專利名稱：：篩選抗體表達(dá)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)的抗體生成領(lǐng)域。本發(fā)明的一個(gè)目的是設(shè)計(jì)一種篩選抗體生成細(xì)胞的方法以及對(duì)細(xì)胞系穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估的方法。篩選相對(duì)于非抗體生成細(xì)胞的抗體生成細(xì)胞，特別是篩選一種高效抗體生成細(xì)胞系在任何生物過程的研發(fā)過程均是非常重要的第一步。對(duì)于由動(dòng)物細(xì)胞生成蛋白質(zhì)，這些傳統(tǒng)上篩選出的細(xì)胞系已經(jīng)經(jīng)過多輪有限稀釋克隆以及隨后的產(chǎn)品分析所分離出來。這種傳統(tǒng)過程非常耗時(shí)而且比較昂貴。為了提高克隆的理論可信度需要進(jìn)行兩輪克隆?？寺?duì)于避免由于低生成力變種所導(dǎo)致的高產(chǎn)細(xì)胞的過度生長(zhǎng)是很重要的，所述低生成力變種通常具有比高產(chǎn)細(xì)胞還要高的生長(zhǎng)率?？傮w上，完成傳統(tǒng)過程需要超過8個(gè)月的時(shí)間。而且，實(shí)際需要考慮的事項(xiàng)限制了事實(shí)上所篩選出的細(xì)胞數(shù)，這就使得只能憑運(yùn)氣才能檢測(cè)出低豐度的高產(chǎn)細(xì)胞克隆。在研發(fā)過程中，對(duì)細(xì)胞系穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)需要進(jìn)一步的分析克隆，其需要花費(fèi)6到7個(gè)星期的時(shí)間。另外，分析克隆涉及對(duì)200-300個(gè)克隆進(jìn)行評(píng)估，與可以借助流式細(xì)胞術(shù)對(duì)數(shù)千個(gè)克隆所進(jìn)行的分析相比，其提供了一個(gè)關(guān)于非生成群體的大小的更加詳細(xì)和準(zhǔn)確的圖象。以前所報(bào)道的分泌檢測(cè)的靈敏度較低，不足以對(duì)不同的亞種群進(jìn)行分辨，從而不能對(duì)不同的亞種群進(jìn)行量化。流式細(xì)胞術(shù)(FC)使得對(duì)大量細(xì)胞的生產(chǎn)力進(jìn)行監(jiān)測(cè)成為可能，并且可以分離出適當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)需要用熒光團(tuán)標(biāo)記細(xì)胞，在流式細(xì)胞術(shù)中對(duì)細(xì)胞的熒光進(jìn)行定量，并且與所需要的特性相關(guān)聯(lián)。然而，在細(xì)胞系表面所顯示的膜結(jié)合抗體的數(shù)量與該細(xì)胞系的可溶性抗體的分泌率之間的相關(guān)性不是很好(Meilhoc等，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)量表面IgG在低血清或無血清培養(yǎng)基中的鼠雜交瘤細(xì)胞系合成和分泌單克隆抗體的動(dòng)力學(xué)分析中的應(yīng)用(ApplicationofflowcytometricmeasurementofsurfaceIgGinkineticanalysisofmonoclonalantibodysynthesisandsecretionbymurinehybridomacell-lineinlowserumandserum-freemedia)，Hybridoma9，67-175)。因此，簡(jiǎn)單地用檢測(cè)抗體對(duì)所顯示的抗體進(jìn)行染色不能有效地分離出高產(chǎn)的細(xì)胞克隆。為了解決該問題，選擇了兩個(gè)本質(zhì)上完全不同的方法，以直接篩選分泌抗體的高效生成細(xì)胞。在第一種方法中，單個(gè)細(xì)胞及其分泌的抗體被包囊在凝膠滴中。然后對(duì)整個(gè)凝膠滴進(jìn)行標(biāo)記，并通過FC進(jìn)行分類。該方法的缺點(diǎn)在于，該方法對(duì)用戶來說不是很友好，即為了確保凝膠滴中只含有單個(gè)細(xì)胞，只有5％的凝膠滴中包含一個(gè)細(xì)胞，而所分析的大約95％的凝膠顆粒中不含細(xì)胞。另外，包囊/去包囊可以導(dǎo)致一些通常用于重組蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞類型的生存能力降低，最顯著的是骨髓瘤(meyeloma)NSO細(xì)胞。在第二種方法中，通過在細(xì)胞表面人工制造出親合位點(diǎn)或受體，以保留所分泌的受體，然后用FC評(píng)估所分泌的抗體數(shù)量。Holmes等(J.ofImmunol.methods，230(1999)，141-147)描述了一種在室溫下對(duì)質(zhì)膜蛋白進(jìn)行生物素化的分析方法。生物素促進(jìn)第一抗生物素蛋白和第二生物素化捕獲抗體的結(jié)合。所述捕獲抗體識(shí)別NSO細(xì)胞系所分泌的抗體，并將所述抗體固定于細(xì)胞表面。將帶有被捕獲的分泌抗體的細(xì)胞與第三個(gè)用熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體一起培養(yǎng)，用FC進(jìn)行熒光檢測(cè)并對(duì)低豐度高產(chǎn)出的細(xì)胞克隆進(jìn)行細(xì)胞分類。向培養(yǎng)基中加入一種粘性劑例如膠質(zhì)以防止克隆之間發(fā)生干擾(即生成細(xì)胞所產(chǎn)生的分泌抗體擴(kuò)散和結(jié)合到非生成細(xì)胞或者低生成細(xì)胞)已經(jīng)公開的方法的主要缺點(diǎn)在于，其對(duì)區(qū)分高產(chǎn)和低產(chǎn)細(xì)胞，以及對(duì)低豐度高產(chǎn)細(xì)胞的精確分類具有相對(duì)較低的靈敏度。