抗原活化的免疫細胞及其培養(yǎng)方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗原活化的免疫細胞及其培養(yǎng)方法和應用。本發(fā)明抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法包括如下步驟：采集患者的外周血單個核細胞的步驟和將所述單個核細胞與腫瘤抗原和/或細胞因子加入無血清培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明抗原活化的免疫細胞用于制備細胞治療腫瘤藥物。本發(fā)明抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法全程采用無血清培養(yǎng)基，有效避免了任何可能的外源性感染；抗原特異性強，多種細胞被激活，作用更接近人體抗腫瘤作用的整體效應，培養(yǎng)時間短。本發(fā)明抗原活化的免疫細胞和細胞治療腫瘤藥物能夠在體內(nèi)誘導產(chǎn)生多個表位特異性的抗腫瘤效應網(wǎng)絡，各個效應網(wǎng)絡之間相互協(xié)作共同實現(xiàn)抗腫瘤作用。
【專利說明】
抗原活化的免疫細胞及其培養(yǎng)方法和應用
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體的涉及一種抗原活化的免疫細胞及其培養(yǎng)方法和其應用。
【背景技術】
[0002]DC細胞又稱樹突狀細胞，是一種具有高效殺傷活性的異質(zhì)性細胞群，其在外人體周血淋巴細胞中的比例為1%?5%，臨床證實，DC經(jīng)大量擴增后，具有顯著殺傷腫瘤和清除病毒的活性，且DC在機體細胞免疫和體液免疫中起重要調(diào)控作用。
[0003]DC細胞免疫療法是生物治療中最重要組成部分，其過程是提取患者自身的免疫細胞在體外活化、修飾、增殖后回輸患者體內(nèi)，誘導機體產(chǎn)生特異性或非特異性的免疫應答，在患者體內(nèi)發(fā)揮殺滅腫瘤細胞和抗病毒作用。由于DC免疫細胞本身的生物特性，決定了其自2011年以來較理想、較成熟的腫瘤生物治療用途。
[0004]DC細胞治療方案的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下4個方面。
[0005]1、效率性，有效率高:DC細胞治療技術是繼干擾素以來，首次把總有效率提高到70%以上的生物治療。
[0006]2、無毒副作用，用自己的抗癌細胞對抗腫瘤。DC細胞療法通過生物工程技術提取患者自身細胞經(jīng)培養(yǎng)、增殖、修飾后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，不會產(chǎn)生排異反映，無毒副作用，變耐藥性，安全有效。
[0007]3、安全性，所有細胞均在國際認證的GMP實驗室培養(yǎng)安全可靠。
[0008]4、不易復發(fā)，DC細胞具有永久記憶功能，和天花疫苗一樣DC能長期記憶腫瘤信息，能長期刺激抗癌系統(tǒng)對腫瘤發(fā)動攻擊。
[0009]雖然DC治療方案具有許多優(yōu)點，但是DC細胞培養(yǎng)存在下述不足:
[0010]1.培養(yǎng)的細胞種類單一;2.培養(yǎng)周期相對較長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種抗原活化的免疫細胞及其培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有DC細胞培養(yǎng)存在培養(yǎng)的細胞種類單一;2.培養(yǎng)周期相對較長的技術問題。
[0012]本發(fā)明另一目的在于提供一種抗腫瘤藥物，以克服現(xiàn)有其他細胞治療藥物存在外源性感染、培養(yǎng)獲取時間長從而耽誤患者腫瘤播散的風險。
[0013]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，作為本發(fā)明的一個方面，提供了一種抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法。本發(fā)明培養(yǎng)方法包括如下步驟:
[0014]采集患者的外周血單個核細胞；
