專利名稱：用于體外測(cè)定嬰兒配方食品的蛋白質(zhì)可消化性的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種量化嬰兒配方食品的蛋白質(zhì)可消化性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)對(duì)嬰兒配方食品樣品的總的和可溶性部分的氨基酸分布分析來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的可消化性，所述嬰兒配方食品樣品在體外經(jīng)過(guò)USP消化酶的消化。
背景技術(shù)：
嬰兒配方食品在商業(yè)上現(xiàn)有多種形式，包括即食食品、濃縮液體以及粉狀形式。嬰兒配方食品一般含有酪蛋白和/或乳清以確保喂養(yǎng)該配方食品的嬰兒吸收足夠量的氨基酸，尤其是對(duì)于適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)必需的氨基酸。測(cè)定食物蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的兩種因素是可消化性和生物有效度。一般地，這些配方食品包含比在人乳奶中所發(fā)現(xiàn)的水平更高水平的蛋白質(zhì)。用更高水平的蛋白質(zhì)制造嬰兒配方食品以解決假定的蛋白質(zhì)的較低的可消化性。
嬰兒配方食品的研究已經(jīng)顯示在這些配方食品的制造過(guò)程中所使用的方法具有營(yíng)養(yǎng)學(xué)的后果，如在配方食品中蛋白質(zhì)降低的可溶性和/或可消化性。例如，在延長(zhǎng)的時(shí)間階段上的熱處理已經(jīng)顯示降低蛋白質(zhì)的可消化性，所述時(shí)間用于生產(chǎn)濃縮液體和即食嬰兒配方食品。作為熱處理的結(jié)果，蛋白質(zhì)變性或聚結(jié)，有可能改變其可消化性。對(duì)高溫下的乳處理也已進(jìn)行了研究并已顯示增強(qiáng)了稱為Maillard反應(yīng)的氨基酸與糖類的反應(yīng)。這些反應(yīng)已顯示通過(guò)限制蛋白分解酶的易接近性降低了氨基酸的生物有效度。
體內(nèi)的蛋白質(zhì)消化是一個(gè)兩步的過(guò)程。第一步是氨基酸與預(yù)可消化性的酶胃蛋白酶相接觸。第二步包括胰酶的水解。由于蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物被快速地傳送入小腸并被其吸收，對(duì)體內(nèi)氨基酸有效性的評(píng)估是困難的。此外，可能存在內(nèi)源性蛋白質(zhì)并以不同于作為食物或以食品添加劑的形式吸收的蛋白質(zhì)的速度消化和吸收。因而，已經(jīng)發(fā)展了蛋白質(zhì)可消化性的體外分析。已通過(guò)酶水解比色分析(利用TNBS的水解的程度)和大小排阻色譜技術(shù)如高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行了嬰兒配方食品可消化性的評(píng)估。這些方法所提供的信息的準(zhǔn)確度和精確度被不可溶蛋白質(zhì)的存在和/或被分光光度和色譜干涉所證實(shí)。
已經(jīng)利用預(yù)可消化性酶胃蛋白酶和胰酶進(jìn)行了嬰兒配方食品的體外消化。在體外消化過(guò)程之后通過(guò)測(cè)量非蛋白氮(NPN)的升高水平來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的可消化性，所述體外消化過(guò)程由Kjeldahl分析進(jìn)行測(cè)定。但是，在這些研究中所用的酶未包括酶活性的標(biāo)準(zhǔn)化，因而在消化中所用的酶的活性可以變化很大。另外，用Kjeldahl法的氮分析在消化和未消化的蛋白質(zhì)的量化中缺乏特異性。消化的氨基酸的類型的特異性為配制包括嬰兒配方食品的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品、進(jìn)一步保證喂以該配方食品的嬰兒吸收和消化必需的氨基酸提供了更好的指導(dǎo)。
可消化性研究包括測(cè)定蛋白質(zhì)，如測(cè)定在消化過(guò)程中所用的胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性水平的分析。胃蛋白酶活性已經(jīng)通過(guò)三羧酶(TCA)可溶性產(chǎn)物的單位的方式進(jìn)行了測(cè)量。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性已經(jīng)通過(guò)特定氨基酸的水解速率進(jìn)行了測(cè)量。盡管測(cè)定所用酶的活性水平能夠提高這種分析的標(biāo)準(zhǔn)化，但增加的測(cè)量酶活性的步驟是繁瑣和費(fèi)時(shí)的。
需要一種利用具有標(biāo)準(zhǔn)化活性的酶的體外蛋白質(zhì)可消化性測(cè)定的方法。還需要這些方法的結(jié)果以提供在氨基酸可消化性中的特異性。
本發(fā)明提供一種測(cè)定蛋白質(zhì)可消化性的方法，同時(shí)提供在量化消化的和總的(消化的和未消化的)蛋白質(zhì)中的特異性。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種測(cè)定蛋白質(zhì)可消化性的方法，該方法包括以至少一種酶消化一種營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的樣品和一種試劑空白；終止消化過(guò)程；測(cè)定樣品和空白對(duì)照的多種氨基酸的總濃度；測(cè)定樣品和空白對(duì)照的總的色氨酸濃度；測(cè)定樣品和空白對(duì)照的多種氨基酸的可溶性濃度；測(cè)定樣品和空白對(duì)照的色氨酸的可溶性濃度；和計(jì)算可溶性氨基酸在消化的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的樣品中的百分率的步驟。
