體通道成像；（3) 488nm激發(fā)僅表達受體的對照細胞在受體通道成像；（4)559nm激發(fā)僅表達受體的對照細胞 在受體通道成像；（5)488nm激發(fā)供受體共表達的細胞在供體通道成像；（6)488nm激發(fā)供受 體共表達的細胞在受體通道成像；（7) 559nm激發(fā)供受體共表達的細胞在受體通道成像。再 將所得照片輸入FV10-ASW2. lViewer軟件，計算出供受體間的FRET效率(8)及供受體間的距 離(9)〇
[0028]由于本發(fā)明所述的HIV抑制劑篩選模型能篩選出影響形成gpl20-CD4、gpl20-CXCR4、⑶4-CXCR4二聚體的可抑制HIV感染細胞的藥物，因此本發(fā)明所述的HIV抑制劑篩選 模型可實現(xiàn)在沒有HIV病毒參與的情況下，在活細胞中全面、高效、快速、有針對性篩選以 gpl20、CXCR4、CD4為靶點的抗HIV藥物。本發(fā)明還具有篩選信號強，靈敏度高，作用機理明確 的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0029]圖1為構(gòu)建HIV抑制劑篩選模型所用的質(zhì)粒的圖譜，其中，A為pEGFP-N3的圖譜，B為 pDsRed-Nl 的圖譜。
[0030]圖2為敏化發(fā)射法檢測gpl20、CD4和CXCR4蛋白之間的相互作用的顯微照片（X 20 倍），其中，A為檢測空載體pEGFP-N3與pDsRed-Nl共轉(zhuǎn)染的陰性對照細胞，B為檢測細胞模型 I，C為檢測細胞模型II;D為檢測細胞模型III;上述A~D圖中，A1-D1為488nm激發(fā)僅表達供 體的對照細胞在供體通道成像;A2-D2為488nm激發(fā)僅表達供體的對照細胞在受體通道成 像;A3-D3為488nm激發(fā)僅表達受體的對照細胞在受體通道成像;A4-D4為559nm激發(fā)僅表達 受體的對照細胞在受體通道成像;A5-D5為488nm激發(fā)供受體共表達的細胞在供體通道成 像;A6-D6為488nm激發(fā)供受體共表達的細胞在受體通道成像;A7-D7為559nm激發(fā)供受體共 表達的細胞在受體通道成像;A8-D8為供受體間的FRET效率，A9-D9為供受體間的距離。 [0031]圖3為AMD3100處理后敏化發(fā)射法檢測gpl20、⑶4和CXCR4蛋白之間的相互作用的 顯微照片（X 20倍），其中，A為檢測細胞模型I，B為檢測細胞模型II;C為檢測細胞模型III; 上述A~C圖中，A1-C1為488nm激發(fā)僅表達供體的對照細胞在供體通道成像;A2-C2為488nm 激發(fā)僅表達供體的對照細胞在受體通道成像;A3-C3為488nm激發(fā)僅表達受體的對照細胞在 受體通道成像;A4-C4為559nm激發(fā)僅表達受體的對照細胞在受體通道成像;A5-C5為488nm 激發(fā)供受體共表達的細胞在供體通道成像;A6-C6為488nm激發(fā)供受體共表達的細胞在受體 通道成像;A7-C7為559nm激發(fā)供受體共表達的細胞在受體通道成像;A8-C8為供受體間的 FRET效率，A9-C9為供受體間的距離。
[0032] 圖4為anti-human CD4IgG處理后敏化發(fā)射法檢測gpl20、CD4和CXCR4蛋白之間的 相互作用的顯微照片（X 20倍），其中，A為檢測細胞模型I，B為檢測細胞模型II ;C為檢測細 胞模型III;上述A~C圖中，A1-C1為488nm激發(fā)僅表達供體的對照細胞在供體通道成像;A2-C2為488nm激發(fā)僅表達供體的對照細胞在受體通道成像;A3-C3為488nm激發(fā)僅表達受體的 對照細胞在受體通道成像;A4-C4為559nm激發(fā)僅表達受體的對照細胞在受體通道成像;A5-C5為488nm激發(fā)供受體共表達的細胞在供體通道成像;A6-C6為488nm激發(fā)供受體共表達的 細胞在受體通道成像;A7-C7為559nm激發(fā)供受體共表達的細胞在受體通道成像;A8-C8為供 受體間的FRET效率，A9-C9為供受體間的距離。
【具體實施方式】
[0033] 制備例
[0034] -、材料和儀器：
[0035] 1、堿基序列為SEQ ID NO. 1~SEQ ID N0.3由上海英濰捷基廣州分公司合成
[0036] 2、質(zhì)粒 pEGFP-N3:購自美國 Clonetech 公司
[0037] 3、質(zhì)粒pDsRed-Nl:購自美國Clonetech公司
[0038] 4、工具酶 Xhol、EcoI、PstI、KpnI 均購自 Takara 公司
[0039] 5、激光共聚焦顯微鏡(Olympus FVlOOOOlympus Corp 日本）
[0040] 二、方法：
[0041 ] 三、構(gòu)建gp 120、CD4、CXCR4的熒光表達載體：
