專利名稱：免疫測定法及其使用的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種免疫測定法，該方法通過使用兩種類型的特征抗體使之能夠精確測定樣品中的靶物質，本發(fā)明還涉及所述方法中使用的試劑盒。更具體地，本發(fā)明涉及一種免疫測定法，其中使用兩種類型的抗體，即對靶物質比對競爭物質具有更高親和性的第一抗體，和對競爭物質比對靶物質具有更高親和性的第二抗體，用這兩種抗體處理樣品，于是樣品中的競爭物質首先與第二抗體結合，這樣樣品中靶物質與競爭物質的比例擴大，使得靶物質變得易于與第一抗體結合，結果，與僅使用第一抗體的情況相比靶物質的反應性提高，因此靶物質可被精確測定；本發(fā)明還涉及在這種方法中使用的試劑盒。
背景技術：
多種類型的物質存在于含有待測定的靶物質的樣品中，并且在某些情況下待測定的靶物質和競爭物質同時存在于特定樣品中。例如，認為血清中大部分的酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP)衍生自破骨細胞的酸性磷酸酶，并且認為測定TRACP可用作評估成骨細胞功能的指征。因此，TRACP是作為骨吸收標記引起人們興趣的物質(Norio Fukunaga，Toshitaka Nakamura和Toshio Matsumoto，“Osseous MetabolismMarker”，Medical Review Co.Ltd.，1995)，并且人們發(fā)現(xiàn)這種酶除具酶促活性外，該酶的降解產(chǎn)物片段也存在于血清中(J Bone MinerRes.151337-1345，2000；和Clin Chem.4774-80.2001)。
此外，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將血清中的酸性磷酸酶分成從起點開始的0-5六個帶。這其中，對應于第五帶的酸性磷酸酶是酒石酸抗性的，被稱為5帶酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP5酒石酸抗性酸性磷酸酶5)。該酸性磷酸酶進一步通過電泳分成具有高含量的與糖鏈結合的唾液酸的5a，和幾乎不含與糖鏈結合的唾液酸的5b。另外，5a是衍生自血小板等的酶且其血液水平不變，而只有5b的血液水平隨骨吸收的變化而變化。因此，人們認為5b是衍生自破骨細胞的酒石酸抗性酸性磷酸酶的主要部分。在“臨床化學”(Clin.Chem.471497.2001)中，還推薦衍生自破骨細胞的ACP可縮寫為TRACP 5b。因此，在本說明書中，涉及衍生自破骨細胞并用做骨吸收指征的ACP的磷酸酶表達為術語“TRACP 5b”，并認為衍生自破骨細胞的酒石酸抗性酸性磷酸酶和酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)是同義的。因此，它們都以術語“TRACP 5b”表達。
除TRACP 5b外，衍生自紅細胞或衍生自血小板的酸性磷酸酶作為ACP存在于樣品中。即，當通過收集樣品引起溶血作用時，衍生自紅細胞的酸性磷酸酶包含于樣品中。當血清用作樣品時，在血清制品血液凝固過程中血小板被破壞，致使衍生自血小板的酸性磷酸酶包含于樣品中。因此，測定TRACP活性的常規(guī)方法不能測定破骨細胞特異性TRACP5b。作為這些測定方法的改進，已知一種方法，其中經(jīng)包括5倍稀釋的血清在37℃培育1小時的預處理后，在酒石酸存在的情況下通過使用對硝基苯基磷酸(pNPP)作為底物，測定剩余的TRACP的活性(“Nichidai-Ishi”，49904-911.1990；和Clin.Chem.33458-462.1987)。該方法使之能夠避免衍生自紅細胞的酸性磷酸酶的影響，但不能排除衍生自血小板的酸性磷酸酶的影響。此外，作為更加特定的活性測定方法，有一種利用TRACP 5b和衍生自紅細胞或血小板的酒石酸抗性酸性磷酸酶之間對氟的敏感性差異之TRACP 5b測定方法(JP-A-10-37198)。然而，盡管該方法能夠避免衍生自紅細胞或血小板的酒石酸抗性酸性磷酸酶的影響，但它不能排除TRACP 5a的影響。此外，該方法需要在精密度上進一步改進，因為在這種方法中通過從總的酒石酸抗性酸性磷酸酶活性減去在氟存在的情況下未被抑制的活性測定TRACP 5b活性。
在免疫測定方法中，例如使用Marius E、Sari L等人的多克隆抗體的方法(J Clin Endocrinol Metab.71442-451.1990；和Clin Chem.461751-1754.2000)和使用Jussi M.Halleen、Heather Bull等人的單克隆抗體的方法(J Bone Miner Res.13683-687.1998；ImmunolLett.70143-149.1999；J Bone Miner Res.14464-469.1999；Clin Chem.452150-2157.1999；和Clin Chem.461751-1754.2000)，測定對應于整個第5帶的活性，因此TRACP 5a的影響不可忽略。此外，Halleen等人的方法(設計該方法以專門測定TRACP 5b)對衍生自破骨細胞的TRACP 5b的活性更有特異性，但在健康人樣品與患有惡化的骨吸收疾病的患者樣品之間僅顯示微小的差異。因此，作為骨吸收標記的TRACP 5b的敏感性不足。人們認為對以前制備的多克隆抗體和單克隆抗體的TRACP 5b的低專一性是上述缺陷的原因。既然報道血清中TRACP含有10倍于活性酶量的大量無酶促活性的片段，還假設血清中這些片段與完整酶競爭，因此由于不利的反應系統(tǒng)其專一性很低。
即使在這種情況下，迄今為止通過免疫測定等方法利用對酶促活性的競爭物質、完整酶和酶降解產(chǎn)物共有的抗原進行定量。然而，結果，當在單克隆抗體的情況下表位有限時，由于降解作用出現(xiàn)了可測量片段和不可測量片段。因此，可推測具有例如如下問題即使在測定同一種靶物質時，使用多種試劑盒獲得的測定結果中沒有相關性。此外，還報道在TRACP的情況下(以前給出的例子)，其片段的量不能在臨床上反應骨吸收(J.Bone Miner.Res.，151337-1345，2000；和Clin.Chem.4774-80，2001)。這被視為僅用于測定酶活形式所必需的適當?shù)睦印Ｔ谶@種情況下，僅酶的水平將通過除去片段測定。通常假設，通過活性測定方法測定TRACP不精確，因為失活片段與酶競爭。而且，沒有用于純化分離蛋白質片段的片段特異性抗體，因此，實質上沒有給出用于分離的方法。
