專(zhuān)利名稱(chēng)：用于完整膜蛋白晶體生長(zhǎng)的形成分形的烷基乙烯酮二聚物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及結(jié)晶學(xué)和蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)。更具體說(shuō)，本發(fā)明涉及促進(jìn)完整膜蛋白晶體生長(zhǎng)的裝置和方法。
背景技術(shù)：
確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)和分子生物學(xué)中的重要步驟。采用X射線(xiàn)或電子結(jié)晶學(xué)技術(shù)，實(shí)際上可從衍射數(shù)據(jù)在原子水平分辨率上確定生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸及其各種復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)信息使我們加深了對(duì)重要生物過(guò)程的理解，也可指導(dǎo)藥物設(shè)計(jì)。
確定靶大分子的晶體結(jié)構(gòu)的第一個(gè)步驟是生長(zhǎng)出大的、衍射良好的大分子結(jié)晶。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)信息對(duì)于藥物開(kāi)發(fā)的重要性，收集和分析衍射數(shù)據(jù)的技術(shù)變得更加快速和自動(dòng)化。然而，蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)已經(jīng)成為確定結(jié)構(gòu)過(guò)程中的限速步驟。據(jù)證明，當(dāng)傳統(tǒng)的晶體生長(zhǎng)方法應(yīng)用于許多生物大分子時(shí)不成功或效率低。具體說(shuō)，自動(dòng)化技術(shù)難以處理完整膜蛋白，因?yàn)樗鼈冃枰w生長(zhǎng)介質(zhì)中存在去污劑和脂質(zhì)分子。
蒸汽擴(kuò)散是最廣泛采用的蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)。在蒸氣擴(kuò)散中，讓含有大分子、穩(wěn)定緩沖液、沉淀劑(percipient)和結(jié)晶助劑的液滴在暴露于較大貯池的封閉系統(tǒng)中平衡。該貯池通常與結(jié)晶液滴含有相同的成分(除大分子以外)，但濃度較高，以使水優(yōu)選從液滴中蒸發(fā)。通過(guò)將液滴懸掛在玻璃蓋板上(懸滴法)或通過(guò)讓液滴位于貯池溶劑(液面)水平之上的基座上(直滴法(the sitting drop method))將該液滴與結(jié)晶溶劑貯池分開(kāi)。一定時(shí)間后，結(jié)晶液滴和貯池溶液通過(guò)蒸氣擴(kuò)散平衡。獲得大分子的過(guò)飽和濃度，導(dǎo)致液滴中的大分子樣品結(jié)晶。
膜蛋白一般高度疏水，因此難于結(jié)晶。膜蛋白也趨于無(wú)定形聚集，而不形成良序三維結(jié)晶。脂質(zhì)立方相(Lipidic Cubic Phase，LCP)結(jié)晶等技術(shù)已成功用于通過(guò)將膜蛋白樣品與液體混合形成蛋白和脂質(zhì)的凝膠樣乳液來(lái)結(jié)晶完整膜蛋白(Landau，EM和JP Rosenbusch，PNAS，1996，9314532-14535)。該乳液中的脂質(zhì)形成立方體形三維晶格，其中疏水膜蛋白可形成三維結(jié)晶。
因此，晶體生長(zhǎng)介質(zhì)中需要去污劑和脂質(zhì)分子使完整膜蛋白的結(jié)晶變得復(fù)雜。雖然自動(dòng)化技術(shù)能夠使生物分子的高通量結(jié)晶明顯生長(zhǎng)，但是去污劑和脂質(zhì)的存在阻礙了大部分高通量技術(shù)。一般用直滴技術(shù)進(jìn)行快速結(jié)晶篩選，在表面如塑料或玻璃上形成排列的(in arrays)結(jié)晶。嘗試用高通量結(jié)晶技術(shù)結(jié)晶完整膜蛋白產(chǎn)生的結(jié)果令人失望，因?yàn)閷⒛さ鞍拙S持在溶解狀態(tài)需要去污劑，以及脂質(zhì)，這會(huì)明顯降低結(jié)晶液滴的表面張力。該液滴常常完全覆蓋塑料表面，抑制結(jié)晶。