[0042]選取如圖1所示的表達綠色熒光蛋白的質(zhì)粒PEGFP-N3和表達紅色熒光蛋白的質(zhì)粒 pDsRed-Nl作為gpl20、CD4、CXCR4的熒光表達載體，再按下表1所示的酶切位點，分別對CD4、 CXCR4、gpl20的編碼基因及所述的表達載體進行相應的限制性酶切，以形成互補的粘性末 端;所述的酶切位點的選擇要保證插入基因與載體上的熒光蛋白基因之間有約15個氨基酸 的間隔距離。然后，在連接酶作用下進行連接，得到6個重組質(zhì)粒gpl20/pDSRed-Nl、gpl20/ PEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-Nl、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-Nl、CD4/pEGFP-N3，再將所得到 的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中進行質(zhì)粒擴增。
[0043]表 1 「00441
[0045] 四、構(gòu)建HIV抑制劑篩選模型：
[0046] 1、HEK293T細胞的培養(yǎng)
[0047]先將蓋破片經(jīng)多聚賴氨酸處理后再放入24孔細胞培養(yǎng)板中，然后按0.5-2 X105 個/孔將HEK293T細胞接種于培養(yǎng)板內(nèi)，再按每孔lmL加入無抗生素的1640完全細胞培養(yǎng)基， 置于37°C，充入體積濃度為5 %C02氣體的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁融合率達到50 %~ 60% 〇
[0048] 2、構(gòu)建細胞模型
[0049] 重組質(zhì)粒 gpl20/pEGFP-N3 與 CD4/pDsRed-Nl、gpl20/pDsRed-Nl 與 CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pEGFP-N3與CXCR4/pDsRed-Nl兩兩一組用脂質(zhì)體Lipofectamime 3000分別共同轉(zhuǎn) 染步驟1培養(yǎng)的HEK293T細胞，得到細胞模型I、細胞模型II和細胞模型III。
[0050] 五、結(jié)果驗證：
[0051 ]將所制備的細胞模型I~細胞模型III培養(yǎng)48h后，用PBS洗滌三次，再用體積濃度 為4%的多聚甲醛溶液固定，然后將載有細胞模型的蓋玻片固定于載玻片上，用封面劑封 片，通過共聚焦顯微鏡，用敏化發(fā)射法進行FRET檢測；每個實驗組采集7張圖像，并在 Sensitized Emission界面下分析計算，結(jié)果如圖2所示。與陰性對照細胞中EGFP和DsRed相 比較（見圖2A)，細胞模型I中g(shù)pl20-EGFP和CD4-DsRed之間（見圖2B)，細胞模型II中g(shù)pl20-DsRed和CXCR4-EGFP之間（見圖2C)，細胞模型III中CD4-EGFP和CXCR4-DsRed之間（見圖2D) 的FRET效率分別是0.652、0.669、0.565，蛋白距離均小于1011111。該結(jié)果證實三種蛋白8?120、 CD4、CXCR4兩兩之間存在相互作用，有FRET現(xiàn)象發(fā)生，即本發(fā)明所述的HIV抑制劑篩選模型 已成功建立。
[0052] 篩選例
[0053] 例 1
[0054] 1、待篩選藥物
[0055] 中文名稱:AMD3100,購于Sigma公司。
[0056] 化學名稱：1，Γ-[1，4-亞苯基雙(亞甲基）]雙[1，4,8，11_四氮雜環(huán)十四烷]
[0057]特征:AMD3100其分子量較大，結(jié)構(gòu)中的陽離子不利于分子通過細胞膜，導致不易 吸收，口服活性低，且可引起心律異常等毒副作用。
[0058]作用機制:AMD3100是小分子CXCR4抑制劑，作用于HIV-1感染的早期階段，特異性 地阻斷以CXCR4為輔助受體的HIV-1進入細胞，不作用于CCR5受體，也不對gpl20蛋白發(fā)生作 用。
[0059] 2、篩選方法
[0060] (1)用制備例中所得到的6 個重組質(zhì)粒 gp 120/pDsRed-Nl、gp 120/pEGFP-N3、CXCR4/ pDsRed-Nl、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-Nl 和 CD4/pEGFP-N3 分別轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞，制得 6 個細胞;然后將6個細胞分別接種在帶有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，放在37°C和充入體積 濃度為5 % C02氣體的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，再用PBS洗滌三次，用體積濃度為4 %多聚甲醛 溶液固定細胞15_20min，然后將載有細胞的蓋玻片固定于載玻片上，用封面劑封片，得到6 個陰性對照細胞；