[0015]將所述單個核細胞與腫瘤抗原和細胞因子加入無血清培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng);其中，所述腫瘤抗原包括前列腺癌特異性的抗原蛋白(PSA)、黑色素瘤特異性的抗原(MAGE-3) ,NY-ES0-1中的至少一種，所述細胞因子包括IL-2，IL-14，G_CSF中的至少一種。
[0016]作為本發(fā)明的另一方面，提供了一種抗原活化的免疫細胞。所述抗原活化的免疫細胞是采用本發(fā)明抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得。
[0017]作為本發(fā)明的再一方面，提供了一種細胞治療腫瘤藥物，其特征在于:包含有有效劑量的本發(fā)明抗原活化的免疫細胞。
[0018]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法具有以下優(yōu)點:
[0019]1.全程采用無血清培養(yǎng)基，有效避免了任何可能的外源性感染；
[0020]2.抗原特異性強，采用重組表達的腫瘤特異性抗原，可大量制備，避免了采用腫瘤組織作為抗原時抗原量的不確定性，同時，針對不同的腫瘤類型可采用不同的腫瘤抗原；
[0021]3.多種細胞被激活，作用更接近人體抗腫瘤作用的整體效應:本發(fā)明培養(yǎng)方法獲得的抗原活化的免疫細胞以抗原遞呈細胞為中心，同時包括大量抗原特異性活化的抗腫瘤T淋巴細胞等，是一個以抗原在體外啟動抗腫瘤免疫，輸入體內(nèi)后觸發(fā)后續(xù)一系列級聯(lián)、網(wǎng)絡化免疫反應，在體內(nèi)重新活化以殺傷性T細胞及其抗腫瘤細胞因子為主，以NK/NKT、甚至體液免疫為輔的多條抗腫瘤免疫途徑。
[0022]4.培養(yǎng)時間短:整個制備時間縮短至48小時以內(nèi)，極大的保持了效應細胞的活性和增殖能力。突破了傳統(tǒng)基于樹突狀細胞或T淋巴細胞治療，克服了原有制備手段復雜、效應細胞老化、增殖能力下降，體內(nèi)生存時間短以及由此導致的制備時間長和費用昂貴的缺點，具有明顯的創(chuàng)新優(yōu)勢。同時，由于培養(yǎng)時間短，回輸方便，大大減小了患者采樣后等待治療的時間，避免了潛在的大量采集血細胞后患者腫瘤免疫失調(diào)、導致腫瘤擴散的可能。
[0023]本發(fā)明抗原活化的免疫細胞由于本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得，本發(fā)明細胞治療腫瘤藥物含有本發(fā)明抗原活化的免疫細胞，因此，本發(fā)明抗原活化的免疫細胞和細胞治療腫瘤藥物能夠在體內(nèi)誘導產(chǎn)生多個表位特異性的抗腫瘤效應網(wǎng)絡，各個效應網(wǎng)絡之間相互協(xié)作共同實現(xiàn)抗腫瘤作用。這樣，本發(fā)明抗原活化的免疫細胞的特異性既包括針對多種抗原表位的多表位特異性，又包括針對每種抗原表位的多種效應手段(殺傷性T細胞、Thl、細胞因子、NK/NKT、體液等)，這種良好的特異性具有優(yōu)秀的抗腫瘤作用。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明實施例抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法的工藝流程圖；
[0025]圖2為本發(fā)明實施例1誘導擴增的抗原活化的免疫細胞進行體外刺激機體分泌抗腫瘤的細胞因子的凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]—方面，本發(fā)明實施例提供了一種抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法。在一實施例中，所述抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法流程如圖1所示，其包括如下步驟:
[0028]S01:采集患者的外周血單個核細胞；
[0029]S02:單個核細胞活化培養(yǎng):將所述單個核細胞與腫瘤抗原和細胞因子加入無血清培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)。