而且，希望結(jié)晶液滴與其所在表面的接觸面最小化，因?yàn)橛刑崾菊f(shuō)表面和液體界面是晶體生長(zhǎng)隨機(jī)性的主要來(lái)源。具體說(shuō)，由于灰塵累積和其它表面變化，表面/液體界面非常有助于非均質(zhì)性。因此，液滴和表面之間接觸面越小導(dǎo)致結(jié)晶越好。
據(jù)提示，烷基乙烯酮二聚物(AKD)可用于可溶性大分子的結(jié)晶表面(Shibuichi等，1996，J.Phys.Chem.5019512-17)，但不用于完整膜蛋白。烷基乙烯酮二聚物產(chǎn)生防水性的能力是造紙工業(yè)中熟知的，其中它用作防濕劑。由于這種防水性，F(xiàn)ujii和Hirayama用烷基乙烯酮二聚物涂覆的表面來(lái)結(jié)晶水溶性蛋白質(zhì)溶菌酶(I.Fujii和N.Hirayama，Acta Crystallogr D.Biol.Crystallogr.1999，551247-49)。烷基乙烯酮二聚物在冷卻時(shí)自發(fā)形成分形結(jié)構(gòu)。Fujii和Hirayama證明了這些分形表面增大了液滴的表面接觸角，從而使液滴和表面的接觸面最小化。
然而，未證明烷基乙烯酮二聚物表面能夠一致有效地使溶于去污劑和脂質(zhì)的完整膜蛋白結(jié)晶。當(dāng)結(jié)晶液滴中存在去污劑時(shí)，采用烷基乙烯酮二聚物涂覆表面和去污劑的實(shí)驗(yàn)在防止表面變濕并促進(jìn)結(jié)晶方面有很大的可變性。這種可變性使純烷基乙烯酮二聚物涂層不適合用于大部分結(jié)晶目的，包括高通量方法。而且，將烷基乙烯酮二聚物涂層用于結(jié)晶生物分子比常規(guī)的硅化更加昂貴，即使是用于結(jié)晶可溶的生物分子。
因此，需要建立能夠使結(jié)晶液滴和液滴所在表面之間的相互作用最小化的表面或表面涂層。更具體說(shuō)，需要這樣的表面，即使在表面活性去污劑和脂質(zhì)存在下這種表面也可產(chǎn)生完整膜蛋白的高質(zhì)量晶體。
因此，本發(fā)明涉及建立和使用包含或涂覆有摻有成核劑的烷基乙烯酮二聚物以提高內(nèi)膜蛋白結(jié)晶的表面。
發(fā)明概要本發(fā)明一方面提供了用于促進(jìn)完整膜蛋白結(jié)晶的裝置，它包括表面和摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂層。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，成核化合物是二烷基酮。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式考慮采用硬脂酰乙烯酮二聚物作為烷基乙烯酮二聚物。也考慮將二硬脂酰酮用作成核化合物。
本發(fā)明另一方面提供了制備表面的方法，以通過(guò)用摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂覆表面來(lái)促進(jìn)完整膜蛋白的結(jié)晶。
該方法的另一實(shí)施方式考慮采用硬酯酰乙烯酮二聚物作為烷基乙烯酮二聚物。也考慮將二硬脂酰酮用作成核化合物。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，通過(guò)氣相沉積施加涂層。
本發(fā)明另一方面提供了一種結(jié)晶完整膜蛋白的方法，該方法通過(guò)將含有完整膜蛋白的液滴溶液施加于用摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂覆的表面上來(lái)結(jié)晶完整膜蛋白。
本發(fā)明的另一實(shí)施方式考慮采用硬酯酰乙烯酮二聚物作為烷基乙烯酮二聚物。也考慮將二硬酯酰酮作為成核化合物。在一些變化方式中，將含有完整膜蛋白的液滴施加于涂覆表面頂部作為直滴。在另一變化方式中，將含有完整膜蛋白的液滴施加于涂覆表面作為懸滴。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示化合物1，烷基乙烯酮二聚物(AKD)圖2說(shuō)明5μl水滴在各種表面上。上排(A-C)顯示水滴的俯視圖，下排(D-F)顯示了水滴的側(cè)視圖。左邊是未處理玻璃(A、D)，中間是硅化玻璃(B、E)，右邊是用摻有二硬酯酰酮的硬酯酰乙烯酮二聚物涂覆的玻璃(C、F)。