發(fā)明公開本說明書中闡明的TRACP精確測定長期以來都是不可能的，盡管人們認為它具有臨床意義。因此，考慮了下面兩種原因。第一種原因是沒有對指示破骨細胞活性的TRACP 5b具有高度特異性的抗體。第二種原因是通過TRACP酶降解形成的蛋白片段在血清中以超過活性酶的量存在。
因此，本發(fā)明中，通過開發(fā)對TRACP活性酶具有高度結合常數(shù)值的第一抗體以及幾乎不與酶反應但與酶的失活降解片段結合的第二抗體，并將它們用于同一個反應系統(tǒng)中，僅酶活水平被精確測定，而避免降解產(chǎn)物的影響。
考慮到這一問題，本發(fā)明提供了一種免疫測定方法，其中首先聯(lián)合使用與待測靶物質高度反應的第一抗體以及與競爭物質(例如失活片段)高度反應的第二抗體，以排除反應系統(tǒng)中競爭物質的影響，籍此，特異并精確地測定靶物質，例如活性酶。
也就是說，本發(fā)明提供了一種免疫測定方法，其中通過使用兩種類型的抗體測定樣品中的靶物質，該方法包括使用兩種類型的抗體，即具有如下特性的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對靶物質和競爭物質的親和性，(ii)第一抗體對靶物質的親和性高于對競爭物質的親和性，(iii)第二抗體對競爭物質的親和性高于對靶物質的親和性，和(iv)第二抗體對競爭物質的親和性高于第一抗體對靶物質的親和性，使樣品中的靶物質和競爭物質與吸附在載體上的第一抗體和第二抗體結合，然后測量結合的靶物質的水平以測定所述樣品中的靶物質。
此外，本發(fā)明提供了使用兩種類型的抗體免疫測定樣品中靶物質的試劑盒，其中包括兩種類型的抗體，即具有如下特性的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對靶物質和競爭物質的親和性，(ii)第一抗體對靶物質的親和性高于對競爭物質的親和性，(iii)第二抗體對競爭物質的親和性高于對靶物質的親和性，和(iv)第二抗體對競爭物質的親和性高于第一抗體對靶物質的親和性。
附圖簡述

圖1是顯示使用Cyphergen Biosystems.Inc.的Protein ChipSystem分析結果的簡單圖表。從圖表(1)和(2)發(fā)現(xiàn)就抗體Trk49來說，在嬰兒血清中有4種片段與之特異性反應。另一方面，從圖表(3)和(4)發(fā)現(xiàn)就抗體Trk62來說，幾乎沒有片段與之特異性反應。
圖2顯示測定激素治療前、后的骨質疏松患者血清的結果。該治療前觀察到的兩個峰值于治療后消失。從這一事實還推測相應于這兩個峰值的片段對骨吸收是特異性的。
圖3顯示使用相同濃度的抗體Trk49和Trk62進行ELISA的結果?？贵wTrk49僅顯示低反應性。然而，與僅使用抗體Trk62的情況相比，在同時使用抗體Trk49和Trk62的平板上顯示了提高的反應性。
圖4顯示通過吸附抗體Trk62到平板上和吸附抗體Trk62或抗體Trk49到乳膠顆粒上進行ELISA的結果。在獲得的Trk62抗體敏化的乳膠反應物可與平板競爭的情況下，隨著加入的乳膠反應物濃度的提高著色減少。但是，通過對比，就Trk49敏化的乳膠反應物來說，酶的著色值在0.1％～0.15％的實驗組中增加。于是，發(fā)現(xiàn)當與吸附在平板上的抗體Trk62聯(lián)合使用時，Trk49抗體敏化的乳膠反應物是有效的。
實施本發(fā)明的方式本發(fā)明的免疫測定方法中，兩種類型的抗體，即第一抗體和第二抗體用于測定樣品中待測靶物質。所述第一抗體和第二抗體具有如下特性(i)第一抗體具有對靶物質和競爭物質的親和性，(ii)第一抗體對靶物質的親和性高于對競爭物質的親和性，(iii)第二抗體對競爭物質的親和性高于對靶物質的親和性，和(iv)第二抗體對競爭物質的親和性高于第一抗體對靶物質的親和性。本文中，術語“競爭物質”是指與待測靶物質具有相似的抗原性的物質，并且具有這樣的特性，即當制備靶物質的抗體時，所述競爭物質與靶物質競爭與該抗體結合。例如，當靶物質是蛋白質或酶時，競爭物質包括，例如蛋白質或酶的片段、具有在構成蛋白質或酶的氨基酸序列中通過取代、缺失或添加氨基酸殘基形成的氨基酸序列的變體、和通過向蛋白質或酶中添加磷酸酯基或改變蛋白質或酶的糖鏈部分獲得的修飾產(chǎn)物。
本發(fā)明中，待測靶物質的典型例子是完整酶。當靶物質是完整酶時，競爭物質的典型例子是不具有酶促活性的物質，例如通過酶降解獲得的產(chǎn)物，即酶降解產(chǎn)物。
本發(fā)明中各個第一抗體和第二抗體可以是抗血清、多克隆抗體和單克隆抗體中的任何一種。
可制備用于本發(fā)明的第一抗體和第二抗體，方法是例如通過用待測靶物質免疫動物，作為抗原，將動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合以制備雜交瘤，然后選擇具有如下性質的兩種類型的單克隆抗體，作為兩種類型的抗體，即來自由雜交瘤制備各種單克隆抗體的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對靶物質和競爭物質的親和性，(ii)第一抗體對靶物質的親和性高于對競爭物質的親和性，(iii)第二抗體對競爭物質的親和性高于對靶物質的親和性，和(iv)第二抗體對競爭物質的親和性高于第一抗體對靶物質的親和性。本發(fā)明中，第二抗體可以是對靶物質和競爭物質都具有親和性的抗體。為了獲得滿足上述關于靶物質和競爭物質的四個條件的兩種類型的單克隆抗體，例如，下列各項須滿足通過ELISA等測量各種單克隆抗體之靶物質和競爭物質的結合特性，并在測量結果的基礎上，選擇滿足上述四個條件的兩種類型的單克隆抗體。另外，也可根據(jù)公知的方法測定各種單克隆抗體的靶物質和競爭物質的結合常數(shù)(“Protein·Enzyme Fundamental ExperimentalMethods”，Nankohdo Co.，Ltd.)并根據(jù)測量結果選擇兩種類型的單克隆抗體。此外，還可通過使用各種不同的單克隆抗體制備親和層析柱并測定吸附在柱上的靶物質和競爭物質，選擇兩種類型的單克隆抗體。