[0030]在上述本發(fā)明實施例抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法中，抗原活化的免疫細胞(Antigen Activated Immune Cells，AAIC)，在本發(fā)明實施例中，其是通過白細胞分離技術從患者的血液中收集大量具有抗腫瘤潛能的單個核細胞(以單核細胞和淋巴細胞為主)，通過特殊的分離、純化、培養(yǎng)、用腫瘤特異性抗原刺激獲得的大量細胞。這些細胞包含以樹突細胞為核心的多種活化的效應細胞(如腫瘤靶標特異性殺傷性T細胞)，回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)后會誘導靶標特異性的抗腫瘤免疫反應，從而達到識別腫瘤和清除腫瘤的作用。
[0031]其中，上述步驟SOl中，作為本發(fā)明的一實施例，外周血單個核細胞的采集可以但不僅僅按照如下方法:
[0032]首先通過白細胞分離技術獲得患者的白細胞，再采集獲得外周血單個核細胞。
[0033]在一實施例中，該白細胞分離技術可以是本領域常規(guī)的白細胞分離技術，在具體實施例中，可以直接采用白細胞分離機進行分離和收集患者的白細胞。在另一具體實施例中，分離和收集患者的白細胞的數(shù)量可以控制在(1-3) X 19個。
[0034]在另一實施例中，采集獲得外周血單個核細胞可以是采用密度法離心收集外周血單個核細胞。
[0035]在進一步實施例中，在將步驟SOl的采集的單個核細胞加入步驟S02所述無血清培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)之前，還包括對所述單個核細胞進行培養(yǎng)前質(zhì)控檢查的步驟，如圖中的步驟S01’。在具體實施例中，所述培養(yǎng)前質(zhì)控檢查的步驟S01’包括活細胞計數(shù)、無菌檢測和FACS分析步驟。
[0036]其中，所述活細胞計數(shù)的方法-采用血球計數(shù)板計數(shù)；
[0037]無菌檢測的方法-采用凝膠法測定細菌內(nèi)毒素；
[0038]FACS分析的方法-采用流式細胞儀分析細胞表型。
[0039]通過增設前期質(zhì)控檢查的步驟，從而對活細胞數(shù)量和細胞類型，以保證單個核細胞的活力，從而進一步提尚AAIC的活化率。
[0040]上述步驟S02中，采用重組表達的腫瘤特異性抗原，一方面可大量制備，避免了采用腫瘤組織作為抗原時抗原量的不確定性。另一方面針對不同的腫瘤類型可采用不同的腫瘤抗原，即針對每一種腫瘤類型，AAIC均使用其特異性的腫瘤抗原。針對每一種腫瘤類型，AAIC使用的腫瘤抗原具有多種特異性，活化針對多種蛋白質(zhì)抗原、多肽抗原。
[0041]在一實施例中，加入無血清培養(yǎng)基中的所述腫瘤抗原包括前列腺癌特異性的抗原蛋白(PSA)、黑色素瘤特異性的抗原(MAGE-3)、NY-ES0-1中的至少一種。
[0042]在另一實施例中，加入無血清培養(yǎng)基中的所述細胞因子包括IL-2，IL-14，G_CSF中的至少一種。
[0043]在具體實施例中，腫瘤抗原和細胞因子可以有如下組合:
[0044]一具體實施例中，所述腫瘤抗原為所述NY-ES0-1，且所述細胞因子包括IL-14、G_CSF0
[0045]另一具體實施例中，所述腫瘤抗原為所述前列腺癌特異性的抗原蛋白，且所述細胞因子包括 IL-2、IL-14、G-CSF。
[0046]再一具體實施例中，所述腫瘤抗原為所述黑色素瘤特異性的抗原蛋白，且所述細胞因子包括 IL-2、IL-14、G-CSF。
[0047]中上述各實施例的基礎上，在所述活化培養(yǎng)的過程中，所述腫瘤抗原的終濃度為500-1000U/ml，所述IL-2的終濃度為500-1000u/ml，所述IL-14的終濃度為 10-50ng/ml，所述G-CSF的終濃度為50-150ng/ml。
[0048]如在一具體實施例中，當所述腫瘤抗原為所述NY-ES0-1，且所述細胞因子包括IL-
14、G-CSF時，在所述活化培養(yǎng)的過程中，所述NY-ES0-1的終濃度為1000U/ml，所述IL-14的終濃度為10ng/ml，所述G-CSF的終濃度為100ng/ml。
[0049]在另一具體實施例中，當所述腫瘤抗原為所述前列腺癌特異性的抗原蛋白，且所述細胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF時，在所述活化培養(yǎng)的過程中，所述前列腺癌特異性的抗原蛋白的終濃度為500U/ml，所述IL-2的終濃度為1000u/ml，所述IL-14的終濃度為20ng/ml，所述G-CSF的終濃度為150ng/ml。