[0061 ] (2)將制備例中所得到的篩選模型（即細胞模型I、細胞模型II和細胞模型III)接 種在帶有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，放在37°C和充入體積濃度為5%C02氣體的細胞培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)46h;接著，將培養(yǎng)后的篩選模型分別分成兩份，往其中一份加入ΙμΜ AMD3100作用 2h;然后，將兩份培養(yǎng)后的篩選模型分別用PBS洗滌三次，用體積濃度為4%多聚甲醛溶液固 定細胞15-20min，然后將載有細胞的蓋玻片固定于載玻片上，用封面劑封片，得到加藥細胞 與空白對照細胞（即細胞模型I的加藥細胞與空白對照細胞、細胞模型II的加藥細胞與空白 對照細胞和細胞模型III的加藥細胞與空白對照細胞）；
[0062] (3)將所得到的陰性對照細胞、空白對照細胞和加藥細胞分別置于激光共聚焦顯 微鏡下采用敏化發(fā)射法進行FRET檢測，將所得到的檢測數(shù)據(jù)用FV10-ASW2.1View er軟件計 算出蛋白間的FRET效率E;實驗結(jié)果如圖3所示：從圖中可以看出，相對于空白對照組(見圖 2B、C、D)，加藥組細胞模型II中g(shù)pl20-DsRed與CXCR4-EGFP之間（見圖3B)，細胞模型III中 CD4-EGFP與CXCR4-DsRed之間（見圖3C)的FRET效率明顯降低，而細胞模型I中g(shù)p 120-EGFP與 CD4-DsRed之間（見圖3A)的FRET效率變化不大，可見AMD3100是一種有效的以CXCR4為靶點 的HIV抑制劑。
[0063] 例 2
[0064] 1、待篩選藥物
[0065] 名稱：anti-human CD4IgG，購于Biolegend公司。
[0066] 特征:大分子蛋白，口服利用率低。
[0067]作用機制:⑶4特異性中和抗體，通過特異性與⑶4結(jié)合，抑制HIV進入細胞。
[0068] 2、篩選方法
[0069] (1)用制備例中所得到的6 個重組質(zhì)粒 gp 120/pDsRed-Nl、gp 120/pEGFP-N3、CXCR4/ pDsRed-Nl、CXCR4/pEGFP-N3、CD4/pDsRed-Nl 和 CD4/pEGFP-N3 分別轉(zhuǎn)染 HEK293T 細胞，制得 6 個細胞;然后將6個細胞分別接種在帶有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，放在37°C和充入體積 濃度為5 % C02氣體的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，再用PBS洗滌三次，用體積濃度為4 %多聚甲醛 溶液固定細胞15_20min，然后將載有細胞的蓋玻片固定于載玻片上，用封面劑封片，得到6 個陰性對照細胞；
[0070] (2)將制備例中所得到的篩選模型（即細胞模型I、細胞模型II和細胞模型III)接 種在帶有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，放在37°C和充入體積濃度為5%C02氣體的細胞培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)46h;接著，將培養(yǎng)后的篩選模型分別分成兩份，往其中一份加入ΙμΜ anti-human ⑶4IgG作用2h;然后，將兩份培養(yǎng)后的篩選模型分別用PBS洗滌三次，用體積濃度為4%多聚 甲醛溶液固定細胞15-20min，然后將載有細胞的蓋玻片固定于載玻片上，用封面劑封片，得 到加藥細胞與空白對照細胞（即細胞模型I的加藥細胞與空白對照細胞、細胞模型II的加藥 細胞與空白對照細胞和細胞模型III的加藥細胞與空白對照細胞）；
[0071] (3)將所得到的陰性對照細胞、空白對照細胞和加藥細胞分別置于激光共聚焦顯 微鏡下采用敏化發(fā)射法進行FRET檢測，將所得到的檢測數(shù)據(jù)用FV10-ASW2.1Viewer軟件計 算出蛋白間的FRET效率E;實驗結(jié)果如圖4所示：從圖中可以看出，相對于空白對照組(見圖 2B、C、D)，加藥組細胞模型I中g(shù)p 120-EGFP與CD4-DsRed之間（見圖4A)，細胞模型III中CD4-EGFP與CXCR4-DsRed之間（見圖4C)的FRET效率明顯降低，而細胞模型II中g(shù)pl20-DsRed與 CXCR4-EGFP之間（見圖4B)的FRET效率變化不大，可見anti-human CD4IgG是一種有效的以 ⑶4為靶點的HIV抑制劑。
【主權(quán)項】