當兩種類型的抗體中的每一個，即第一抗體和第二抗體是抗血清或多克隆抗體時，例如下列各項是可行的在通過改變佐劑或改變免疫條件建立的各種條件下，用待測靶物質免疫動物，這樣獲得的抗血清或多克隆抗體的靶物質和競爭物質的結合特性通過與上述單克隆抗體存在的情況下相同的方法測定，并選擇滿足上述四個條件的兩種類型的抗體。
本發(fā)明中使用的兩種類型抗體的典型例子是可用于測定衍生自破骨細胞的TRACP 5b的兩種類型的單克隆抗體。與TRACP 5b有關并根據(jù)本發(fā)明獲得的兩種類型的單克隆抗體一個是第一單克隆抗體，該抗體與TRACP 5b的反應性高于此前報道的單克隆抗體，并幾乎不與TRACP 5b的片段反應，另一個是與失活的酶片段反應并幾乎不與活性酶反應的第二單克隆抗體。利用這兩種類型的抗體使對衍生自破骨細胞的TRACP 5b具有特異性的免疫測定方法成為可能，該方法幾乎不受TRACP 5b失活片段和血液中其它同工酶(衍生自紅細胞、血小板、中性白細胞或巨噬細胞)的影響。
通過這些單克隆抗體的例子，下面進一步詳細地闡述用于本發(fā)明的兩種類型的抗體。
上述單克隆抗體可通過使用衍生自人破骨細胞的純化的TRACP 5b作為免疫原獲得。盡管在下文描述的方法中，使用從正常破骨細胞中獲得的抗原進行免疫，不僅該抗原而且破骨細胞瘤的TRACP 5b等都可用做抗原。
上述單克隆抗體由雜交瘤生產(chǎn)，所述雜交瘤通過用純化的人TRACP5b作為抗原免疫動物，并將其能夠產(chǎn)生抗人TRACP 5b抗體的細胞與骨髓瘤細胞融合獲得。
上述雜交瘤可通過如下方法獲得。也就是說，以上述方式獲得的人TRACP 5b與公知的佐劑例如弗氏完全或不完全佐劑、氫氧化鋁佐劑、百日咳桿菌佐劑等混合，制備用于敏化的佐劑液體，該液體通過腹腔皮下或尾部靜脈施用于動物(例如小鼠或大鼠)，以數(shù)個部分每隔1-3周免疫該動物。盡管用于敏化的抗原的量通常在1μg-100mg的范圍內(nèi)選擇，約50μg通常是優(yōu)選的。雖然免疫操作的次數(shù)通常為2-7次，各種方法是已知的。隨后，衍生自脾等的抗體產(chǎn)生細胞在試管中與具有增殖能力的細胞(例如骨髓瘤細胞等)融合。該抗體產(chǎn)生細胞可從小鼠、裸鼠或大鼠獲得。
關于上述融合方法，可通過已公知的Kohller和Milstein的方法(Nature.256，495.1975)使用聚(乙二醇)(PEG)進行融合。融合還可通過使用仙臺病毒(Sendai virus)或通過電融合方法進行。
關于從融合細胞中選擇能夠生產(chǎn)可識別人TRACP 5b的抗體的雜交瘤的方法，可如下進行所述選擇。也就是說，在有限稀釋的上述融合細胞中，從在HAT培養(yǎng)基和HT培養(yǎng)基中存活的細胞形成的集落中選擇雜交瘤。當人TRACP 5b的抗體包含于接種到96-孔平板等中的融合細胞形成的任何集落之培養(yǎng)液上清時，可通過ELISA方法選擇能夠生產(chǎn)人TRACP 5b的單克隆抗體的克隆，其中將上清置于具有固定于其上的人TRACP 5b的測定平板上，反應后，次級標記抗體例如抗-小鼠免疫球蛋白-HRP標記抗體與上述抗體反應。作為標記抗體的標記物質，可使用除HRP外的酶(例如堿性磷酸酶)、熒光物質、放射性物質等。篩選人TRACP5b的特異性抗體，作為對照，可通過進行僅使用BSA與之結合的測定板作為阻斷劑的ELISA，同時進行上述ELISA來完成。即，選擇在具有人TRACP 5b固定于其上的平板上呈陽性并在僅使用BSA的ELISA中呈陰性的克隆。
此外，可同時進行如下測定將抗-小鼠免疫球蛋白抗體接種于微量接種板中，其中加入融合細胞的培養(yǎng)液上清進行反應，再加入純化的TRACP 5b與活性酶結合并形成免疫復合物，然后通過利用產(chǎn)色底物例如pNPP測定這樣結合的酶活。
本發(fā)明中使用的第一單克隆抗體包括能特異性識別人TRACP 5b的單克隆抗體，具體地，它與完整的人TRACP 5b反應，不與衍生自紅細胞、血小板、中性白細胞或前列腺和馬鈴薯ACP的酸性磷酸酶交叉反應，并對人TRACP 5b的失活片段具有低的反應性。其例子是通過由本發(fā)明人建立的雜交瘤Trk62生產(chǎn)的單克隆抗體。用于本發(fā)明的第二單克隆抗體包括能特異性識別人TRACP 5b失活片段的單克隆抗體，具體地，它幾乎不與活性人TRACP 5b反應，并不與衍生自紅細胞、血小板、中性白細胞或前列腺和馬鈴薯ACP的酸性磷酸酶交叉反應。其例子是通過由本發(fā)明人建立的雜交瘤Trk49生產(chǎn)的單克隆抗體。
具體地，為了與活性酶特異性結合，本發(fā)明中使用的第一抗體優(yōu)選地是對活性人TRACP 5b比對失活的人TRACP 5b片段具有更高的親和性的抗體。特別優(yōu)選的例子是具有對活性人TRACP 5b的結合常數(shù)大于第二抗體的抗體。作為第二抗體，適當?shù)氖蔷哂袑κЩ畹腡RACP 5b片段的結合常數(shù)大于對第一抗體的人活性TRACP 5b的結合常數(shù)的抗體。作為第一抗體，舉例說明了由本發(fā)明人建立的雜交瘤Trk62生產(chǎn)的單克隆抗體。作為第二抗體，舉例說明了由本發(fā)明人建立的雜交瘤Trk49生產(chǎn)的單克隆抗體。上述雜交瘤Trk49和Trk62保藏于如下單位，即專利生物保藏中心(Patented Organism Deposition Center)(IPOD)，產(chǎn)業(yè)技術綜合研究所(獨立行政法人)，Chuo-dairoku，Higashi 1-1-1，Tsukuba City，Ibaraki Prefecture，日本305-8566雜交瘤Trk49于2002年11月27日保藏保藏號IPOD FERM BP-8249，雜交瘤Trk62于2002年2月14日保藏為保藏號IPOD FERM BP-7890。
上述各個雜交瘤在通常用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，例如α-MEM、RPMI1640、ASF、S-克隆等，且單克隆抗體可從培養(yǎng)基上清回收。如下也是可行的事先用降植烷處理裸鼠，(雜交瘤是從裸鼠衍生的)后，細胞經(jīng)腹膜內(nèi)注射到動物體內(nèi)引起腹水累積，然后從腹水中回收單克隆抗體。
