一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，開創(chuàng)性的采用了活檢針采取處理后的組織，使得采樣直接針對目的細(xì)胞，不但直接有效，同時(shí)巧妙地避免了表面包膜細(xì)胞以及細(xì)菌的混入，降低了細(xì)胞、細(xì)菌污染的同時(shí)，大大提高了目的細(xì)胞的純度。同時(shí)，本發(fā)明的原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，使用特殊制備的復(fù)合酶消化液，相比傳統(tǒng)單一的膠原酶預(yù)熱消化，不但避免了對組織過度消化過度吹打所導(dǎo)致的細(xì)胞活性低、得率差的問題，而且消化的更均勻透徹。采用預(yù)貼壁以及原代培養(yǎng)早期加入Laminin的方式，可以極大地促進(jìn)神經(jīng)元的貼壁、神經(jīng)突觸的生長以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成，從而進(jìn)一步提高神經(jīng)元的得率及長期存活率。
【專利說明】
一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元的分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離 培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)由兩大類細(xì)胞構(gòu)成，即：神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)元是大腦的結(jié) 構(gòu)、功能和營養(yǎng)單位。盡管神經(jīng)元的大小和形狀存在很大差異，但是所有神經(jīng)元都擁有共同 的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，即：構(gòu)成了極為復(fù)雜的互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。作為神經(jīng)系統(tǒng)主要的信號單位，神經(jīng)元屬 于一種動(dòng)態(tài)去極化細(xì)胞。人腦擁有1X10 11個(gè)神經(jīng)元，每個(gè)神經(jīng)元可以至少聯(lián)系其它10000個(gè) 神經(jīng)元。
[0003] 目前，國內(nèi)外已經(jīng)有大量的研究者進(jìn)行了小鼠/大鼠神經(jīng)元的培養(yǎng)和藥理學(xué)特性 方面的研究，既往的研究多采用胰酶消化法培養(yǎng)。其缺點(diǎn)在于，胰酶對神經(jīng)元的傷害極大， 很難控制消化時(shí)間和吹打的力度，容易導(dǎo)致的結(jié)果往往是，細(xì)胞活力差，死細(xì)胞特別多，貝占 壁細(xì)胞少，且混雜的膠質(zhì)細(xì)胞比較多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種高純度、高活率、高活性同時(shí)低 污染的原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
[0006] -種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0007] 步驟1:小鼠或大鼠大腦組織的獲取和預(yù)處理
[0008] 將小鼠或者大鼠斷頭獲取大腦組織，將離體的大腦組織用PBS溶液洗滌后，放置在 冰上待用；
[0009] 步驟2:取神經(jīng)元細(xì)胞
[0010] 使用活檢針刺入步驟1處理后的大腦組織，切取神經(jīng)元細(xì)胞；
[0011] 步驟3:酶消化
[0012] 將步驟2獲得的神經(jīng)元細(xì)胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括 質(zhì)量比為1:1:1:1的I型膠原酶、Π 型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶；
[0013] 步驟4:分離培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞
[0014]將步驟3消化完畢的骨骼肌細(xì)胞過70um篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次 離心，最后再次用預(yù)貼壁培養(yǎng)基重懸，然后預(yù)貼壁4h后更換至神經(jīng)元培養(yǎng)基，細(xì)胞放置于37 °C，5 % C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0015] 優(yōu)選地，上述步驟2中使用的活檢針為半自動(dòng)或全自動(dòng)活檢針。
[0016] 優(yōu)選地，上述步驟3中復(fù)合酶消化液中各個(gè)酶的濃度均為lmg/ml。
[0017] 優(yōu)選地，上述步驟3中酶消化過程為使用4°C復(fù)合酶消化液消化4-20h或者37°C復(fù) 合酶消化液消化1 〇m i n-2h。
[0018] 優(yōu)選地，上述步驟4中預(yù)貼壁培養(yǎng)基為含Laminin和10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0019] 優(yōu)選地，上述步驟4中預(yù)貼壁培養(yǎng)基中Laminin濃度為lug/ml。
[0020] 優(yōu)選地，上述步驟4中神經(jīng)元培養(yǎng)基為含B27、L_谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基。
[0021] 優(yōu)選地，上述步驟4中離心條件為400g，離心5分鐘。
[0022] 本發(fā)明另一方面還提供根據(jù)上述的原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法 所培養(yǎng)的小鼠和大鼠神經(jīng)元細(xì)胞。
[0023] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0024] (1)本發(fā)明開創(chuàng)性的采用了活檢針采取處理后的組織，使得采樣直接針對目的細(xì) 胞，不但直接有效，同時(shí)巧妙地避免了表面包膜細(xì)胞以及細(xì)菌的混入，降低了細(xì)胞、細(xì)菌污 染的同時(shí)，大大提高了目的細(xì)胞的純度，分離細(xì)胞時(shí)即可接近100% ;
