一種用于檢測樣品中重金屬離子砷含量的免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測重金屬離子神離子的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] ±壤和農(nóng)產(chǎn)品中的重金屬與人類健康密切相關(guān)。重金屬污染主要指生物毒性顯著 地隸、館、領(lǐng)、鉛W及類金屬神，還包括具有毒性的重金屬銅、鉆、媒、錫等污染物。隨 著城市的擴大和大規(guī)模工業(yè)的發(fā)展，大最重金屬進入環(huán)境后，即使?jié)舛群艿停部赡茉斐晌?害，通過飲用水，或者通過生物富集W及食物鏈等方式最終威脅入體健康。承金屬污染不同 于其他類型污染，具有隱蔽性、長期性和不可逆轉(zhuǎn)性等特點。
[0003] 神的污染，主要來自排放的廢水。焦炭、含神黃鐵礦床、及其它金屬礦場的沖出物； 玻璃器皿制造、木材防腐劑、陶瓷制造業(yè)、冶金工業(yè)、制革廠、紡織業(yè)、染料廠、煉油工業(yè)、稀 ±金屬工業(yè)等都可能排放出含神廢水。若此含神廢水流入河流中或湖泊中，不僅危害到水 中動植物，亦可能滲透到±壤中，而危害到陸生的動植物。工業(yè)上的神污染，也是造成人體 神中毒的禍首。因此，神離子污染已對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅，建市快速、簡便、敏感、特 異、經(jīng)濟、篩檢量大的離子鋒離子免疫檢測技術(shù)，對了減少環(huán)境污染、提高食品質(zhì)量、保障食 品安全具有重要意義。
[0004] 所W，痕量重金屬的定量分折在食品和環(huán)境檢測等方而都是非常重要的。傳統(tǒng)的 重金屬離子檢測法如無火焰原子吸收光譜法、火焰原子吸收光譜法、電感禪合等離子體質(zhì) 譜濁、伏安法和離了色譜濁，W及電熱原了化原了吸收光譜法等，偷測必須在只各大型分析 儀器的重點實驗室內(nèi)進行，無法用于現(xiàn)場檢測，且受到費用高、處理量有限和檢測時間長等 限制，郁小利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，難W適必環(huán)境及市場產(chǎn)品的現(xiàn)場抽查及產(chǎn)品進口快速 通關(guān)的要求；免疫學檢測方法只有快速、廉價、靈敏和特異性強的優(yōu)點，可同時完成高通量 樣品的檢測，建立免疫分析法檢測神離子是生產(chǎn)及經(jīng)濟發(fā)展的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的：針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足和缺陷，制備出抗神離子莖合物的高親 和力、特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，W此為基礎(chǔ)提供一種用于檢測神離子含量的酶 聯(lián)免疫試劑盒，能夠快速、簡便、敏感、特異的檢測食品、茶葉、飼料、飲料、±壤、水、動物組 織等樣品中的神離子的含量。
[0006] 所述的檢測神離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括96孔或48孔酶標板、最佳工作濃度的 sn3++mAb或pAb、最佳工作濃度的RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP、底物顯色劑A、底物顯色劑B、 As3+-DTPA-0VA或As3+-DTPA-BSA包被并封閉好的酶標板、終止液，sn 3+莖合物配置的標準品 稀釋液1~9,洗液（PBST)。
[0007] 所述的檢測神離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，用眼觀或酶標儀獲取結(jié)果，并根據(jù)結(jié)果繪 制標準曲線，添加回歸方程式，根據(jù)回歸方程式分析計算所檢測樣品中的神離子含量，對神 離子進行痕量分析。