關于從上述上清液或腹水回收單克隆抗體的方法，可采用常規(guī)方法。這里舉例說明了用硫酸銨、硫酸鈉等鹽析、層析、離子交換層析、和使用蛋白A的親和層析。
通過使用由上述方法純化的本發(fā)明的單克隆抗體，可精確測定血清樣品中TRACP 5b。下面闡述本發(fā)明的免疫測定方法。
例如，如下可實施本發(fā)明的免疫測定方法。首先，第一抗體和第二抗體吸附在不溶的固體支持物例如平板上，除上述吸附步驟外，該免疫測定方法可通過與常規(guī)ELISA方法相同的步驟進行。用于測定的樣品首先加入具有吸附于其上的兩種類型抗體的支持物。在這種情況下，由于第一抗體和第二抗體之間結合常數(shù)的差異，樣品中的競爭物質主要與吸附在支持物上的第二抗體發(fā)生抗原-抗體反應，然后樣品中的靶物質主要與吸附在支持物上的第一抗體有利地發(fā)生抗原-抗體反應。隨后，必要時洗滌固體支持物，然后測定附著在固體支持物上的靶物質的水平，如此可測定樣品中的靶物質。在這種情況下，當靶物質是完整酶例如TRACP 5b時，將與之相應的底物溶液例如pNPP(對硝基苯基磷酸)加入固體支持物進行酶反應，并測定與固體平板結合的靶物質的水平，如此可精確測定樣品中的靶物質。
本發(fā)明中，吸附第一抗體的載體可以是不溶的固體支持物，而第二抗體可吸附于在液體中可分散的載體上，例如乳膠或可溶解。在這種情況下，靶物質可如下測定。首先，在液體中可分散的載體，例如乳膠用第二抗體敏化或將第二抗體溶解。另一方面，將第一抗體吸附在固體支持物上。然后，將含有這樣處理的第二抗體的溶液和用于測定的樣品加入固體支持物，如此樣品中的競爭物質主要與第二抗體發(fā)生抗原-抗體反應，而靶物質主要與第一抗體發(fā)生抗原-抗體反應。隨后，必要時洗滌固體支持物，然后測定附著在固體支持物上的靶物質的水平，如此可測定樣品中的靶物質。在這種情況下，當靶物質是完整酶如TRACP 5b時，將與之相應的底物溶液例如pNPP(對硝基苯基磷酸)加入固體支持物以測定附著在固體支持物上的靶物質，這樣可精確測定樣品中的靶物質。
如上文所闡明的，吸附第一抗體的載體通常是不溶的固體支持物。第二抗體在吸附于不溶的固體支持物上或分散于包含乳膠等的溶液中后使用，或溶解。
不溶的固體支持物沒有限制，只要它是在例如ELISA的固相免疫測定方法中使用的固體支持物。不溶的固體支持物包括，例如，用聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯等制成的固體支持物。通過物理結合、化學鍵合或親和，根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體(抗體)直接或間接地與上述任何公知的固體支持物結合。用于敏化的抗體的量常常在1ng-100mg/ml的范圍內(nèi)。用于測定人TRACP 5b的樣品加入通過物理結合、化學鍵合或親和結合在固體支持物上的單克隆抗體(抗體)進行反應。反應一定時間后，洗滌固體支持物并加入產(chǎn)色底物進行反應。關于底物，可使用已知的底物例如pNPP。
作為可分散于液體中、第二抗體吸附于其上的載體，實例有乳膠顆粒、磁性顆粒和脂質顆粒。還可使用通過將第二抗體與化學合成聚合物、天然聚合物(例如葡聚糖)等鍵合并將這樣處理的聚合物分散于溶液中獲得的分散體。在這種情況下，測定固體平板上的靶物質可通過將能夠與競爭物質結合的第二抗體加入ELISA方法中的緩沖液試劑而方便地進行。靶物質的測定可通過第二抗體與固相載體鍵合并使這樣處理的第二抗體與吸附于固體平板上的第一抗體競爭而方便地進行。此外，靶物質的測定可通過第二抗體與化學合成聚合物、天然聚合物(例如葡聚糖)等鍵合，并將這樣處理的抗體加入緩沖液試劑而方便地進行。
實施本發(fā)明免疫測定方法的試劑盒包括兩種類型的抗體，即上述第一抗體和第二抗體。如上所述，如果需要，這些抗體可吸附在不溶的固體支持物或分散于液體中的載體(例如乳膠)上。如果需要，該試劑盒可進一步含有用于測定與抗體結合的靶物質的試劑。
關于本發(fā)明，如后面實施例1所詳細描述的，多種血清中的TRACP 5b片段使用分別由上述雜交瘤Trk49和Trk62產(chǎn)生的單克隆抗體Trk49和Trk62，通過蛋白質芯片技術進行研究。結果證實在嬰兒或骨質疏松癥患者的血清中發(fā)現(xiàn)分子量約為5580Da、5795Da、6860Da或7075Da的TRACP 5b片段，其中骨吸收活躍地進行。因此，發(fā)現(xiàn)這些TRACP 5b片段可用做診斷骨疾病(例如骨吸收活躍進行的骨疾病)的標志分子。因此，可通過檢測取自患者的樣品(例如血清、血漿或血液)中的這些標志分子，或測量這些標志分子的量診斷骨疾病。
可采用目前已知的所有方法檢測或定量標志分子。所述方法包括，例如，質譜分析法、免疫測定法、電泳法、液相層析法和氣相層析法。對于質譜分析法，舉例說明了使用激光解析/電離時間飛行質譜儀(LDI-TOF MS)的方法。關于激光解析/電離時間飛行質譜儀，舉例說明了表面增強的激光解析/電離時間飛行質譜儀(SELDI-TOF MS法)和基質-輔助的激光解析/電離時間飛行質譜儀(MALDI-TOF MS法)。例如，當采用SELDI-TOF MS方法時，可使用由Ciphergen Biosystems，Inc開發(fā)的蛋白質·生物·系統(tǒng)·II·質譜儀(Ciphergen Biosystems，Inc)。該儀器以包含SELDI(表面增強的激光解析離子化)和飛行時間質譜儀組合的蛋白質芯片技術為基準。這種儀器的詳細資料公開于國際專利申請WO 01/25791A2、JP-A-2001-281222等。通常，在SELDI-TOFMS方法中，樣品被預處理，吸附于芯片上，然后裝載在SELDI-TOF MS質譜儀上。當樣品是血清時，優(yōu)選地從系統(tǒng)中除去清蛋白，方法是使用清蛋白吸附劑或用緩沖液清洗系統(tǒng)直到芯片由于離子交換導致的清蛋白所帶電荷停止。這種方法中使用的蛋白質芯片沒有具體限制，只要它可吸附上述標志分子。作為蛋白質芯片，舉例的芯片(也稱為化學芯片)，其中具有蛋白質親和性的官能團，其經(jīng)修飾產(chǎn)生疏水性、離子交換特性等，并且芯片(生化芯片)具有固定于其上的感興趣的蛋白質的抗體。