[0025] (2)本發(fā)明的原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，采用復(fù)合酶消化法獲 得了單個(gè)的神經(jīng)元，避免了以往用胰酶消化法對組織過度消化，過度吹打所導(dǎo)致的細(xì)胞活 性低、得率差的問題，尤其是針對神經(jīng)元這種對缺血缺氧比較敏感的組織細(xì)胞。并使用4°C 條件過夜消化(4_20h)，相比傳統(tǒng)單一的膠原酶預(yù)熱消化，不但避免了對組織過度消化過度 吹打所導(dǎo)致的細(xì)胞活性低、得率差的問題，而且消化的更均勻透徹；
[0026] (3)采用預(yù)貼壁以及原代培養(yǎng)早期加入lug/ml Laminin的方式，可以極大地促進(jìn) 神經(jīng)元的貼壁、神經(jīng)突觸的生長以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成，從而進(jìn)一步提高神經(jīng)元的得率及長 期存活率；
[0027] (4)制備方法簡便，技術(shù)穩(wěn)定，重復(fù)性好。
[0028] 綜上所述，本發(fā)明的原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，能夠獲得高純 度、高活率、高活性同時(shí)污染風(fēng)險(xiǎn)極低的原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞活力高， 具有較大的推廣意義。
【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法得到的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞拍攝的顯微照片（10X);
[0030]圖2為本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法得到的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞拍攝的顯微照片(20X);
【具體實(shí)施方式】
[0031 ]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0032] 實(shí)施例1
[0033]本發(fā)明實(shí)施例1提供了一種原代大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，具體步驟如下： [0034] 1.大鼠大腦組織的獲取
[0035]首先處死新生（出生48小時(shí)以內(nèi)）大鼠（冰凍10分鐘或者頸椎脫臼），酒精浸泡5分 鐘，超凈臺(tái)內(nèi)，斷頭取腦。全程都要在冰上進(jìn)行。將取下的大腦組織置于盛有預(yù)冷PBS的培養(yǎng) 皿內(nèi)，洗滌3次，棄除表面殘余血跡，迅速置于含2%青鏈霉素的預(yù)冷L-15培養(yǎng)基內(nèi)，放在冰 上保存，待所有組織取材完畢，統(tǒng)一進(jìn)行處理。
[0036] 2.取神經(jīng)元細(xì)胞
[0037] 使用活檢針刺入步驟1處理后的大腦組織，切取神經(jīng)元細(xì)胞。
[0038] 3.酶消化
[0039] 將處理后變白的大腦皮質(zhì)剪碎，加入自制的復(fù)合酶(I型膠原酶+11型膠原酶+IV型 膠原酶+Dispase酶=1:1:1:1)，4種酶的初始濃度均為lmg/ml。37度消化30分鐘，稍微吹打 幾次，根據(jù)情況，再次37度消化30分鐘，然后輕微吹打不超過5次，過70um篩網(wǎng)。
[0040] 4.分離培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞
[0041]將步驟3消化完畢的骨骼肌細(xì)胞過70um篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次 離心，由于神經(jīng)元培養(yǎng)的特殊性，分離獲得的單個(gè)神經(jīng)元懸液需要經(jīng)過一個(gè)預(yù)貼壁的過程。 艮P :在含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，預(yù)貼壁4個(gè)小時(shí)。4個(gè)小時(shí)后，更換至神經(jīng)元培養(yǎng)基， 艮P :含B27 (1:50)、L-谷氨酰胺(0.5um/ml)的Neurobasal培養(yǎng)基。細(xì)胞放置于37 °C，5 % C02的 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0042] 5.二維培養(yǎng)
[0043]將純化的大鼠神經(jīng)元，先用預(yù)貼壁培養(yǎng)基重懸，接種在明膠預(yù)處理過夜的T25培養(yǎng) 瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為5 X105/瓶。為了促進(jìn)神經(jīng)元更好的貼壁，加入lug/ml的 Laminin。置于37度，5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。4個(gè)小時(shí)后，棄預(yù)貼壁培養(yǎng)基，更換為神經(jīng) 元培養(yǎng)基，同時(shí)加入lug/ml的Laminin。置于37度，5 %⑶2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以后每3天 更換新的神經(jīng)元培養(yǎng)基，每天于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，根據(jù)情況，可加入終濃度為 10umol/L的阿糖胞苷，抑制膠質(zhì)細(xì)胞等非神經(jīng)元的生長。
[0044] 6.細(xì)胞形態(tài)觀察
[0045] 顯微鏡下觀察原代分離培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，如圖1-2所示。
[0046] 7.其他相關(guān)指標(biāo)測定
[0047] 培養(yǎng)期間測定細(xì)菌及真菌污染情況、細(xì)胞污染情況、統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活率等。