在另一實(shí)施方案中，該方法包括將每一種消化的樣品和空白對(duì)照分離成一個(gè)第一部分和一個(gè)第二部分；測(cè)定樣品的第一部分和空白對(duì)照的第一部分的多種氨基酸的總濃度；測(cè)定樣品的第一部分和空白對(duì)照的第一部分的總的色氨酸濃度；將樣品的第二部分和空白對(duì)照的第二部分各自分離成一個(gè)液相和一個(gè)固相；測(cè)定在液相中的多種氨基酸的可溶性濃度；和測(cè)定在液相中的色氨酸的可溶性濃度。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離步驟選自酸化、沉淀、離心、過(guò)濾和離心與過(guò)濾的組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算可溶性氨基酸的百分率的步驟包括下列步驟將樣品和空白對(duì)照的多種氨基酸的總濃度和色氨酸濃度相加；測(cè)定在樣品和空白對(duì)照之間在多種氨基酸的總濃度和色氨酸濃度上的差異；將在樣品和空白對(duì)照中的多種氨基酸和色氨酸濃度的可溶性濃度相加；測(cè)定在樣品和空白對(duì)照之間在多種氨基酸和色氨酸的可溶性濃度上的差異；將在可溶性濃度上的差異除以在總濃度上的差異以測(cè)定商；和以100乘以商的步驟。
在一個(gè)實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品為嬰兒配方食品。
在一個(gè)實(shí)施方案中，消化步驟使用一種或多種酶以模仿人胃腸道的環(huán)境。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶選自胃蛋白酶、肽酶、胰酶蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。
還在另一個(gè)實(shí)施方案中，消化樣品的步驟包括獲得營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的樣品；調(diào)節(jié)pH到大約4.5；加入胃蛋白酶；溫育樣品；提高pH到大約7.0；加入胰酶蛋白酶；和溫育樣品的步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，終止消化的步驟是將樣品浸在沸水浴中。
發(fā)明詳述可以根據(jù)本發(fā)明測(cè)定可消化性的蛋白質(zhì)可以以許多形式存在，包括但不限于，營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品、食品添加劑、藥物或其它產(chǎn)品。它們可以用于各種年齡，例如嬰兒、兒童或成人。在快速生長(zhǎng)的時(shí)期，如嬰兒期、兒童期和青春期使用它們可能有特定的價(jià)值?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明測(cè)定其可消化性的蛋白質(zhì)可以被摻入一種營(yíng)養(yǎng)性的“運(yùn)載體或載體”中，該載體或載體包括但不限于FDA的法定食品類別傳統(tǒng)食品、特殊食用用途的食品、食品添加劑和醫(yī)學(xué)食品。
營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)的適當(dāng)來(lái)源包括奶、大豆、大米、肉(例如，牛肉)、動(dòng)物和植物(例如，豌豆、馬鈴薯)、蛋(蛋白)、動(dòng)物膠和魚。適當(dāng)?shù)耐暾鞍踪|(zhì)包括但不限于基于大豆的、基于奶的、酪蛋白質(zhì)、乳清蛋白質(zhì)、大米蛋白質(zhì)、牛肉膠原、豌豆蛋白質(zhì)、馬鈴薯蛋白質(zhì)及其混合物。適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)水解產(chǎn)物也包括但不限于大豆蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、酪蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、乳清蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、大米蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、馬鈴薯蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、魚蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、蛋白水解產(chǎn)物、動(dòng)物膠蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、動(dòng)物和植物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的組合及其混合物。水解的蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)水解物)是已經(jīng)水解的或破碎為較短的肽片段和氨基酸的蛋白質(zhì)。這種水解的肽片段和游離氨基酸更容易被消化。在最廣的意義上，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)氨基鍵斷裂時(shí)蛋白質(zhì)已經(jīng)得到了水解。