[0050]在再一具體實施例中，當所述腫瘤抗原為所述黑色素瘤特異性的抗原蛋白，且所述細胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF時，在所述活化培養(yǎng)的過程中，所述黑色素瘤特異性的抗原的終濃度為1000U/ml，所述IL-2的終濃度為500u/ml，所述IL-14的終濃度為50ng/ml，所述G-CSF的終濃度為100ng/ml。
[0051]這樣，由于針對不同的腫瘤類型可采用不同的腫瘤抗原。如在具體實施例中，采用前列腺癌特異性的抗原蛋白可以激活前列腺癌特異性的免疫細胞群。在另具體實施例中，采用黑色素瘤特異性的抗原可激活黑色素瘤特異性的免疫細胞群。在又具體實施例中，采用腫瘤特異性共享抗原如NY-ES0-1、MAGE-3等可激活多種抗腫瘤免疫細胞群。另外，上述各實施例中，通過對這些腫瘤蛋白質(zhì)抗原、多肽抗原進行重組優(yōu)化、組合、添加輔助性肽鏈，產(chǎn)生了不同于其他產(chǎn)品的抗原組合。通過使用這些腫瘤蛋白質(zhì)抗原、多肽抗原的重組優(yōu)化、組合、添加輔助性肽鏈，實現(xiàn)了對多抗原、對多表位特異性的殺傷性T細胞的活化，以及以殺傷性T細胞為主的多個次要(NK/NKT，Th I )、下游(細胞因子，體液)等多價的、網(wǎng)絡化的特異性抗腫瘤作用。這樣產(chǎn)生的AAIC將在體內(nèi)誘導產(chǎn)生多個表位特異性的抗腫瘤效應網(wǎng)絡，各個效應網(wǎng)絡之間相互協(xié)作共同實現(xiàn)抗腫瘤作用。因此AAIC的特異性既包括針對多種抗原表位的多表位特異性，有包括針對每種抗原表位的多種效應手段(殺傷性T細胞、Thl、細胞因子、NK/NKT、體液等)，這種良好的特異性具有優(yōu)秀的抗腫瘤作用。
[0052]在另一實施例中，在步驟S02的所述活化培養(yǎng)的過程中，所述單個核細胞在所述無血清培養(yǎng)基的濃度為(1-5) X 106。
[0053]通過對單個核細胞與所述腫瘤抗原和/或細胞因子的濃度和其在無血清培養(yǎng)基的濃度的控制和優(yōu)化，提高腫瘤抗原和/或細胞因子對單個核細胞的活化效果，從而提高有效AAIC的量，并提高AAIC的生成速率，縮短降低活化培養(yǎng)的時間。
[0054]在一實施例中，該步驟S02中所用的無血清培養(yǎng)基選用但不僅僅為1640培養(yǎng)基。
[0055]在進一步實施例中，在上述步驟S02之后，也即是在將所述單個核細胞加入所述無血清培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)之后，還包括對所述活化培養(yǎng)后的細胞進行活化培養(yǎng)后質(zhì)控檢查的步驟。在具體實施例中，活化培養(yǎng)后質(zhì)控檢查的步驟包括活細胞計數(shù)、無菌檢測、內(nèi)毒素檢測和FACS分析步驟。
[0056]內(nèi)毒素檢測的方法-凝膠法。
[0057]通過增設后期質(zhì)控檢查的步驟，通過基本的檢菌、內(nèi)毒素檢測等項目以保證活化后的AAIC的質(zhì)量，還對活化的AAIC表面標志上做了更加嚴格的控制，如對AAIC中主要細胞成分的檢測和控制，具體的如⑶40、CD54等樹突細胞表面標志物、CD62L、CD57等T細胞表面標志物均要求的表達有十數(shù)倍增高，充分保證了AAIC產(chǎn)品的表型，這些表型研究表明都是樹突細胞和殺傷性T細胞良好功能的標志。
[0058]因此，由上述可知，AAIC培養(yǎng)方法對活化培養(yǎng)工藝進行優(yōu)化，一是圍繞產(chǎn)品質(zhì)量控制的改進:在廣品質(zhì)量控制上，我們除了基本的檢菌、內(nèi)毒素檢測等項目，在廣品表面標志上做了更加嚴格的要求，如對產(chǎn)品中主要細胞成分的要求，CD40、CD54等樹突細胞表面標志物、CD62L、CD57等T細胞表面標志物均要求的表達有十數(shù)倍增高，充分保證了 AAIC產(chǎn)品的表型，這些表型研究表明都是樹突細胞和殺傷性T細胞良好功能的標志。二是圍繞生產(chǎn)過程簡化、優(yōu)化的改進:我們對AAIC的生產(chǎn)流程做了大量的改進，使患者細胞在獲得腫瘤殺傷和誘導抗腫瘤免疫作用的功能以外，盡可能少的受非自體因素的影響，大大的降低了潛在污染、細胞老化、抗腫瘤潛能降低等可能。