圖3說(shuō)明5μl含有0.05％DDM去污劑的水滴在各種表面上。上排(A-C)顯示水滴的俯視圖，下排(D-F)顯示了水滴的側(cè)視圖。左邊是未處理玻璃(A、D)，中間是硅化玻璃(B、E)，右邊是用摻有二硬酯酰酮的硬酯酰乙烯酮二聚物涂覆的玻璃(C，F(xiàn))。
圖4顯示化合物2，二烷基酮(DAK)圖5顯示了SKD分形表面的衍射圖案。
發(fā)明詳述以下實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明的某些原理。這些實(shí)施例不旨在將所要求的權(quán)利范圍限制于任何具體實(shí)施例。根據(jù)本說(shuō)明書(shū)、任何現(xiàn)有技術(shù)和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)，應(yīng)以最廣泛的合理解釋來(lái)理解權(quán)利要求書(shū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，可用以下說(shuō)明書(shū)衍生出許多改變形式。
圖1顯示了烷基乙烯酮二聚物的分子結(jié)構(gòu)圖?？杉訜嵬榛蚁┩畚锊⒆屍湫纬傻奖砻嬷?。而且，烷基乙烯酮二聚物表面在冷卻時(shí)自發(fā)形成分形結(jié)構(gòu)。這些分形表面的表面粗糙度高，從而產(chǎn)生超級(jí)防水性。接觸角是防水性或可濕性的一個(gè)指標(biāo)。提高的表面粗糙度導(dǎo)致液滴和液滴所在分形表面之間的接觸角較大。表面接觸角越大，表面上的液滴越呈球形并且液滴和表面之間的接觸面越小。圖2中顯示了這種效果。
圖2顯示置于各種表面上的5μl水滴。在未處理玻璃上，表面接觸角小于90度，如圖2A和2D所示。在涂覆有硅(硅化)的玻璃上，水的表面接觸角大于140度，如圖2B和2E所示。這與涂覆有烷基乙烯酮二聚物，二硬酯酰乙烯酮的玻璃相當(dāng)。圖2C和2F說(shuō)明二硬酯酰乙烯酮二聚物涂覆的表面上接觸角大。硅化和烷基乙烯酮二聚物涂覆的表面與純水水滴的接觸角大。
如上所述，接觸角是表面促進(jìn)大分子如蛋白質(zhì)結(jié)晶的能力的指標(biāo)。接觸角越大，液滴越呈球形，從而使表面/液體界面的干擾效果最小化。因此，可生長(zhǎng)較高質(zhì)量的晶體。
接觸角和表面的這種關(guān)系在高通量結(jié)晶的新興領(lǐng)域中尤其重要。因此，高通量結(jié)晶是應(yīng)用本發(fā)明的好例子。一般地，高通量技術(shù)采用直滴蒸氣擴(kuò)散形式，其中含有待結(jié)晶大分子的液滴直立在表面頂部。大部分情況下，優(yōu)選將塑料，而非硅化玻璃作為結(jié)晶表面。將高通量結(jié)晶技術(shù)用于完整膜蛋白的嘗試產(chǎn)生的結(jié)果令人失望，因?yàn)樾枰越橘|(zhì)中存在去污劑。去污劑和脂質(zhì)對(duì)于完整膜蛋白的結(jié)晶是必需，因?yàn)樾枰ノ蹌┠z束將大分子維持于溶解狀態(tài)，需要脂質(zhì)來(lái)防止大分子通過(guò)質(zhì)量作用脫脂。
脂質(zhì)和去污劑的存在也降低了結(jié)晶液滴的表面張力，使液滴和表面之間的接觸角明顯減小。如圖3所示。圖3顯示置于各種表面上的5μl含有0.05％十二烷基麥芽苷(DDM)去污劑的水滴。在未處理玻璃上，表面接觸角小于90度，如圖3A和3D所示。在涂覆有硅(硅化)的玻璃上，水的表面接觸角也小于90度，如圖3B和3E所示。然而，在涂覆有摻有二烷基酮的烷基乙烯酮二聚物(摻有二硬酯酰乙烯酮的硬酯酰乙烯酮二聚物)的玻璃上，表面角大于150度。圖3C和3F說(shuō)明在二硬酯酰乙烯酮二聚物涂覆的表面上接觸角大。
因此，烷基乙烯酮二聚物可降低可濕性，并從而增大結(jié)晶液滴的接觸角，即使在使用去污劑時(shí)。具體說(shuō)，硬酯酰乙烯酮二聚物是烷基乙烯酮二聚物，它在臨界膠束濃度或臨界膠束濃度以上在去污劑的存在下促進(jìn)表面可濕性的降低。然而，單獨(dú)的純烷基乙烯酮二聚物涂層是不足夠的。高純烷基乙烯酮二聚物涂層在分形表面中的可變性太高。這種可變性在去污劑存在下導(dǎo)致不一致的可濕性。