關于另一種質譜分析法，舉例說明了使用ESI方法(電噴射離子化)的質譜分析。在使用ESI方法的情況下，將經(jīng)預處理(例如蛋白酶處理)的樣品裝載到與分離單元(例如高效液相層析)直接連接的質譜儀上常常是優(yōu)選的。作為免疫測定方法，舉例說明了一種方法，其中通過制備標志分子的多克隆或單克隆抗體測定以前已知的蛋白質。這種免疫測定方法包括酶免疫測定法(EIA法)、免疫比濁測定法(TIA法)、乳膠免疫-凝集法(LATEX法)、電化學發(fā)光法、熒光法等。免疫層析法和使用試紙的方法也是有效的。通常，所有這些方法對本領域熟練的技術人員都是已知的，并且這些通常已知的方法可為他們所采用。
除上述方法外，舉例說明了電泳法、液相色譜法(LC)、氣相色譜法(GC)等。這些方法對本領域熟練的技術人員通常也是已知的，并可采用這些通常已知的方法進行測定。
本發(fā)明參考如下優(yōu)選的實施例更具體地舉例說明，這并不意味著限制本發(fā)明的范圍。
實施例1(1)選擇和制備用于制備單克隆抗體的抗原制備衍生自人破骨細胞的TRACP 5b用做制備抗-人TRACP單克隆抗體的抗原。下面描述一種純化方法。
得到同意后，通過外科手術切除的130g人股骨頭冷凍于液氮中，用錘子壓碎，然后懸浮于含有蛋白酶抑制劑的200mL緩沖液中(50mMTris-HCl、0.3M KCl、1mM PMSF、1mM EDTA·2Na，0.1％Triton X-100，0.02％NaN3、1單位/ml抑酶肽，pH7.5)，然后在超聲勻漿機中勻漿。勻漿4℃攪拌過夜，并在10,000rpm離心20分鐘，上清液對10mM Tris緩沖液(pH8.2)透析。此后，透析液應用于CM-瓊脂糖凝膠柱(Φ40mm×40cm)(SIGMA)，吸附的蛋白質用上述含有NaCl的相同的Tris緩沖液洗脫，以線性梯度增加NaCl濃度(0-0.5M NaCl)。用底物對硝基苯磷酸測定酒石酸抗性酸性磷酸酶活性，合并含有高水平活性的部分。將這樣獲得的溶液濃縮，然后對含有0.7M NaCl的20mM Tris緩沖液(pH7.2)透析，透析液應用于Superdex 200株(Φ16mm×60cm)(AmershamPharmacia Biotech)。以上述相同的方式，測定通過洗提獲得的部分中酒石酸抗性酸性磷酸酶活性，合并包含活性的部分。這樣獲得的溶液用20mM Tris緩沖液(pH7.2)稀釋2倍，應用于HiTrap Heparin HP柱(5mL)(Amersham Pharmacia Biotech)，吸附的蛋白質用上述含有NaCl的相同的20mM Tris緩沖液(pH7.4)洗脫，同時以線性梯度提高NaCl濃度(0.35-1M NaCl)。合并含有高水平的酒石酸抗性酸性磷酸酶活性的部分，然后濃縮獲得0.4mg衍生自破骨細胞的純化的酸性磷酸酶。
用A280確定蛋白質的量。對于純化，進行SDS-PAGE(TIFCO)，隨后銀染色。結果，純度通過在約35,000分子量處出現(xiàn)單帶得以確定。對應于單帶的酶被認為是純化的TRACP 5b，并被用做免疫抗原。
(2)免疫衍生自破骨細胞的純化的酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP 5b)用50mM檸檬酸緩沖液(pH5.5)稀釋到濃度250g/ml，25μg(100μl)稀釋液與100μl的弗氏完全佐劑(WAKO)充分混合直到實現(xiàn)乳化。這樣制備的懸浮液腹膜內(nèi)給予用二乙醚麻醉的6周齡的Balb/c雌性小鼠(Nippon Clear Co.，Ltd.)。兩周后，相同量的上述TRACP 5b(25μg/ml)與弗氏不完全佐劑(WAKO)混合。通過與弗氏完全佐劑的情況完全相同的操作，實現(xiàn)乳化作用以獲得懸浮液，并用懸浮液敏化小鼠。這樣處置2周后，進行與上述相同的步驟。對于第四次免疫，即最終免疫，制備用50mM檸檬酸緩沖液(pH5.5)稀釋的TRACP 5b(25μg/ml)，然后通過注射尾靜脈給予小鼠。
(3)建立雜交瘤最終免疫后3天，在用二乙醚麻醉的情況下，經(jīng)外科手術從用TRACP5b敏化的小鼠除去脾，在無菌條件下將它分散于準備的脾細胞中。根據(jù)Kohller和Milstein的方法進行融合(Nature，256，495，1975)通過使用聚(乙二醇)(PEG4000)(MERK)將脾細胞與骨髓瘤細胞P3-X63-Ag8-U1(P3U1)融合。關于融合比，脾細胞的數(shù)量為8×107，而骨髓瘤細胞P3-X63-Ag8-U1(P3U1)的數(shù)量為2×107。也就是，脾細胞與骨髓瘤細胞的融合比為4∶1。融合細胞分散于10％FCS(INVITROGEN)α-MEM(IRVINE)HAT)(Cosmo Bio Co.，Ltd)培養(yǎng)基中，接種于96-孔微量滴定培養(yǎng)板(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)，然后在37℃和5％CO2的條件下培養(yǎng)。
(4)篩選約2周后，證實并篩選生長的集落。進行篩選的方法描述如下。
為了產(chǎn)生用于篩選的平板，在上述(1)項中純化的TRACP 5b溶解于50mM檸檬酸緩沖液中，并以0.5μg/100μl/孔的量加到96-孔平板(Nunc)中。使平板4℃靜置兩夜，然后用含有0.05％Tween20的Tris緩沖液洗滌三次。各個孔中加入200μl 1.5％BSA溶液以抑制非特異性反應，使平板4℃靜置過夜。這樣制得的平板用含0.05％Tween20的Tris緩沖液洗滌3次后，100μl培養(yǎng)上清在各個孔中反應，并進一步洗滌平板。然后，加入一種第二抗體(HRP-標記的抗-小鼠免疫球蛋白抗體(Zymed))進行反應。洗滌后，檸檬酸中100μl 3mg/ml的鄰苯二胺產(chǎn)色溶液(OPD)(Nakalai)，HRP的產(chǎn)色底物，加入各個孔在一定時間內(nèi)引起著色。然后，100μl 1N的硫酸作為終止溶液加入各個孔，并在492nm測定波長處測定吸光度。通過上述步驟發(fā)現(xiàn)呈陽性的克隆通過有限稀釋法再克隆，這樣獲得的上清再檢驗。