在制造的過(guò)程中氨基鍵的斷裂可能無(wú)意地或偶然地發(fā)生，例如由于加熱或剪切。對(duì)于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)水解的蛋白質(zhì)意為一種已經(jīng)以一種意在斷裂酰胺鍵的方式進(jìn)行了加工或處理的蛋白質(zhì)。預(yù)期的水解可以，例如通過(guò)用酶或酸處理完整的蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行。將優(yōu)選在根據(jù)本發(fā)明的配方食品中利用的水解的蛋白質(zhì)水解到這樣一種程度，即氨基氮(AN)與總氮(TN)的比率在約0.1AN/1.0TN到0.4AN/1.0TN。(由于游離氨基酸可以作為一種添加劑加入并且將改變報(bào)告值，給出的AN∶TN比率是對(duì)于水解產(chǎn)物蛋白質(zhì)源本身而言的，不代表在最終的嬰兒營(yíng)養(yǎng)配方食品產(chǎn)品中所給出的AN∶TN比率)。蛋白質(zhì)也可以以游離氨基酸的形式提供。根據(jù)本發(fā)明的一種配方食品，優(yōu)選添加以各種游離氨基酸，從而提供更加營(yíng)養(yǎng)全面和均衡的配方食品。
氨基酸是蛋白質(zhì)生物合成的單個(gè)的構(gòu)成部件。非必需氨基酸是那些在體內(nèi)由氨和各種碳源合成的氨基酸。非必需氨基酸包括丙氨酸(ALA)、絲氨酸(SER)、天冬氨酸(ASP)、谷氨酸(GLU)、半胱氨酸(CYS)、酪氨酸(TYR)、天冬酰胺(ASN)、脯氨酸(PRO)、甘氨酸(GLY)和谷氨酰胺(GLN)?？s寫“GLX”指GLU加GLN而縮寫“ASX”指ASP加ASN。
必需氨基酸對(duì)于體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成也是需要的，并且必須從食物來(lái)源中獲得。它們是異亮氨酸(ILE)、亮氨酸(LEU)、賴氨酸(LYS)、蛋氨酸(MET)、苯丙氨酸(PHE)、蘇氨酸(THR)、色氨酸(TRP)、纈氨酸(VAL)、組氨酸(HIS)和精氨酸(ARG)(在年輕成長(zhǎng)中的動(dòng)物中必需，但不在成體中必需)。在必需氨基酸中，色氨酸具有最低的每日攝入需求。
直接的關(guān)于蛋白質(zhì)可消化性的結(jié)論可以由分析得到，所述分析測(cè)定在體外消化后，溶液(可溶性的或可消化性的部分)中氨基酸的類型和濃度以及消化后固相(不可消化性的部分)中的氨基酸濃度水平。作為加入配方食品的適當(dāng)?shù)挠坞x氨基酸的例子，包括但不限于L-色氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸、L-氨基乙磺酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸和L-肉堿。
大豆本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)配方食品的一種組分是大豆蛋白質(zhì)。如上所述，可以考慮許多大豆蛋白質(zhì)來(lái)源。大豆蛋白質(zhì)分離自大豆。大豆是一種高質(zhì)量蛋白質(zhì)的極佳來(lái)源，大豆的大約38％到40％是蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)而言之(如圖表I中所示)，大豆的加工包括從去殼的，并且碎破大豆中提取油料，留下脫脂的大豆薄片。
方案I大豆加工 一般將脫脂的大豆薄片磨成粉；進(jìn)行醇提或alkoling/H2O提取以去除香料化合物和糖以使得蛋白質(zhì)濃縮；用水加工以去除糖和香料化合物，沉淀并干燥以使蛋白質(zhì)分離。乳清和蛋白纖維是上述過(guò)程的副產(chǎn)品。
營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品根據(jù)目的使用者的年齡和狀況的不同，營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品以各種相對(duì)量含有常量營(yíng)養(yǎng)物，即脂類、蛋白質(zhì)和糖類，并且經(jīng)常含有微量營(yíng)養(yǎng)物如維生素、礦物質(zhì)和痕量礦物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“食物”包括固體和液體。術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品”包括但不限于這些FDA的法定食品類別傳統(tǒng)食品、特殊食用用途的食品、醫(yī)學(xué)食品和嬰兒配方食品?！疤厥馐秤糜猛镜氖称贰笨梢酝ㄟ^(guò)供給營(yíng)養(yǎng)物以補(bǔ)充食品或作為食品的單獨(dú)組分而補(bǔ)給一種特殊食用需要，所述特殊食用需要由于一種身體的、生理的、病理的狀況而存在?！搬t(yī)學(xué)食品”是一種配制為在醫(yī)生的指導(dǎo)下進(jìn)行食用或腸道給藥的食物，它用作一種疾病或狀況的特異性膳食管理，對(duì)于這種疾病或狀況，基于已認(rèn)識(shí)的科學(xué)理論通過(guò)醫(yī)學(xué)評(píng)估確定了與眾不同的營(yíng)養(yǎng)需求。
此外，“食品添加劑”是一種用于通過(guò)以片劑、膠囊劑或液體形式攝入以補(bǔ)充食品的產(chǎn)品并且不主張用作一種傳統(tǒng)食物或作為一餐或日常飲食的單獨(dú)一項(xiàng)。