[0008] 所述的檢測神離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，所用的神離子標準品為神離子與邸ΤΑ的 莖合物，莖合物中神離子含量采用石墨爐原子吸收光譜法檢測獲得莖合物半抗原中Sn的 含量。
[0009] 所述單克隆抗體或多克隆抗體的制備方法為： A1、雙功能整合劑的選擇：對氨基苯基-二己Η胺五己酸（P-N肥-Bn-DTPA)，雙功能莖 合劑1- (4-異硫氯根苯基）-己二胺四己酸（ITCB巧，2- (4-異硫氯根苯基-1，4, 7,10-四氮 環(huán)十二焼四鹽酸鹽（P-SCN-Bn-DOTA)，然后在堿性或酸性環(huán)境下，將離子神離子莖合在雙功 能莖合劑上； A2、sn3M)TPA-載體蛋白人工抗原的合成；分別稱取雞卵清白蛋白（0VA)，牛血清白蛋 白度SA)和血藍蛋白化LH) 20mg溶于1血濃度為10mmoL/L，pH9. 0的N-2-居己基脈嗦-N-己 礙酸緩沖液（皿巧中形成KLH、BSA、OVA溶液。稱取lOmg金屬藝合劑對氨基苯基-二己 Η胺五己酸（P-N肥-Bn-DTPA)溶于1血二甲基亞諷（DMS0)中形成金屬藝合劑溶液；分別 取lOOuL金屬藝合劑溶液輕輕攬拌下逐滴滴加到0. 5mLKLH和BSA溶液中，用lOmol/LKOH 調(diào)節(jié)抑至9. 0,室溫下反應(yīng)2地。制備出神離子人工抗原sn3M)TPA-0VA，sn3M)TPA-BSA， sn3+-DTPA-KLH，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0010] A3、神離子單克隆抗體和多克隆抗體的獲得；用sn3M)TPA-BSA，sn3+-DTPA-KLH免 疫6周雌性BALB/C小鼠5只，劑量為25 ug/0. 2mL/只，背部皮下分點注射。采用細胞融合 技術(shù)制備抗神離子莖合物的單克隆抗體。無菌條件下取免疫鼠脾臟細胞，在聚己二醇PEG-1 500作用下與NS。骨髓瘤細胞進行融合；用間接化I SA法測定細胞上清抗體效價，用阻斷 ELI SA法測定上清抗體抑制率，進行陽性孔篩選，用經(jīng)GF-AAS檢測獲得sn3+-藝合劑做神 離子標準液，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行亞克隆和擴大培養(yǎng)、通過鑒定， 獲得一株雜交瘤細胞株；之后采用體內(nèi)誘生腹水法制備sn3+mAb ; 多抗制備：用sn3M)TPA-BSA，sn3M)TPA-KLH人工抗原免疫新西蘭大白兔，免疫劑量為 50ug~100 ug/次，背部皮下分多點注射或足底注射；首免用弗氏完全佐劑乳化；加強免疫 用弗氏不完全佐劑乳化，連續(xù)免疫5次，每次間隔8周，最后一次免疫后10~15天，W ELISA 法測其定效價達到1〇5 W上時，采血并分離收集高免血清。W飽和硫酸倭鹽析法提取IgG抗 體，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?br>[0011] 本發(fā)明的檢測神離子酶聯(lián)免疫試劑盒具有下列各項優(yōu)點： ①特異性強，敏感性高。該檢測神離子酶聯(lián)免疫試劑盒W高親和力的單克隆抗體（mAb) 或多克隆抗體（pAb)為基礎(chǔ)制備而成。酶聯(lián)免疫試劑盒采用的是非均相間接競爭模式，其 基本原理是樣品中的sn3+與過量藝合劑藝合成可溶性的sn 3+-藝合劑復(fù)合物后，將其與已包 被于酶標板上的包被抗原sn3+-藝合劑-載體蛋白復(fù)合物共同競爭sn 3+mAb上有限的結(jié)合位 點，反應(yīng)達到平衡后洗脫多余的sn3+-藝合劑和sn3+mAb，然后與酶標二抗反應(yīng)，用酶及其底 物顯色系統(tǒng)顯示抗原抗體的結(jié)合情況，進而定量檢測sn3+在樣品中的含量。該試劑盒最低 檢測限為0. 248 ug/l，檢測范圍為3. 774~442. 39 ug/l，與其它金屬離子交叉反應(yīng)較小。