(5)抗體的確定具有純化TRACP 5b的克隆Trk49和Trk62的反應性通過ELISA確定，以發(fā)現(xiàn)盡管它們親和力不同，克隆Trk49和Trk62與具有高度敏感性的平板反應。結果，選擇克隆Trk49和Trk62作為識別TRACP 5b的克隆。由這些克隆產(chǎn)生的抗體使用單克隆抗體分類試劑盒(AmershamPharmacia Biotech)測定，獲得的結果顯示于下表1中。
表1克隆的特征類別 輕鏈克隆Trk49 IgG1 K克隆Trk62 IgG1 K(6)制備和純化單克隆抗體10周齡的Balb/c雌性小鼠(Nippon Clear Co.，Ltd.)給予0.5ml降植烷(Aldrich)兩周后，腹膜內(nèi)給予1×107個上述第(5)項中獲得的各個雜交瘤Trk49和Trk62的細胞。約兩周后，小鼠腹腔內(nèi)累積的腹水在二乙醚麻醉的情況下手術收集。通過使用逐步稀釋為樣品的腹水并通過上述第(4)項中為了篩選采用的ELISA法證實的結果，發(fā)現(xiàn)腹水含有高濃度單克隆抗體。該腹水用40％的硫酸銨處理并對PBS透析，然后單克隆抗體使用蛋白質G柱(Amersham Pharmacia Biotech)純化并通過SDS-PAGE證實。結果，在兩種單克隆抗體Trk49和Trk62的情況下，當抗體處于非還原狀態(tài)時，在約150,000分子量處證實具有單帶，當抗體用巰基乙醇還原時，在約50,000和25,000分子量處證實具有兩個帶。每只小鼠中各個純化的抗體Trk49和Trk62的量約為15mg或更多，也就是說，它對于工業(yè)利用是足夠的。
(7)特異性分析為了研究單克隆抗體Trk49和Trk62的特異性，使用各種同工型(TRACP 5b、紅細胞、血小板、PAP(SIGMA)，和馬鈴薯ACP(SIGMA))進行下列試驗。測定方法簡要描述如下。
使用蛋白質G純化的各個單克隆抗體以2μg/孔的量加入固體平板中(Nunc)，使該平板4℃靜置兩天。該平板用20mM Tris(pH7.0)洗滌3次，洗滌液含有0.05％Tween20，然后將200μL 1.5％BSA Tris(pH7.0)加入各個孔中，隨后4℃下過夜封閉。這樣產(chǎn)生的平板用與上述相同的洗滌液洗滌一次，將各種同工型的酶活都調整到10IU/L，并將100μl這樣獲得的各個溶液加入抗體-附著平板的各個孔中。室溫下反應進行2小時。反應完成后，平板用與上述相同的洗滌液洗滌3次，加入100μl酸性磷酸酶的底物，反應在37℃進行1小時。各個樣品中酶的水平從由抗體捕獲的酶引起的底物著色確定。加入50μl反應-終止溶液后，在405nm光學波長處進行測定。
結果，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體Trk49和Trk62具有極高的特異性，因為它們僅與TRACP 5b反應，不具有與其它同工型的交叉反應性。
(8)利用SELDI法證實片段最近幾年，包括表面增強激光解析離子化(SELDI)和飛行時間質譜儀組合的蛋白質碎片技術已由Ciphergen Biosystems Inc.，USA開發(fā)，并已開始臨床應用，例如，用于檢測新的腫瘤標記物。本發(fā)明人試圖通過使用所述技術和利用由建立的雜交瘤Trk49和Trk62產(chǎn)生的單克隆抗體在實踐中捕獲血清中的TRACP 5b片段。
1)使用PS20芯片的試驗首先，本發(fā)明人通過使用PS20蛋白質芯片陣列(Protein ChipArrays)(Ciphergen Biosystems，Inc)，在血清中搜索與抗體Trk49和Trk62反應的TRACP 5b或其片段。該PS20芯片指抗體-結合芯片并具有下列特征樣品中的反應物質首先與結合在金屬表面上的抗體結合，并且與抗體反應的物質用激光從抗體上解離并于真空中飛行，由此測定該物質的分子量。蛋白質芯片陣列的試驗操作方法簡要描述如下。首先，培養(yǎng)適應于合成培養(yǎng)基S-克隆的雜交瘤Trk49和Trk62(SankoJunyaku Co.，Ltd.)，由它們產(chǎn)生的各個抗體使用蛋白質G柱純化(Amersham Pharmacia)。各個抗體的濃度調整到500μg/mL，2μl這樣獲得的溶液加入PS20芯片。室溫下反應1小時后，加入5μl的阻斷緩沖液(1M乙醇胺PBS pH8.0)(WAKO)，反應在室溫下進行10分鐘。阻斷后，芯片用8mL的洗滌緩沖液(0.5％Triton 100 PBS)室溫洗滌5分鐘。這樣重復洗滌兩次，然后該芯片用PBS輕柔漂洗。輕輕擦去反應斑點附近的區(qū)域，并將4個樣品中的每一個取3μl加入芯片，這4個樣品即健康志愿者的血清、12歲或以下幼兒的血清、激素替代治療前骨質疏松患者的血清和激素替代治療后骨質疏松患者的血清。反應完成后，樣品用Kimwipe(Jujo Kimberley)吸收，芯片用8mL洗滌緩沖液(0.5％Triton 100 PBS)室溫洗滌5分鐘。這樣重復洗滌兩次，然后該芯片用PBS輕柔漂洗。用Kimwipe(Jujo Kimberley)從芯片上擦去水滴，且0.5μl的飽和芥子酸(Ciphergen Biosystems Inc)/50％乙腈(Wako)/0.5％TFA(Wako)溶液加入兩次。這樣產(chǎn)生的蛋白質芯片陣列用Protein·Biology·System II質譜儀解讀(Ciphergen Biosystems，Inc)。