嬰兒配方食品嬰兒配方食品是指符合嬰兒配方食品法案(21 USC§350(a)et.seq.)的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范并用來(lái)代替或補(bǔ)充人乳奶的營(yíng)養(yǎng)配方食品。盡管這種配方食品在至少三種不同的形式中是現(xiàn)有的(粉狀、液體濃縮物和液體即食食品(“RTF”))，通常談到在“喂養(yǎng)”基礎(chǔ)上的營(yíng)養(yǎng)濃度，并且因而常常描述到RTF，它被理解為根據(jù)制造商指導(dǎo)，其它形式重構(gòu)或稀釋到基本相同的組成并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠計(jì)算出濃縮或粉狀形式的相關(guān)組成。
“標(biāo)準(zhǔn)”或“概念”嬰兒配方食品是指用于足月出生的嬰兒作為第一次飼喂的嬰兒配方食品。蛋白質(zhì)、脂肪和糖類組分分別提供大約熱量的8到10、46到50和41到44％；能量密度狹窄地從大約660到大約700kcal/L(或19-21Cal/fl.oz.)，通常大約為675到680kcal/L(20Cal/fl.oz.)。在脂肪、蛋白質(zhì)和糖類組分中熱量的分布可以在不同的概念嬰兒配方食品的生產(chǎn)商之間有些不同。SIMILACTM(Ross PoductsDivision，Abbott Laboratories)、ENFAMILTM(Mead JohnsonNutritionals)和GOOD STARTTM(Carnation)是概念嬰兒配方食品的例子。
“富營(yíng)養(yǎng)的”配方食品是指相對(duì)于“標(biāo)準(zhǔn)”或“概念”配方食品加強(qiáng)了的嬰兒配方食品。區(qū)別富營(yíng)養(yǎng)的配方食品的首要的定義性特征是能量密度；第二個(gè)因素是蛋白質(zhì)濃度。例如，一種具有高于約700kcal/L的能量密度或高于約18g/L的蛋白質(zhì)濃度的配方食品將被認(rèn)為是“富營(yíng)養(yǎng)的”。富營(yíng)養(yǎng)的配方食品一般還含有較高水平的鈣(例如高于約650mg/L)和/或磷(例如高于約450mg/L)。其例子包括SimilacNEOSURETM和Similac Special CareTM配方食品。
通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的一般傳統(tǒng)技術(shù)制造液體和粉狀營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品，對(duì)于所述產(chǎn)品能夠測(cè)量本發(fā)明的蛋白質(zhì)可消化性。簡(jiǎn)言之，制備三種漿液，混合在一起，熱處理，標(biāo)準(zhǔn)化，噴霧干燥(如果可行的話)，包裝并滅菌(如果可行的話)。
液體產(chǎn)品通過(guò)首先在攪拌下加熱水到高溫以制備一種糖/礦物質(zhì)漿液。隨后加入礦物質(zhì)。礦物質(zhì)可以包括但不限于檸檬酸鈉、氯化鈉、檸檬酸鉀、氯化鉀、氯化鎂、磷酸鈣、碳酸鈣、碘化鉀和痕量礦物質(zhì)的預(yù)混合物。將一種糖源，如一種或多種乳糖、玉米糖漿固體、蔗糖和/或麥芽糖糊精溶于水中，由此形成一種糖溶液。也可以加入一種膳食纖維源，如大豆多糖。將完全的糖/礦物質(zhì)漿液在攪拌下置于高溫中直到它與其它漿液混合，優(yōu)選持續(xù)不超過(guò)約12小時(shí)。
通過(guò)合并和加熱基本的油混合物來(lái)制備一種油漿液?；镜挠突旌衔镆话惆蠖埂⒁?、棕櫚油、高油紅花或向日葵油和中間鏈甘油三酯的某種組合?？梢允褂萌榛瘎绺视王?、甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、大豆甘油酯、甘油二酯和大豆卵磷脂?？梢詥为?dú)或作為一種預(yù)混物的部分加入可溶于油的維生素A、D、E(天然的R，R，R形式或合成的)和K的任何一種或全部。也可以加入作為一種體內(nèi)抗氧化劑的β-胡蘿卜素，以及一種穩(wěn)定劑如角叉菜膠。能夠?qū)瑢?duì)于本發(fā)明重要的特異性長(zhǎng)鏈聚合物的油加入到油漿液中。由于這些長(zhǎng)鏈聚合物容易降解而變得腐臭，必須小心使用它們。將完全的油漿液在攪拌下置于高溫中直到它與其它漿液混合，優(yōu)選持續(xù)不超過(guò)約12小時(shí)。
通過(guò)首先在攪拌下加熱水到適當(dāng)?shù)母邷匾灾苽湟环N在水漿液中的蛋白質(zhì)。隨后在攪拌下向水中加入蛋白質(zhì)源。一般這種蛋白質(zhì)源是完整的或水解的乳蛋白質(zhì)(例如乳清或酪蛋白)、完整的或水解的植物蛋白質(zhì)(例如大豆)、游離氨基酸及其混合物。通常地，任何已知的氨基氮源都可能夠用于本發(fā)明。將完全的蛋白質(zhì)漿液在攪拌下置于高溫中直到它與其它漿液混合，優(yōu)選持續(xù)不超過(guò)約2小時(shí)?；蛘?，可以在蛋白質(zhì)-脂肪乳劑而非蛋白質(zhì)-水中混合一些蛋白質(zhì)。
將在水中的蛋白質(zhì)和糖類/礦物質(zhì)以攪拌混合在一起并且將得到的混合漿液保持于高溫中。在短暫的停留后(例如幾分鐘)，將油漿液攪拌加入到來(lái)自前面步驟的混合漿液中。作為加入到油混合物中的替代品，能夠直接將LCP油加入到由混合蛋白質(zhì)、糖/礦物質(zhì)和油漿液所得到的混合物中。
在足以徹底混合所有的組分的時(shí)間后，調(diào)整完全混合物的pH到期望的范圍。隨后將混合的漿液進(jìn)行氣泡去除、超高溫?zé)崽幚?、乳化和均化，接著冷卻到冷凍溫度。優(yōu)選地，在上面的步驟完成后，進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治鲂栽囼?yàn)以控制質(zhì)量。基于質(zhì)量控制試驗(yàn)的分析結(jié)果，將適量的水加到該批量中攪拌溶解。