[0048] 在本發(fā)明的大鼠神經(jīng)元培養(yǎng)方法中，所用大腦組織、復(fù)合酶、細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞因 子和胎牛血清等，均應(yīng)符合無菌要求。
[0049] 對比實(shí)施例
[0050] 對比實(shí)施例采用傳統(tǒng)的方法，大鼠大腦組織的獲取后，在解剖顯微鏡下，用無菌鑷 子仔細(xì)剝離大腦皮層，全程都要在冰上進(jìn)行。并且，在預(yù)冷的PBS里，仔細(xì)剝除軟腦膜和血 絲，盡量完整剝離，以免軟膜腦殘留，導(dǎo)致大量的成纖維細(xì)胞增生。剝離干凈后，用預(yù)冷的 PBS洗滌2-3遍。大腦皮層處理成功的標(biāo)志為，腦組織變成白色，外表面沒有任何的血絲殘 留。然后將處理后變白的大腦皮質(zhì)剪碎，加入酶溶液，37度消化30分鐘，稍微吹打幾次，根據(jù) 情況，再次37度消化30分鐘，然后輕微吹打不超過5次，過70um篩網(wǎng)。取過篩后的細(xì)胞濾液， 根據(jù)體積加入對等的PBS，400g離心5分鐘，即可獲得純化的小鼠或大鼠神經(jīng)元，然后用 0.2%臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入到T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為5 X 1〇5/瓶，置于37度，5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并觀察和測定相關(guān)指標(biāo)。
[0051] 上述的實(shí)施例和對比例實(shí)驗(yàn)，
【申請人】進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的比較 和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。如表1所示：
[0052] 表 1
[0053]
[0054] 同時(shí)
【申請人】使用小鼠進(jìn)行了若干次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同大鼠相同，證明本發(fā)明的方 法對大鼠和小鼠的神經(jīng)元分離培養(yǎng)的良好效果真實(shí)有效。
[0055] 綜上所述，本發(fā)明的原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，采用特制的復(fù) 合酶進(jìn)行長期消化，使得獲得細(xì)胞總量大，分離度高，活率高；由于采集方式的不同，本發(fā)明 的方法獲得的神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)菌、真菌和其他細(xì)胞的污染概率極低，同時(shí)還能夠進(jìn)行傳代培 養(yǎng)，為以神經(jīng)元培養(yǎng)為基礎(chǔ)的相關(guān)研究提供了良好的細(xì)胞培養(yǎng)解決方案。
[0056] 以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1:小鼠或大鼠大腦組織的預(yù)處理 將小鼠或者大鼠離體的大腦組織用PBS溶液洗滌后，放置在冰上待用； 步驟2:取神經(jīng)元細(xì)胞 使用活檢針刺入步驟1處理后的大腦組織，切取神經(jīng)元細(xì)胞； 步驟3:酶消化 將步驟2獲得的神經(jīng)元細(xì)胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括質(zhì)量 比為1: 1: 1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶； 步驟4:分離培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞 將步驟3消化完畢的骨骼肌細(xì)胞過70um篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次離 心，最后再次用預(yù)貼壁培養(yǎng)基重懸，然后預(yù)貼壁4h后更換至神經(jīng)元培養(yǎng)基，細(xì)胞放置于37 °C，5 % CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟2中使用的活檢針為半自動(dòng)或全自動(dòng)活檢針。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟3中復(fù)合酶消化液中各個(gè)酶的濃度均為lmg/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟3中酶消化過程為使用4 °C復(fù)合酶消化液消化4-20h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特 征在于，所述步驟5中復(fù)合酶消化過程為在37 °C條件下消化10min-2h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟4中預(yù)貼壁培養(yǎng)基為含Laminin和10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟4中預(yù)貼壁培養(yǎng)基中Laminin濃度為lug/ml。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟4中神經(jīng)元培養(yǎng)基為含B27、L-谷氨酰胺的Neurobasal培養(yǎng)基。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述步驟4中離心條件為400g，離心5分鐘。10. -種根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的原代小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng) 方法所培養(yǎng)的小鼠或大鼠神經(jīng)元細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/0793GK105907717SQ201610277888
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】王曉冰
【申請人】王曉冰