當(dāng)采用去污劑時(shí)，僅當(dāng)對(duì)硬酯酰乙烯酮二聚物混合物的組成作出修改時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)烷基乙烯酮二聚物一致的超級(jí)防水特性。因此，烷基乙烯酮二聚物涂層應(yīng)該“摻”有一些改性化合物，以獲得與含有去污劑的液滴一致的結(jié)果。在采用硬酯酰乙烯酮二聚物涂層的實(shí)驗(yàn)中，含有去污劑的液滴表面可濕性的可變性(接觸角)是因?yàn)橛蝉ヵＲ蚁┩畚飿悠分锌勺兊卮嬖谏倭慷蝉ヵＭs質(zhì)。二硬酯酰酮是硬酯酰乙烯酮二聚物的水解產(chǎn)物；重復(fù)將液體硬酯酰乙烯酮二聚物暴露于大氣會(huì)提高二硬酯酰酮的相對(duì)比例。圖4顯示了二烷基酮的分子模型。二硬酯酰酮是二烷基酮的一種形式。二硬酯酰酮和硬酯酰乙烯酮二聚物的比例能夠改變表面可濕性和產(chǎn)生的接觸角。
摻雜效應(yīng)的確切原因未知。我們假設(shè)，二硬酯酰酮污染物相對(duì)于硬酯酰乙烯酮二聚物的熔化溫度越高，產(chǎn)生的分形表面的圖案就越規(guī)則。因此，二硬酯酰酮起到形成硬酯酰乙烯酮二聚物分形結(jié)構(gòu)的成核點(diǎn)的作用。通過(guò)提高二硬酯酰酮的相對(duì)百分?jǐn)?shù)，也提高了成核點(diǎn)的相對(duì)數(shù)量，這進(jìn)而提高所得表面的總復(fù)雜性，因?yàn)樽罱K混合了多成核點(diǎn)引申出的許多不同分形形成生長(zhǎng)圖案。不管是什么原因，這說(shuō)明不同應(yīng)用中可存在二硬酯酰酮/硬酯酰乙烯酮二聚物的最佳比例，對(duì)于結(jié)晶的各個(gè)類(lèi)型的完整膜蛋白也存在二硬酯酰酮/硬酯酰乙烯酮二聚物的最佳比例，因?yàn)楸砻娴膹?fù)雜性可促進(jìn)蛋白結(jié)晶成核和有序生長(zhǎng)。
烷基乙烯酮二聚物混合物可摻有能改變所得表面的復(fù)雜性的任何其它混合物。例如，可將烷基鏈長(zhǎng)度改變的化合物如油酰乙烯酮二聚物引入混合物，以選擇性改變分形生長(zhǎng)圖案，從而降低表面復(fù)雜性。
本發(fā)明考慮采用摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物的混合物，以建立其上可以生長(zhǎng)完整膜蛋白結(jié)晶的表面。如上所述，可根據(jù)任何具體應(yīng)用確定二聚物和成核化合物(或潛在化合物)的比例。本發(fā)明也考慮建立跨表面的(across the surface)烷基乙烯酮二聚物和成核化合物的比例不同的表面。當(dāng)結(jié)晶不同大分子時(shí)，這種表面有助于優(yōu)化比例?？蓪⑷魏涡问降耐榛蚁┩畚锱c能夠改變烷基乙烯酮二聚物表面的分形圖案的任何成核化合物聯(lián)合用于本發(fā)明。摻有二硬酯酰酮的硬酯酰乙烯酮二聚物是本發(fā)明所考慮的烷基乙烯酮二聚物和成核化合物的特定例子。
實(shí)質(zhì)上，可將摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂料施加于任何表面，以建立結(jié)晶表面。例如，可涂覆塑料或玻璃片?？赡芟Ｍ軌?qū)⑼繉邮┘拥帽M可能薄。因?yàn)橐话銚诫s的烷基乙烯酮二聚物涂層是不透明的，較薄的涂層可直接簡(jiǎn)化對(duì)晶體生長(zhǎng)的觀(guān)察?；蛘?，可用X射線(xiàn)衍射來(lái)篩選用可能產(chǎn)生晶體的液滴涂覆的片子。合適的生長(zhǎng)期后，可在液氮中急驟冷凍晶體生長(zhǎng)陣列，并通過(guò)評(píng)價(jià)各晶體生長(zhǎng)液滴衍射x射線(xiàn)的能力一同篩選晶體生長(zhǎng)。在這種情況下，可平行篩選許多晶體生長(zhǎng)條件。
然而，在晶體仍然在烷基乙烯酮二聚物表面上時(shí)篩選晶體不會(huì)使分析復(fù)雜化。此技術(shù)需要由蛋白質(zhì)結(jié)晶產(chǎn)生的X射線(xiàn)衍射圖案去卷積得到烷基乙烯酮二聚物分形表面的X射線(xiàn)衍射圖案。圖5顯示了硬酯酰乙烯酮二聚物的衍射圖案。雖然蛋白質(zhì)結(jié)晶的方向不同會(huì)使分析復(fù)雜化，但是高度聚焦的X射線(xiàn)束將消除這種可能的復(fù)雜情況。
可通過(guò)許多不同方法將摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂覆于表面。用摻有二硬酯酰乙烯酮的硬酯酰乙烯酮二聚物進(jìn)行初步測(cè)試。首先加熱硬酯酰乙烯酮二聚物/二硬酯酰乙烯酮混合物，超過(guò)其熔點(diǎn)，然后將液體轉(zhuǎn)移到固體表面并冷卻?？赡墚a(chǎn)生不同厚度的摻雜的烷基乙烯酮二聚物。本發(fā)明考慮采用蒸氣室，以均勻地施加層或?qū)⑼榛蚁┩畚飺诫s于表面。