制備包含水溶性維生素和痕量礦物質(zhì)(包括硒酸鹽)的維生素溶液，并在攪拌下加至加工的漿液混合物中。制備一種單獨(dú)的含核苷的溶液并且也在攪拌下加至加工的混合漿液中。
可以再次調(diào)整終產(chǎn)品的pH以達(dá)到優(yōu)化的產(chǎn)品穩(wěn)定性。隨后將完成的產(chǎn)品充入適當(dāng)?shù)慕饘?、玻璃或塑料容器中并利用傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行終端滅菌。或者，能夠?qū)σ后w產(chǎn)品進(jìn)行無(wú)菌消毒并充入塑料容器中。
粉狀產(chǎn)品如上所述制備一種糖/礦物質(zhì)漿液，用于液體產(chǎn)品的生產(chǎn)。
如上所述制備一種油漿液，用于液體產(chǎn)品的生產(chǎn)，有下列例外1)乳化劑(單、二甘油酯、卵磷脂)和穩(wěn)定劑(角叉菜膠)一般不加至粉末中，2)除了β-胡蘿卜素外，還能夠加入其它抗氧化劑，如混合的維生素E和抗壞血酸棕櫚酸酯，以在任何隨后的噴霧干燥過(guò)程中幫助保持產(chǎn)品的氧化質(zhì)量，和3)在混合漿液后加入LCPs，而非加到油漿液中。
如上所述制備在水漿液中的蛋白質(zhì)，用于液體產(chǎn)品的生產(chǎn)。
以與所述的液體產(chǎn)品的生產(chǎn)相似的方式將糖/礦物質(zhì)漿液、在水漿液中的蛋白質(zhì)和油漿液進(jìn)行混合。在調(diào)整完全混合物的pH后，接著將LCPs攪拌加入到混合的漿液中。可預(yù)期地，當(dāng)混合物恰好在均化(在線混合)之前以恒定速率通過(guò)一個(gè)導(dǎo)管時(shí)，LCPs緩慢地計(jì)量到產(chǎn)品中。
在除去氣泡、超高溫處理、乳化和均化后，將加工的混合物進(jìn)行蒸發(fā)以提高混合物的固體水平，促進(jìn)更有效的噴霧干燥。隨后讓混合物通過(guò)一個(gè)預(yù)熱器和一個(gè)高壓泵并且利用傳統(tǒng)的噴霧干燥技術(shù)進(jìn)行噴霧干燥。噴霧干燥粉末可能會(huì)結(jié)塊，并隨后在真空、氮?dú)饣蚱渌栊原h(huán)境下包裝入金屬或塑料罐或金屬箔/金屬薄片盒中。
任何這些生產(chǎn)方法的變異型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員都是公知的或?qū)⑹秋@而易見的。本發(fā)明并不限于任何特定的生產(chǎn)方法。并入本文所提及的所有美國(guó)專利的全文作為參考。
胃和腸的酶本文所述的用作體外消化的酶根據(jù)美國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生產(chǎn)。因而酶的活性高度一致。美國(guó)藥典(USP)是一種非政府組織，它通過(guò)建立技術(shù)狀態(tài)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確保藥物質(zhì)量和其它健康護(hù)理技術(shù)以促進(jìn)公共健康。這些標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)公眾參與的過(guò)程得以發(fā)展并為世界所接受。
由USP所發(fā)展的標(biāo)準(zhǔn)公布在美國(guó)藥典和國(guó)家藥方(USP-NF)中，它在聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法案(21 U.S.C.§321 et seq.)中得到認(rèn)可。
適于用在本文所述的方法中的酶包括，但不限于胃蛋白酶、肽酶、胰酶蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。
體外蛋白質(zhì)的消化體內(nèi)消化過(guò)程難以精確再現(xiàn)。但是，存在于體內(nèi)的幾種條件可以在體外再現(xiàn)。體外可消化性分析應(yīng)當(dāng)在與體內(nèi)環(huán)境盡可能相近的條件下進(jìn)行。例如，消化系統(tǒng)的pH和酶應(yīng)當(dāng)納入體外消化過(guò)程。類似地，體外消化應(yīng)當(dāng)是一種相應(yīng)于蛋白質(zhì)殘余物駐留在消化道中時(shí)的時(shí)期的消化。下面描述的體外消化過(guò)程模仿胃的pH和組成以及幼嬰的腸酶。體外消化的時(shí)間也模仿食物通過(guò)幼嬰的消化道所需要的進(jìn)間。通過(guò)下列過(guò)程進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)消化通過(guò)獲得一定量的即時(shí)營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品、粉末的重組或液體濃度的稀釋來(lái)制備80mL的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的樣品。定量地轉(zhuǎn)移懸浮液至一個(gè)100mL的容量瓶并以水稀釋至100mL。(應(yīng)該制備懸浮液使得100mL的容量瓶包含大約1.625克的蛋白質(zhì)，并且移液至20mL的螺旋帽玻瓶的每份包含約0.1625克的蛋白質(zhì)。分析結(jié)果的質(zhì)量在某種程度上依賴于酶與樣品蛋白質(zhì)的恒定比率的使用)。
將10mL的稀釋樣品移液至20mL的螺旋帽玻瓶中。
以1M的鹽酸調(diào)節(jié)10mL整份的pH至4.5。
加入32mg的USP胃蛋白酶(美國(guó)藥典，12601 TwinbrookParkway，Rockville，MD20852)并攪拌以徹底懸浮胃蛋白酶。
在玻瓶中于37℃溫育30分鐘。