2)使用PS20芯片進行試驗的結果測定數(shù)據(jù)顯示于圖1和圖2中。在此數(shù)據(jù)格式中，橫坐標軸指從PS20蛋白質芯片分離的各個樣品中蛋白質的分子量，縱坐標軸指反應在上述分子量處達到檢波器的被分析物量的峰高。在這種情況下，縱坐標軸的單位為主觀單位(AU)。在上述試驗中，幼兒血清以及激素替代治療前骨質疏松患者的血清是在進程中骨吸收活躍的血清。作為試驗結果，僅當使用抗體Trk49進行實驗，在上述兩個試驗組的情況下觀察到5795Da附近的峰和6860Da附近的峰(圖1，(2)和圖2，(5))。在進程中骨吸收溫和的成人血清的情況下沒有觀察到這些峰(圖1，(1)和(3))。在顯示高峰值的幼兒血清的情況下，除所述高峰外還可證實近5580Da的峰和近7075Da的峰(圖1，(2))。經(jīng)激素替代療法治療后，骨質疏松患者近5795Da和近6860Da的峰消失(圖2，(6))。詞語“近”用于表達對應于各個峰的分子量的原因是通常具有20或以下的測定誤差。此外，當使用抗體Trk62進行實驗時，進程中骨吸收活躍的血清中沒有發(fā)現(xiàn)特異性片段(圖1，(3)和(4))。作為實驗結果，本發(fā)明人成功地發(fā)現(xiàn)幾種類型的相當新的TRACP 5b片段，它們以前是未知的。實際上，該片段是在約5795Da、約5580Da、約6860Da和約7075Da檢測到的蛋白質或其降解產(chǎn)物。這些片段是完全新的物質并是能反應骨吸收或發(fā)病的標記物。結合片段的量與各個抗體的結合常數(shù)緊密相關。應對抗體Trk62的反應性特別重視?？贵wTrk62幾乎不與結合抗體Trk49的片段反應，已證明抗體Trk62對活性酶具有高度的特異性。相反，抗體Trk49與片段反應得很好。從這些事實推測用于本發(fā)明的兩種類型的單克隆抗體，即抗體Trk49和Trk62，分別對片段和酶具有高度的特異性，因此本發(fā)明中，TRACP 5b可使用兩種抗體通過酶免疫測定法高度敏感地特異性測定。
(9)測量單克隆抗體的結合常數(shù)進行下列試驗用于確定各個抗原的結合常數(shù)。關于確定方法，根據(jù)“蛋白質·酶基礎實驗方法(Protein·Enzyme FundamentalExperimental Methods)”，Nankohdo Co.，Ltd.進行測定。制備兩種類型抗原溶液，即(A)純化的TRACP 5b和(B)通過使用Trk49親和柱純化的TRACP 5b片段(TRACP 5b片段的混合物，它至少含有分別具有約5580Da、5795Da、6860Da和7075Da分子量的TRACP 5b片段)，以獲得濃度為5μg/mL 20mM的檸檬酸緩沖液。96-孔平板(Nunc)的各個孔用50μL的各個抗原溶液敏化。4℃靜置過夜后，平板的各孔用200μL含有0.05％Tween20的20mM Tris緩沖液洗滌3次，并將100μL封閉劑(20mM Tris緩沖液含有1.5％BSA和10％蔗糖)加入各孔，隨后4℃靜置過夜。平板的各孔再次用200μL含有0.05％Tween20的20mMTris緩沖液洗滌3次，通過分步稀釋各個抗體為12個濃度(0、0.1、0.15、0.20、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.75、1.0μg/mL)獲得的20μL的各個抗體溶液加入各個孔中。反應在各個條件下進行2小時(i)37℃和(ii)4℃。經(jīng)這樣初次反應后，平板的各孔用200μL含有0.05％Tween20的20mM Tris緩沖液洗滌3次，并將50μL 1000倍稀釋的第二抗體(抗-小鼠IgG-HRP標記抗體Zymed)加入各孔。反應在37℃進行2小時，平板的各孔用200μL含有0.05％Tween20的20mM Tris緩沖液洗滌3次。然后，100μL 3mg/mL的OPD溶液加入各孔以引起著色。用100μL 0.1N的硫酸溶液終止著色，隨后在492nm處比色。
從這樣獲得的結果，通過條件(i)下每1M濃度的A492，首先確定結合的單克隆抗體的量。例如，由于當TRACP 5b平板上抗體的量是0.05μg時A492為0.250，當抗體的分子量取做146,000時，結合的抗體的量可如下確定0.25/{0.05/(0.146×10-9)}＝0.731×10-9(1)接著，條件(ii)下各個抗體濃度結合的抗體的濃度(PL)從在條件(i)下獲得的值確定。
＝條件(ii)下的A492/每1M濃度的A490(2)然后，從加入的抗體濃度確定游離抗體的濃度[PF]。
＝加入的抗體濃度-[PL] (3)[PL]/[PF]對結合抗體的濃度做曲線圖，通過曲線的斜率(-nK)確定結合常數(shù)。
Ka＝-斜率/n作為通過上述方法測定的結果發(fā)現(xiàn)的兩種單克隆抗體Trk49和Trk62的結合常數(shù)(ka)值顯示于下表2中。
表2單克隆抗體的結合常數(shù)單克隆抗體結合常數(shù)Trk49 (TRACP 5b) Ka＝0.94×109(TRACP 5b片段) Ka＝5.25×109Trk62 (TRACP 5b) Ka＝3.73×109(TRACP 5b片段) Ka＝0.69×109當領會了上述反應系統(tǒng)中結果的含義時，發(fā)現(xiàn)反應活性，即親和性如下Trk49與片段的反應性>Trk62與酶的反應性>Trk492與酶的反應性>Trk62與片段的反應性因此，發(fā)現(xiàn)如下事實由于單克隆抗體Trk49與TRACP 5b片段的反應性高于與TRACP 5b本身的反應性，而且，當與單克隆抗體Trk62對TRACP 5b的結合常數(shù)相比時該反應性更高，因此反應系統(tǒng)中單克隆抗體Trk49首先選擇性地與TRACP 5b片段結合，單克隆抗體Trk62可在競爭片段的量減少的反應系統(tǒng)中與TRACP 5b更有利地結合。該結果支持了使用蛋白質芯片的試驗的結果。
(10)通過ELISA進行測定的試驗因此，生產(chǎn)下列5中類型的平板Trk49 1μg/孔/100μL、Trk49 2μg/孔/100μL、Trk62 1μg/孔/100μL、Trk62 2μg/孔/100μL、和Trk49 1μg+Trk62 1μg)/孔/100μL。除如下改變外敏化抗體溶液的體積100μL，封閉液的體積100μL、樣品的體積100μL，生產(chǎn)平板的方法與上述第(7)項中測定單克隆抗體的特異性的生產(chǎn)方法相同。關于初次反應，具有高的TRACP 5b水平的合并血清(包含至少分別具有約5580Da、5795Da、6860Da或7075Da的分子量的TRACP 5b片段)作為樣品加入吸附在平板上的抗體，抗原-抗體反應在室溫下震蕩進行。然后，進行洗滌步驟，將100μL合成底物溶液加入各個孔中，37℃下進行1小時酶促反應。反應經(jīng)加入0.2N NaOH溶液而終止，隨后比色，借此測定酶活。獲得的結果顯示于圖3中。