1. 一種HIV抑制劑篩選模型，該篩選模型由細胞模型I，細胞模型II，細胞模型III組成， 其中， 細胞模型I為重組質(zhì)粒gpl20/pEGFP-N3與CDVpDsRed-Nl共轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞； 細胞模型Π 為重組質(zhì)粒gpl20/pDsRed-Nl與CXCR4/pEGFP-N3共轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞； 細胞模型ΠΙ為重組質(zhì)粒CD4/pEGFP-N3與CXCRVpDsRed-Nl共轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞； 所述的重組質(zhì)粒gpl20/pDsRed-Nl和gpl20/pEGFP-N3是在熒光表達載體pDsRed-Nl與 PEGFP-N3中分別插入HIV包膜糖蛋白gp 120的編碼基因構(gòu)成的，其中所述的gp 120的堿基序 列為SEQ ID NO. 1所示； 所述的重組質(zhì)粒CD4/pEGFP-N3和CD4/pDsRed-Nl是在熒光表達載體pEGFP-N3與 pDsRed-Nl中分別插入受體分子⑶4的編碼基因構(gòu)成的，其中所述的⑶4的堿基序列為SEQ ID NO .2所示； 所述的重組質(zhì)粒CXCR4/pEGFP-N3和CXCRVpDsRed-Nl是在熒光表達載體pEGFP-N3與 pDsRed-Nl中分別插入輔助受體分子CXCR4的編碼基因構(gòu)成的，其中所述的CXCR4的堿基序 列為SEQ ID NO.3所示。2. 權(quán)利要求1所述的一種HIV抑制劑篩選模型的制備方法，該方法包括以下步驟： (1) 將gp 120、CD4、CXCR4的編碼基因分別插入熒光表達載體pEGFP-N3和pDsRed-Nl，構(gòu) 建出 6個重組質(zhì)粒gp 120/pDsRed-Nl、gp 120/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-Nl、CXCR4/pEGFP-N3、 CD4/pDsRed-Nl和CD4/pEGFP-N3; (2) 以重組質(zhì)粒gpl20/pEGFP-N3與CD4/pDsRed-Nl共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，得到細胞模型 I;以重組質(zhì)粒gpl20/pDsRed-Nl與CXCR4/pEGFP-N3共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，得到細胞模型II; 以重組質(zhì)粒CD4/pEGFP-N3與CXCRVpDsRed-Nl共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，得到細胞模型III。3. 權(quán)利要求1所述的一種HIV抑制劑篩選模型用于篩選HIV抑制劑的方法，該方法由以 下步驟組成： (1) 用所述的重組質(zhì)粒 gpl20/pDsRed-Nl、gpl20/pEGFP-N3、CXCR4/pDsRed-Nl、CXCR4/ PEGFP-N3、CD4/pDsRed-Nl和CD4/pEGFP-N3分別轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，制得6個細胞;然后將6個 細胞分別接種在帶有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，放在37°C和充入體積濃度為5%C0 2氣體 的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，再用PBS洗滌三次，用體積濃度為4%多聚甲醛溶液固定細胞15-20min，然后將載有細胞的蓋玻片固定于載玻片上，用封面劑封片，得到6個陰性對照細胞； (2) 將所述的篩選模型接種在帶有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中，放在37°C和充入體積 濃度為5 % C〇2氣體的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)46h;接著，將培養(yǎng)后篩選模型分別分成兩份，往其 中一份加入待篩選藥物作用2h;然后，將兩份培養(yǎng)后篩選模型分別用PBS洗滌三次，用體積 濃度為4 %多聚甲醛溶液固定細胞15-20min，然后將載有細胞的蓋玻片固定于載玻片上，用 封面劑封片，得到加藥細胞與空白對照細胞； (3) 將所得到的陰性對照細胞、空白對照細胞和加藥細胞分別置于激光共聚焦顯微鏡 下采用敏化發(fā)射法進行FRET檢測，將所得到的檢測數(shù)據(jù)用FV10-ASW2. IViewer軟件計算出 蛋白間的FRET效率E;能使蛋白間FRET效率E降低的藥物即為目標篩選物，否則為非目標篩 選物。
【文檔編號】C12Q1/02GK105907720SQ201610311179
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】馬偉峰, 李百華, 段司沁, 范遙, 趙雪, 李雨靜
【申請人】南方醫(yī)科大學