以0.5M NaHCO3將pH提高至7.0。
加入3mL新鮮制備的在0.1M NaHCO3中的25mg/ml的USP胰蛋白酶淀粉酶(美國(guó)藥典，12601 Twinbrook Parkway，Rockville，MD20852)懸浮液。攪拌以徹底懸浮酶。
在玻瓶中于37℃溫育60分鐘。
將玻瓶浸入沸水浴中4分鐘。冷卻至室溫。定量地將得到的消化物轉(zhuǎn)移至一個(gè)已經(jīng)確定了皮重的25mL的容量瓶中，使用水幫助轉(zhuǎn)移。在瓶中以水稀釋消化物并記錄重量。
對(duì)試劑空白與營(yíng)養(yǎng)樣品平行進(jìn)行消化以用于計(jì)算在消化的樣品中得到的氨基酸的全部和可溶性部分。
取分離的消化物等份測(cè)定氨基酸分布和色氨酸濃度。但是，如果氨基酸分布和色氨酸濃度由同一個(gè)消化物等份進(jìn)行測(cè)定，則不需要分離步驟。
氨基酸分布在測(cè)試總氨基酸的分布之前，通過(guò)移液管將100μL消化物轉(zhuǎn)移到一個(gè)已經(jīng)確定了皮重的2mL安瓿瓶中，并記錄重量。加入2.0ml 6MHCL，將安瓿瓶置于氮?dú)饣\罩下，閉封并在110℃加熱22小時(shí)。然后將消化物蒸發(fā)至干，然后重懸于2mL Na-S緩沖液中。通過(guò)GelmanAcrodisc(0.45μm，Gelman P/N 4497)過(guò)濾重懸物。
在測(cè)試可溶性氨基酸的分布之前，通過(guò)移液管將10mL的消化物轉(zhuǎn)移至一個(gè)配衡的50mL的離心管中。加入10mL 24％的三氯乙酸，蓋上管帽并充分混合。記錄管內(nèi)容物的重量。以3000倍重力將管和內(nèi)容物離心30分鐘，隨后通過(guò)Whatman41號(hào)紙過(guò)濾液體。通過(guò)移液管將200μL的過(guò)濾物轉(zhuǎn)移至一個(gè)已經(jīng)確定了皮重的2mL的安瓿瓶，并記錄樣品的重量。如總氨基酸的測(cè)試一樣，加入2.0mL的6M HCl并將安瓿瓶置于氮?dú)饣\罩下，密閉并于110℃加熱22小時(shí)。隨后將消化物蒸發(fā)至干燥，接著在2mL的Na-S緩沖液中重懸。通過(guò)Gelman Acrodisc(0.45μm，Gelman P/N4497)過(guò)濾重懸物。
如果可溶性和總的氨基酸分布和色氨酸濃度由同一個(gè)消化物等份樣進(jìn)行測(cè)定，則不需要分離步驟(例如離心)。
通過(guò)酸水解將蛋白質(zhì)水解為它們的組成氨基酸，并且通過(guò)一種自動(dòng)氨基酸分析儀(Model 6300氨基酸分析儀，BeckmanInstruments，Inc.，Palo Alto，CA)測(cè)試酸水解物。分析儀使用離子交換層析以分離單個(gè)的氨基酸，并利用茚三酮的柱后衍生作用產(chǎn)生氨基酸衍生物，隨后用比色計(jì)對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)和定量。
色氨酸檢測(cè)通過(guò)在S.E.Garcia和J.H.Baxter in Determination of TryptophanContent in Infant Formulas and Medical Nutritionals，J AOAC Int 1992Nov-Dec；75(6)1112-9中所述的方法進(jìn)行色氨酸的測(cè)定，該文獻(xiàn)并入這里作為參考。
將3.0mL的消化物轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶中以進(jìn)行總蛋白質(zhì)的色氨酸測(cè)定。加入1.0mL的鏈霉蛋白酶溶液(1.7mg/mL于0.05M TRIS，pH7.5)并以pH7.5的緩沖液將體積稀釋至50mL。隨后將50mL溶液于50℃溫育6小時(shí)。接著通過(guò)HPLC法測(cè)定色氨酸。
對(duì)于可溶性蛋白質(zhì)的色氨酸測(cè)定，用移液器將6.0mL制備用來(lái)測(cè)定可溶性氨基酸的過(guò)濾液轉(zhuǎn)移至50mL燒杯中。加入30mL的0.05M的TRIS，pH7.5。利用45％的氫氧化鉀將pH調(diào)節(jié)到7.5。如對(duì)總蛋白質(zhì)色氨酸的測(cè)試一樣，加入1.0mL鏈霉蛋白酶溶液(1.7mg/mL于0.05M TRIS，pH7.5)并以pH7.5的緩沖液將體積稀釋至50mL。隨后將50mL溶液于50℃溫育6小時(shí)。接著通過(guò)HPLC法測(cè)定色氨酸。
用于色氨酸測(cè)定的HPLC系統(tǒng)柱YMC ODS-AQ，4.6×250mm，120A，5um，Waters#AQ12S052546WT。
流動(dòng)相A900mL含H3PO4的0.02M KH2PO4，100mL乙腈；pH3.1。
流動(dòng)相B200mL實(shí)驗(yàn)室水，800mL乙腈。
流速0.5mL/分鐘。
溫度20℃。
檢測(cè)紫外線于280nm，214nm處。
注射10μL。
運(yùn)行時(shí)間50分鐘。
洗脫程序0％B 0-5分鐘，0-25％B 5-34分鐘，25-100％B 34-35分鐘，100％B 35-37分鐘，100-0％B 37-38分鐘。
標(biāo)準(zhǔn)溶液于實(shí)驗(yàn)室水中的約28mg/L(高標(biāo)準(zhǔn))、約14mg/L(中等標(biāo)準(zhǔn))和約7mg/L(低標(biāo)準(zhǔn))的Abbott Laboratories PPD L-色氨酸。
蛋白質(zhì)可消化性的計(jì)算將空白試劑的總蛋白質(zhì)的氨基酸分布濃度與色氨酸濃度相加。稱該值為“RT”。
將空白試劑的可溶性蛋白質(zhì)的氨基酸分布濃度與色氨酸濃度相加。稱該值為“RS”。