基于它的結合常數(shù)，假定與酶具有低反應性，而與片段具有高反應性的抗體Trk49對酶具有低的親和力，因此對測定不具有必要的敏感性。另一方面，基于根據(jù)抗體Trk62的結合常數(shù)，推測與酶具有高反應性的抗體Trk62顯示良好的線性關系。此外，在平板具有抗體Trk49和抗體Trk62混合物的情況下，獲得更長的線性和改進的敏感性。由于即使當各個抗體的量從1μg增加到2μg時，線性和敏感性幾乎沒有改善，推測作為反應中涉及的各個抗體的量，1μg/孔基本上足夠了。即，推測因為根據(jù)基于結合常數(shù)試驗的理論線性和敏感性得以提高，反應系統(tǒng)中抗體Trk49實質上優(yōu)勢性地與片段結合，然后抗體Trk62與完整酶結合。
(11)使用乳膠試劑的片段吸收方法使用已發(fā)現(xiàn)能夠實質上特異性吸收片段的單克隆抗體Trk49和單克隆Trk62作為對照，用這兩種單克隆抗體中的每一個敏化乳膠以制備乳膠試劑。乳膠試劑的制備如下進行。
將2mL 1％的乳膠懸浮液與2mL 0.1mg/mL的抗體Trk49和Trk62的各個溶液混合，獲得的混合物攪拌約1小時。離心后，沉淀懸浮于1％的BSA溶液中，并將懸浮液再攪拌約1小時。重新離心后，沉淀懸浮于PBS溶液中以獲得乳膠試劑。該乳膠試劑稀釋為8個濃度，即0.15％和從0.1％通過2倍稀釋(0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.00313和0.00156％)獲得7個濃度，共制備8種乳膠試劑。ELISA法中的操作闡述如下。
首先，取這些乳膠試劑中的每一個各50μL加入接種了抗體Trk62的平板的各個孔中(2μg/孔)。然后，將從得到其同意的患者獲得的具有高水平TRACP 5b(8U/ml)的100μL合并血清加入各孔，室溫下振動反應1小時。反應完成后，該平板用含0.05％Tween20的20mM Tris緩沖液(pH7.0)洗滌3次，并向其中加入合成底物溶液。37℃培養(yǎng)1小時后，50μL的反應終止溶液(0.2N NaOH溶液)加入各孔，隨后在405/490nm處測定。獲得的結果顯示于圖4中。在Trk62-敏化乳膠試劑添加實驗中，引起與平板上單克隆抗體的競爭，以致隨乳膠試劑濃度的增加酶著色下降。然而，在抗體Trk49的情況下，在添加0.1～0.15％乳膠試劑的試驗中獲得顯著提高的酶著色值。這一事實，例如，表明不僅用抗體同時敏化的平板，而且使用用于吸附的載體例如乳膠等的吸收方法對于競爭片段的吸收是有效的。此外，使用通過將抗體Trk49溶解于溶液中獲得的溶液代替用抗體Trk49敏化的乳膠也是有效的。
工業(yè)適用性如上文詳細闡述的，本發(fā)明的免疫測定法通過使用與靶物質具有高度反應性的第一抗體和與競爭物質例如靶物質的失活片段具有高度反應性的第二抗體的組合，使特異和精確測定待測靶物質例如活性酶成為可能，以避免反應系統(tǒng)中競爭物質的影響。
權利要求
1.一種通過使用兩種類型的抗體測定樣品中靶物質的免疫測定法，所述方法包括使用兩種類型的抗體，即具有如下特性的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對靶物質和競爭物質的親和性，(ii)第一抗體對靶物質的親和性高于對競爭物質的親和性，(iii)第二抗體對競爭物質的親和性高于對靶物質的親和性，和(iv)第二抗體對競爭物質的親和性高于第一抗體對靶物質的親和性，使樣品中的靶物質和競爭物質與吸附在載體上的第一抗體和第二抗體結合，然后測量結合的靶物質的水平以測定所述樣品中的靶物質。
2.根據(jù)權利要求1所述的免疫測定法，其中更進一步，第二抗體對靶物質的親和性高于第一抗體對競爭物質的親和性。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的免疫測定法，其中所述靶物質是完整酶并且測量結合的靶物質水平是測量所述完整酶的酶活。
4.根據(jù)權利要求3所述的免疫測定法，其中所述競爭物質是不具有所述酶活的物質。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的免疫測定法，其中所述競爭物質是酶降解產(chǎn)物。
6.根據(jù)權利要求3-5中任何一項所述的免疫測定法，其中所述完整酶是酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)。
7.根據(jù)權利要求1-6中任何一項所述的免疫測定法，其中所述載體是不溶性固體支持物。
8.根據(jù)權利要求1-7中任何一項所述的免疫測定法，其中吸附第一抗體的載體是固體支持物，而第二抗體吸附在分散于溶液中的載體上或被溶解。
9.一種通過使用兩種類型的抗體免疫測定樣品中的靶物質的試劑盒，其包括兩種類型的抗體，即具有如下特性的第一抗體和第二抗體(i)第一抗體具有對靶物質和競爭物質的親和性，(ii)第一抗體對靶物質的親和性高于對競爭物質的親和性，(iii)第二抗體對競爭物質的親和性高于對靶物質的親和性，和(iv)第二抗體對競爭物質的親和性高于第一抗體對靶物質的親和性。
10.根據(jù)權利要求9所述的試劑盒，其中所述第一抗體和第二抗體吸附在載體上。
11.根據(jù)權利要求9或10所述的試劑盒，其中所述第一抗體吸附在固體支持物上，第二抗體吸附在分散于溶液中的載體上或被溶解。
12.一種診斷骨疾病的標志分子，包括分子量約為5580Da、5795Da、6860Da或7075Da的酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP 5b)的片段。
全文摘要
使用兩種類型的抗體，即對靶物質的親和性高于對競爭物質的親和性的第一抗體和對競爭物質的親和性高于對靶物質的親和性的第二抗體，樣品用這兩種抗體處理。然后，樣品中的競爭物質首先與第二抗體結合，這樣樣品中靶物質對競爭物質的比率擴大。結果，靶物質變得易于與第一抗體結合，依次地，與僅使用第一抗體的情況相比靶物質的反應性增加。因此，可精確測定樣品中的靶物質，同時避免包含于樣品中的競爭物質的影響。
文檔編號G01N33/543GK1732385SQ20038010755
公開日2006年2月8日 申請日期2003年12月24日 優(yōu)先權日2002年12月26日
發(fā)明者大橋建也, 三浦俊英, 五十嵐吉彥, 野村文夫, 朝長毅, 片山勝博 申請人:日本紡績株式會社