[0012] ②簡便、快速、時效性強。使用該檢測神離子酶聯(lián)免疫試劑盒，無需其它試劑和儀 器，可現(xiàn)場操作，只要按照該試劑盒說明書上操作步驟進行檢測，60分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié) 果，并根據(jù)結(jié)果可計算樣品中神離子含量。
[0013] ⑨結(jié)果顯示直觀、形象、準確。酶聯(lián)免疫試劑盒固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的 量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。顯色液和 底物不同顯示不同顏色，本試劑盒底物為過氧化脈，顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺（TMB)，終止液 為2mol/L的硫酸溶液，故顯示藍色，終止后顯色為黃色，肉眼可見。與所提供的標準檢測液 比較，顯色越深則待測物中神離子含量越低或不含，顯色越淡或不顯色者說明樣品中含有 待檢物，且含量越高，如有酶標儀可進行度數(shù)，度數(shù)后根據(jù)稀釋比例進行計算可得出神離子 的含量。
[0014] ④適用范圍廣，節(jié)省費用，便于推廣。使用酶聯(lián)免疫試劑盒，比用儀器分析的費用 大幅下降。另外，酶聯(lián)免疫試劑盒的適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業(yè)檢驗， 海關(guān)檢疫，衛(wèi)生檢疫，質(zhì)量監(jiān)測，加工企業(yè)和養(yǎng)殖場戶等，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前 景和明顯的經(jīng)濟、社會效益。
【附圖說明】
[0015] 圖1為檢測神離子酶聯(lián)免疫試劑盒的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0016] 一種用于檢測神離子酶聯(lián)免疫試劑盒，它包括檢測酶標板、用于檢測的試劑，其中 試劑包括樣品稀釋液，樣品提取液。重金屬離子免疫檢測的關(guān)鍵在于重金屬特異性單克隆 抗體的制備，重金屬特異性單克隆抗體制備的關(guān)鍵又在于重金屬免疫原。由于重金屬離子 帶有電荷，能與動物體內(nèi)生物分子發(fā)生強烈的不可逆的反應(yīng)，導(dǎo)致動物中毒。因此，可利用 特異性的雙功能莖合劑莖合重金屬離子，形成能被動物免疫系統(tǒng)識別的金屬一莖合劑的復(fù) 合物，但送些重金屬-莖合劑復(fù)合物是分子量低于IkD的半抗原，免疫原性低，不足W引起 免疫反應(yīng)，還需將之與載體蛋白偶聯(lián)，才能形成完整的免疫原。要制成神離子酶聯(lián)免疫試劑 盒，首先需要對重金屬離子神離子與雙功能莖合劑進行莖合反應(yīng)，制備神離子莖合物偶聯(lián) 載體蛋白，用于制各相應(yīng)的檢測抗體。
[0017] 本發(fā)明還包括食品、飼料、飲料、±壤、動物組織等樣品預(yù)處理方法。飼料、動物 組織±壤等固體樣品，研磨搗碎后稱取1. Og樣品，加入10血肥陽S緩沖液，攬拌30min， 300化/min離必5min，在上清液中加入30mg邸TA，并用化OH溶液調(diào)抑至6. 0,室溫反應(yīng) 過夜；市場購買的飲料、自來水等液體樣品，取lOmL樣品，加入30mg邸TA，用化0H溶液調(diào) 抑至6. 0,室溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)后待檢。
[0018] 本發(fā)明的檢測神離子酶聯(lián)免疫試劑盒，樣品處理簡單，適合于大量樣品的快速檢 測和篩選，具有高特異性、高靈敏度、高精確率等特點，最低檢測限