將得到的樣品消化總蛋白質(zhì)的氨基酸分布濃度與色氨酸濃度相加。稱該值為“IT”。
將得到的樣品消化可溶性蛋白質(zhì)的氨基酸分布濃度與色氨酸濃度相加。稱該值為“IS”。
如下計(jì)算蛋白質(zhì)的可消化性 如同單個(gè)地和具體地指出每一篇參考文獻(xiàn)被并入作為參考的程度一樣，特此并入本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請(qǐng)和專利作為參考，在本文中提出其全部?jī)?nèi)容。
在描述發(fā)明的上下文(特別是下面的權(quán)利要求書的上下文)中的術(shù)語(yǔ)″一個(gè)″和″一種″和″該″和類似的表示被解釋為既覆蓋單數(shù)也覆蓋復(fù)數(shù)，除非本文另外指明或清楚地為與上下文相抵觸。本文中值的范圍的列舉僅僅是作為一種分別表示落入該范圍的每個(gè)單獨(dú)值的速記方法，除非另外指明，并且每個(gè)單獨(dú)值都被整合入說(shuō)明書中，好像它在本文中被個(gè)別列舉一樣。本文所述的所有方法都能夠以任何適當(dāng)?shù)捻樞蜻M(jìn)行，除非文中另外指明或否則為上下文所清楚地抵觸。本文所提供的任何和所有的實(shí)施例，或示例性的語(yǔ)言(例如，“如”)的使用，僅僅是為了更好地闡釋本發(fā)明，并不形成對(duì)發(fā)明范圍的限制，除非另外要求。在說(shuō)明書中沒有語(yǔ)言會(huì)被理解成指明任何未要求的要素為對(duì)于發(fā)明的實(shí)施來(lái)說(shuō)是必需的。
盡管一些潛在的益處和目的已在本文中清楚地得以確定，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的一些實(shí)施方案可能沒有提供全部的，或任何的清楚確定的益處和目的。
在本文中對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，包括發(fā)明者已知的實(shí)施本發(fā)明的最佳方式。當(dāng)然，那些優(yōu)選的實(shí)施方案的變異型對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)在閱讀前述說(shuō)明書后會(huì)變得顯而易見。本發(fā)明人希望熟練的技術(shù)人員適當(dāng)?shù)厥褂眠@些變異型，并且發(fā)明人指出本發(fā)明能夠以與不同于本文所具體描述的方式而得以實(shí)施。因此，本發(fā)明包括對(duì)在此所附的權(quán)利要求書中列舉的主題的所有改進(jìn)和等同物，正如適用法律所允許的。而且，在其所有可能的變異型中，上述要素的任何組合都為本發(fā)明所包含，除非文中指明或否則為上下文所清楚地抵觸。
實(shí)施例下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡釋了本發(fā)明，但是當(dāng)然，不應(yīng)當(dāng)理解為以任何方式限制它的范圍。
實(shí)施例1由Arla Foods Ingredients amba Nr.Vium DK-6920 Videbaek丹麥獲得三種粉狀A(yù)rla乳清蛋白質(zhì)水解物(WPH)。將含有約1.625克蛋白質(zhì)的80mL重構(gòu)粉狀WPHs和也含有約1.625克蛋白質(zhì)的80mL重構(gòu)雀巢GOOD STARTTM，在體外根據(jù)本文所述的方法與試劑空白平行地進(jìn)行消化。測(cè)定氨基酸分布以獲得總消化和本文所述的消化的可溶性部分。氨基酸分布顯示于表1中。蛋白質(zhì)的可消化性的比較顯示于表2。
當(dāng)在大的現(xiàn)代銅溶劑萃取裝置的情況下采用時(shí)，銅回收率的1％增加可以實(shí)質(zhì)地增加收入。例如考慮每年生產(chǎn)100,000噸銅的銅溶劑萃取裝置。額外1％的回收率導(dǎo)致額外1,000噸銅，它在US $1500噸的銅價(jià)格下價(jià)值為約150萬(wàn)US$。額外4％的銅回收率增加6百萬(wàn)US$的收入。
相對(duì)于2E，2S階段配置，3E，1S階段配置的有利的第二方面是提高的銅相對(duì)于鐵(Cu/Fe)選擇性。這通過(guò)如下方式注意到比較對(duì)于一些2E，2S設(shè)置的負(fù)載有機(jī)相的Cu/Fe轉(zhuǎn)移與對(duì)于相似3E，1S設(shè)置的負(fù)載有機(jī)相的Cu/Fe轉(zhuǎn)移。首先將對(duì)于每個(gè)等溫線點(diǎn)在有機(jī)相上的鐵負(fù)載對(duì)相同點(diǎn)的銅負(fù)載作圖。這得到一張圖，即對(duì)于相同有機(jī)相的任何銅負(fù)載，該圖可用于找到有機(jī)相的鐵負(fù)載。對(duì)于表2中的設(shè)置，從計(jì)算機(jī)模擬的回路運(yùn)行獲得負(fù)載的有機(jī)相的銅含量，然后可以從鐵負(fù)載對(duì)銅負(fù)載的圖獲得對(duì)于該銅負(fù)載的有機(jī)相的鐵負(fù)載。在表3中給出表2中一些設(shè)置的此數(shù)據(jù)。
表3
Cu/Fe選擇性計(jì)算如下。將有機(jī)相的銅轉(zhuǎn)移除以負(fù)載的有機(jī)相的鐵
注色氨酸通過(guò)HPLC進(jìn)行測(cè)定。這些值分別基于Arla 1、Arla 2、Arla 3和GOOD START Power的77.0％、78.0％、78.5％和12.3％的總蛋白濃度。
表2.蛋白質(zhì)的可消化性的比較。
*即，可溶性蛋白質(zhì)中的總氨基酸克數(shù)/100克總的樣品蛋白質(zhì)。