三是極大的縮短了培養(yǎng)時間，整個活化培養(yǎng)時間縮短至48小時以內(nèi)，極大的保持了效應細胞的活性和增殖能力，由于培養(yǎng)時間短，回輸方便，大大減小了患者采樣后等待治療的時間，避免了潛在的大量采集血細胞后患者腫瘤免疫失調(diào)、導致腫瘤擴散的可能。而傳統(tǒng)培養(yǎng)方式均在一周左右的時間，過程復雜，操作繁多，產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，從而突破了傳統(tǒng)基于樹突狀細胞或T淋巴細胞治療，克服了原有制備手段復雜、效應細胞老化、增殖能力下降，體內(nèi)生存時間短以及由此導致的制備時間長和費用昂貴的缺點。
[0059]另外，本發(fā)明實施例AAIC培養(yǎng)方法能夠針對每一種腫瘤類型均使用其特異性的腫瘤抗原。針對每一種腫瘤類型，AAIC培養(yǎng)方法所使用的腫瘤抗原具有多種特異性，活化針對多種蛋白質(zhì)抗原、多肽抗原。通過使用這些腫瘤蛋白質(zhì)抗原、多肽抗原的重組優(yōu)化、組合、添加輔助性肽鏈，實現(xiàn)了對多抗原、對多表位特異性的殺傷性T細胞的活化，以及以殺傷性T細胞為主的多個次要(NK/NKT，Thl)、下游(細胞因子，體液)等多價的、網(wǎng)絡化的特異性抗腫瘤作用。這樣產(chǎn)生的AAIC將在體內(nèi)誘導產(chǎn)生多個表位特異性的抗腫瘤效應網(wǎng)絡，各個效應網(wǎng)絡之間相互協(xié)作共同實現(xiàn)抗腫瘤作用。因此AAIC的特異性既包括針對多種抗原表位的多表位特異性，有包括針對每種抗原表位的多種效應手段(殺傷性T細胞、Thl、細胞因子、NK/NKT、體液等)，這種良好的特異性具有優(yōu)秀的抗腫瘤作用。
[0060]其次，活化培養(yǎng)獲得的AAIC如上所述，AAIC是多抗原刺激產(chǎn)生的產(chǎn)品，同時AAIC是包含多重細胞類型，不僅僅是單一的樹突細胞，它的抗腫瘤作用具有多價特異性和多重特異性，即具有橫向的多價抗原，又具有縱向的同一抗原的多重特異性效應，形成強大的抗腫瘤協(xié)同效應，這一效應真實的模擬了體內(nèi)免疫系統(tǒng)抗擊“非己”抗原時的情況，具有全面性、仿真性。其優(yōu)點是:一，避免了過去其他產(chǎn)品使用單一抗原多肽的單價性，抗腫瘤作用不全面，在殺傷腫瘤過程中腫瘤細胞容易發(fā)生耐受、逃逸免疫殺傷;二，避免了其他產(chǎn)品抗腫瘤作用的單一層面，很多產(chǎn)品使用單一的樹突細胞，細胞在體外活化過于充分，回輸后容易死亡，同時不利于樹突細胞對其相互作用的下游效應細胞進行活化，AAIC是一個多細胞混合培養(yǎng)產(chǎn)品，其相互產(chǎn)生的細胞因子等對下游腫瘤特異性效應細胞有良好的激活作用，這種多細胞共培養(yǎng)的方式正是體內(nèi)局部或全身產(chǎn)生抗腫瘤免疫時的真實反映。
[0061]另一方面，在上述AAIC培養(yǎng)方法的基礎上，本發(fā)明實施例還提供了一種抗原活化的免疫細胞(AAIC)。在一實施例中，該AAIC是有上文本發(fā)明實施例AAIC培養(yǎng)方法活化培養(yǎng)獲得。這樣本發(fā)明所述AAIC如上文所述的，具有能夠在體內(nèi)誘導產(chǎn)生多個表位特異性的抗腫瘤效應網(wǎng)絡，各個效應網(wǎng)絡之間相互協(xié)作共同實現(xiàn)抗腫瘤作用。其中，本發(fā)明實施例AAIC的特異性既包括針對多種抗原表位的多表位特異性，又包括針對每種抗原表位的多種效應手段(殺傷性T細胞、Thl、細胞因子、NK/NKT、體液等)，這種良好的特異性具有優(yōu)秀的抗腫瘤作用。
[0062]再一方面，本發(fā)明實施例還提供了一種細胞治療腫瘤藥物。在一實施例中，本發(fā)明實施例細胞治療腫瘤藥物包含有有效劑量的上文本發(fā)明實施例AAIC。這樣，由于本發(fā)明實施例細胞治療腫瘤藥物含有上文本發(fā)明實施例AAIC，因此，該細胞治療腫瘤藥物具有上文本發(fā)明實施例AAIC的特性，如具有能夠在體內(nèi)誘導產(chǎn)生多個表位特異性的抗腫瘤效應網(wǎng)絡，各個效應網(wǎng)絡之間相互協(xié)作共同實現(xiàn)抗腫瘤作用。而且，如上文所述，AAIC的培養(yǎng)時間短，因此，縮短了本發(fā)明實施例細胞治療腫瘤藥物獲得時間，大大減小了患者采樣后等待治療的時間，從而使得患者能夠及時得到治療，避免了潛在的大量采集血細胞后患者腫瘤免疫失調(diào)、導致腫瘤擴散的可能。