本發(fā)明不限于晶體生長(zhǎng)的直滴蒸氣擴(kuò)散法。雖然摻雜的烷基乙烯酮二聚物表面可用于采用直滴結(jié)晶形式的高通量結(jié)晶篩選，但這些表面也可用于其它構(gòu)造。其它構(gòu)造包括夾心滴和懸滴蒸氣擴(kuò)散。
將本說(shuō)明書(shū)中引用的所有刊物和專(zhuān)利申請(qǐng)納入本文作為參考，正如具體地和單獨(dú)地將各刊物或?qū)＠暾?qǐng)單獨(dú)納入本文作為參考的那樣。
雖然為了清楚地理解以說(shuō)明和實(shí)施例的方式詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容可以明顯看出，可對(duì)本發(fā)明作出某些改變和修改，而不背離所附權(quán)利要求的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)完整膜蛋白結(jié)晶的裝置，所述裝置包括表面；和在所述表面上的摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂層。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述烷基乙烯酮二聚物包括硬酯酰乙烯酮二聚物。
3.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述成核化合物是二烷基酮。
4.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述成核化合物是二硬酯酰酮。
5.一種制備能夠促進(jìn)完整膜蛋白結(jié)晶的表面的方法，所述方法包括用摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂覆表面。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述烷基乙烯酮二聚物包括硬酯酰乙烯酮二聚物。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述成核化合物是二烷基酮。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述成核化合物是二硬酯酰酮。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，通過(guò)包括氣相沉積的方法施加所述涂層。
10.一種結(jié)晶完整膜蛋白的方法，所述方法包括將溶液中的完整膜蛋白液滴施加于涂覆有摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物的表面。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，將所述施加的液滴施加在所述涂覆的表面的頂部上，作為直滴。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，將所述施加的液滴施加在所述涂覆的表面上，作為懸滴或夾心滴。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物表面促進(jìn)完整膜蛋白結(jié)晶的裝置。提供了在去污劑的存在下能夠增強(qiáng)完整膜蛋白結(jié)晶的涂層。本發(fā)明另一方面提供了建立摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物表面，以促進(jìn)完整膜蛋白結(jié)晶的方法。本發(fā)明另一方面提供了用摻有成核化合物的烷基乙烯酮二聚物涂覆的表面來(lái)結(jié)晶完整膜蛋白的方法。
文檔編號(hào)G01NGK1856343SQ200480027856
公開(kāi)日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2004年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月25日
發(fā)明者M·漢森 申請(qǐng)人:塞格日斯探索股份有限公司