由于WPH的可消化性可能被嬰兒配方食品的生產(chǎn)過(guò)程所降低，所以關(guān)于這種營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的可消化性的確切結(jié)論最好由嬰兒配方食品的比較得出。
實(shí)施例2將三種低鐵的SIMILACTM樣品和三種雀巢GOOD STARTTM奶粉樣品中的每一種都用水進(jìn)行重構(gòu)，每種重構(gòu)物的80mL都包含約1.625克蛋白質(zhì)。根據(jù)本文所述的方法與試劑空白平行在體外消化配方食品樣品。早先描述的體外消化方法，在參數(shù)pH、酶的存在以及消化時(shí)間上都模仿幼嬰的消化系統(tǒng)。如本文所述地，測(cè)定氨基酸分布和色氨酸濃度以獲知總的消化和消化的可溶性部分。一個(gè)氨基酸分布的例子顯示于表3中。進(jìn)行本文所述的蛋白質(zhì)的可消化性的計(jì)算。蛋白質(zhì)的可消化性的比較顯示于表4中。
表4.實(shí)施例2的消化的樣品的氨基酸分布。濃度以樣品懸浮液的mg/L表示。

表4.SIMILACTM和雀巢GOOD STARTTMPowders的蛋白質(zhì)的可消化性的比較
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定蛋白質(zhì)的可消化性的方法，該方法包括下列步驟以至少一種酶消化一種營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的樣品和試劑空白；終止消化過(guò)程；測(cè)定樣品和空白對(duì)照各自的多種氨基酸的總濃度；測(cè)定樣品和空白對(duì)照的總的色氨酸濃度；測(cè)定樣品和空白對(duì)照各自的多種氨基酸的可溶性濃度；測(cè)定樣品和空白對(duì)照的色氨酸的可溶性濃度；計(jì)算可溶性氨基酸在營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的消化樣品中的百分率。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包含下列步驟將消化的樣品和空白對(duì)照中的每一個(gè)分離成一種第一部分和一種第二部分；測(cè)定樣品的第一部分和空白對(duì)照的第一部分的多種氨基酸的總濃度；測(cè)定樣品的第一部分和空白對(duì)照的第一部分的總的色氨酸濃度；將樣品的第二部分和空白對(duì)照的第二部分中的每一個(gè)分離成為一個(gè)液相和一個(gè)固相；測(cè)定液相中多種氨基酸的可溶性濃度；和測(cè)定液相中色氨酸的可溶性濃度。
3.權(quán)利要求2的方法，其中分離步驟選自酸化、沉淀、離心、過(guò)濾和離心與過(guò)濾的組合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中計(jì)算可溶性氨基酸的百分率的步驟包括將樣品和空白對(duì)照的多種氨基酸的總濃度和色氨酸的濃度相加；測(cè)定在樣品和空白對(duì)照之間在多種氨基酸和色氨酸的總濃度上的差異；將在樣品和空白對(duì)照中的多種氨基酸的可溶性濃度和色氨酸的可溶性濃度相加；測(cè)定在樣品和空白對(duì)照之間在多種氨基酸和色氨酸的可溶性上濃度的差異；將在可溶性濃度上的差異除以在總濃度上的差異以確定商；和以100乘以商。
5.權(quán)利要求1的方法，其中營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品為嬰兒配方食品。
6.權(quán)利要求1的方法，其中消化步驟使用一種或多種酶以模仿人胃腸道的環(huán)境。
7.權(quán)利要求6的方法，其中酶選自胃蛋白酶、肽酶、胰酶蛋白酶、胰蛋白酶淀粉酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。
8.權(quán)利要求1的方法，其中消化樣品的步驟包括下列步驟獲得營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的樣品；調(diào)節(jié)pH到大約4.5；加入胃蛋白酶；溫育樣品；提高pH到大約7.0；加入胰酶蛋白酶；和溫育樣品。
9.權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)美國(guó)藥典的酶活性標(biāo)準(zhǔn)制備胃蛋白酶。
10.權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)美國(guó)藥典的酶活性標(biāo)準(zhǔn)制備胰酶蛋白酶。
11.權(quán)利要求11的方法，其中終止消化的步驟包括將樣品浸入沸水浴中。
12.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種酶為通過(guò)美國(guó)藥典的酶活性標(biāo)準(zhǔn)制備的胃或腸的酶。
全文摘要
一種用于體外測(cè)定營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的可消化性的方法。該方法使用經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化以模仿體內(nèi)消化過(guò)程的體外消化過(guò)程的胃和腸的酶。另外，通過(guò)氨基酸分布測(cè)定消化的特異性。
文檔編號(hào)G01N33/02GK1678752SQ03820425
公開日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2003年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月29日
發(fā)明者P·W·約翰斯, L·程, L·道拉蒂 申請(qǐng)人:艾博特公司