[0063]下面通過具體實施例對上述本發(fā)明實施例抗原活化的免疫細胞及其培養(yǎng)方法進一步說明。
[0064]實施例1
[0065]本實施例提供一種抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法以及由該方法培養(yǎng)的抗原活化的免疫細胞。該抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法包括以下步驟:
[0066]Sll.外周血單個核細胞(PMBC)懸液制備:
[0067]抽取病人外周血50ml，用生理鹽水1:1稀釋后加入淋巴細胞分離液15ml，離心(2000rpm，20min)，收集白膜層細胞；
[0068]用50ml鹽水洗三次，最后用含100ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-14的1640培養(yǎng)液(12ml)重懸；
[0069]S12.AAIC的誘導擴增:
[0070]將步驟SI I制備的PMBC懸液分裝入六孔板中，PMBC濃度5 X 106/ml，2ml/孔，加入對應的抗原NY-ES0-1，1000U/ml ；
[0071]置于飽和濕度、37 °C、5.0 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0072]第5天收獲AAIC，取樣進行活細胞計數(shù)，內(nèi)毒素檢測，流式細胞檢測，結(jié)果合格后可用于細胞回輸。
[0073]將本實施例1誘導擴增的AAIC進行體外培養(yǎng)，并將培養(yǎng)的產(chǎn)物進行凝膠電泳試驗，得知其AAIC刺激機體能夠分泌IL-2、TNF-a、IFN- γ等多種抗腫瘤的細胞因子。
[0074]實施例2
[0075]本實施例提供一種抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法以及由該方法培養(yǎng)的抗原活化的免疫細胞。該抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法步驟如實施例1中培養(yǎng)步驟，不同之處在于腫瘤抗原為前列腺癌特異性的抗原蛋白(PSA)，細胞因子為IL-2、IL-14和G-CSF的組合，其中，PSA的終濃度為500u/ml，IL-2的終濃度為1000u/ml，IL-14的終濃度為20ng/ml，G_CSF的終濃度為150ng/ml。
[0076]實施例3
[0077]本實施例提供一種抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法以及由該方法培養(yǎng)的抗原活化的免疫細胞。該抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法步驟如實施例1中培養(yǎng)步驟，不同之處在于腫瘤抗原為黑色素瘤特異性的抗原(MAGE-3)，細胞因子為IL-2、IL-14和G-CSF的組合，其中，MAGE-3的終濃度為1000U/ml，IL-2的終濃度為500u/ml，IL-14的終濃度為50ng/ml，G_CSF的終濃度為100ng/ml。
[0078]將本實施例2、3誘導擴增的AAIC進行體外培養(yǎng)，并將培養(yǎng)的產(chǎn)物進行凝膠電泳試驗’得知其六六^刺激機體也能夠分泌幾^即-^正^丫等多種抗腫瘤的細胞因子。
[0079]由實施例1-3提供的AAIC的體外實驗得知，本發(fā)明實施例提供的AAIC包括針對多種抗原表位的多表位特異性，又包括針對每種抗原表位的多種效應手段，這種良好的特異性具有優(yōu)秀的抗腫瘤作用。
[0080]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1.一種抗原活化的免疫細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: 采集患者的外周血單個核細胞； 將所述單個核細胞與腫瘤抗原和細胞因子加入無血清培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng);其中，所述腫瘤抗原包括前列腺癌特異性的抗原蛋白、黑色素瘤特異性的抗原、NY-ESO-1中的至少一種，所述細胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF中的至少一種。2.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述腫瘤抗原為所述NY-ES0-1，且所述細胞因子包括IL-14、G-CSF;或 所述腫瘤抗原為所述前列腺癌特異性的抗原蛋白，且所述細胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF^ 所述腫瘤抗原為所述黑色素瘤特異性的抗原蛋白，且所述細胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF03.根據(jù)權利要求1或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:在所述活化培養(yǎng)的過程中，所述腫瘤抗原的終濃度為500-1000U/ml，所述IL-2的終濃度為500-1000u/ml，所述IL-14的終濃度為 10-50ng/ml，所述 G-CSF 的終濃度為 50-150ng/ml。4.根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述腫瘤抗原為所述NY-ES0-1，且所述細胞因子包括IL-14、G-CSF時，在所述活化培養(yǎng)的過程中，所述NY-ES0-1的終濃度為1000U/ml，所述IL-14的終濃度為10ng/ml，所述G-CSF的終濃度為100ng/ml ； 所述腫瘤抗原為所述前列腺癌特異性的抗原蛋白，且所述細胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF時，在所述活化培養(yǎng)的過程中，所述前列腺癌特異性的抗原蛋白的終濃度為500U/ml，所述IL-2的終濃度為1000u/ml，所述IL-14的終濃度為20ng/ml，所述G-CSF的終濃度為150ng/ml； 所述腫瘤抗原為所述黑色素瘤特異性的抗原蛋白，且所述細胞因子包括IL-2、IL-14、G-CSF時，在所述活化培養(yǎng)的過程中，所述黑色素瘤特異性的抗原的終濃度為1000U/ml，所述IL-2的終濃度為500u/ml，所述IL-14的終濃度為50ng/ml，所述G-CSF的終濃度為10ng/ml ο5.根據(jù)權利要求1、2、4任一所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:在所述活化培養(yǎng)的過程中，所述單個核細胞在所述無血清培養(yǎng)基的濃度為(1-5) XxlO6。6.根據(jù)權利要求1、2、4任一任一所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:在將所述單個核細胞加入所述無血清培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)之前，還包括對所述單個核細胞進行培養(yǎng)前質(zhì)控檢查的步驟。7.根據(jù)權利要求6所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述培養(yǎng)前質(zhì)控檢查的步驟包括活細胞計數(shù)、無菌檢測和FACS分析步驟。8.根據(jù)權利要求1、2、4任一所述的培養(yǎng)方法，其特征在于:在將所述單個核細胞加入所述無血清培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)之后，還包括對所述活化培養(yǎng)后的細胞進行活細胞計數(shù)、無菌檢測、內(nèi)毒素檢測和FACS分析步驟。9.一種抗原活化的免疫細胞，其特征在于:所述抗原活化的免疫細胞是采用權利要求1-8任一所述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得。10.一種細胞治療腫瘤藥物，其特征在于:包含有有效劑量的權利要求9所述的抗原活化的免疫細胞。
【文檔編號】A61K39/00GK105907712SQ201610262108
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月25日
【發(fā)明人】田耕, 夏燕, 畢冬梅, 李小燕, 肖奕丹
【申請人】深圳市第二人民醫(yī)院