采用已公開的方法不可能檢測(cè)到給定細(xì)胞系所分泌的嵌合抗體通過捕獲抗體結(jié)合到細(xì)胞表面。另外，這種捕獲抗體必須來自包括胎兒血清在內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，并且通常用牛血清白蛋白進(jìn)行穩(wěn)定，并用作商業(yè)抗體制品。因此，使用捕獲抗體會(huì)導(dǎo)致克隆細(xì)胞培養(yǎng)物有可能被病毒或BSE污染的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)出另外一種方法，能有效地從細(xì)胞克隆庫(kù)中檢測(cè)和篩選出適宜的表達(dá)抗體的單個(gè)細(xì)胞。此目的可以通過獨(dú)立權(quán)利要求1所述的方法達(dá)到。附圖中顯示了本發(fā)明的可能實(shí)施例圖1a分泌抗體的捕獲和檢測(cè)原理的示意圖，b捕獲抗體和A蛋白的結(jié)合能力的比較圖2對(duì)本發(fā)明的分泌檢測(cè)的樣品進(jìn)行熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)(FC)分析。圖3對(duì)分泌檢測(cè)的樣品進(jìn)行熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)(FC)分析，其中比較了A蛋白和抗人IgG抗體捕獲分泌抗體的效果。根據(jù)本發(fā)明，用于篩選分泌第一抗體的細(xì)胞的方法包括以下步驟a)將抗生物素蛋白連接至細(xì)胞的細(xì)胞表面；b)將細(xì)胞與一種生物素化多肽進(jìn)行培養(yǎng)，所述多肽至少包括一個(gè)G蛋白或A蛋白的功能性抗體結(jié)合域；c)將細(xì)胞與第二抗體進(jìn)行培養(yǎng)，所述第二抗體用熒光標(biāo)記，其識(shí)別并結(jié)合第一抗體的抗原表位，培養(yǎng)后，將未結(jié)合的第二抗體沖洗掉；d)篩選出結(jié)合有一定量的第二抗體的熒光標(biāo)記的細(xì)胞，熒光分析流式細(xì)胞術(shù)(FC)是優(yōu)選且方便的。FC允許隨后對(duì)熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行分類。分泌抗體的生成細(xì)胞可以是任何用來分泌抗體的細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞雜交瘤、骨髓瘤或者CHO細(xì)胞。更優(yōu)選地是，生成細(xì)胞是一種骨髓瘤細(xì)胞系，最優(yōu)選地是，它是一種NSO細(xì)胞系。因此，抗體可以是任何天然生成的抗體或基因工程抗體或者抗體片段，例如嵌合或單價(jià)或雙特異性抗體，包括近期公知的駱駝和羊駝的單重鏈抗體(TrendsBiochem.Scien.(2001)，26，230)。根據(jù)本發(fā)明，這些抗體優(yōu)選含有高親和力細(xì)菌G蛋白或A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，正如不同類(IgG，IgA，IgE，IgM)免疫球蛋白(Ig)的天然Fc部分的位點(diǎn)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的抗體包含IgG的Fc部分。最優(yōu)選地是，根據(jù)本發(fā)明的抗體是IgG或者是包含IgG的至少一個(gè)重鏈。根據(jù)本發(fā)明的抗生物素蛋白是常規(guī)的鳥類抗生物素蛋白(大約67kD)，或者其它任何功能性的、即結(jié)合生物素的同源物質(zhì)，例如來自鏈霉菌屬的鏈霉抗生物素(60kD)，或任何天然生成的抗生物素的化學(xué)或基因工程變種。這些變種的一個(gè)例子是Neutravidin(Pierce，Pockford/IL)，該物質(zhì)為不含糖的去糖基抗生物素蛋白，pI在6-7之間，可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的改造使其不包含鏈霉抗生物素的三肽RYD區(qū)域，所述區(qū)域可以介導(dǎo)細(xì)胞表面受體的非特異性結(jié)合。優(yōu)選地是，根據(jù)本發(fā)明的抗生物素蛋白是鳥類抗生物素蛋白，去糖基化的鳥類抗生物素蛋白，或是一種neutravidine。最佳的是，根據(jù)本發(fā)明的抗生物素蛋白是neutravidine。這些neutravidine顯示具有最大的生物素結(jié)合能力，其結(jié)合能力大約為14微克生物素/毫克蛋白。抗生物素蛋白能通過例如交聯(lián)的方法連接到細(xì)胞表面?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的常見的雙功能交聯(lián)劑，其包含反應(yīng)基團(tuán)例如環(huán)氧乙烷，乙醛，琥珀酸亞胺或者光反應(yīng)化合物，例如N-[N-4-疊氮基-四氟苯甲?；鵠生物胞素氧基，SAND(磺基琥珀酰亞胺基2-[間疊氮基-鄰硝基苯甲酰氨基]-乙基-1，3-二硫代丙酸)。不言而喻的是，或者是與脂質(zhì)的活性基團(tuán)(例如磷酸絲氨酸的羥基官能團(tuán))，或者更可能的是與膜蛋白表面上的反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生所述交聯(lián)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，抗生物素蛋白通過帶有生物素標(biāo)記的單功能交聯(lián)劑，將生物素部分共價(jià)地連接到細(xì)胞表面，然后非共價(jià)地附著到細(xì)胞表面上?？股锼氐鞍鬃R(shí)別和結(jié)合至細(xì)胞表面的生物素部分。更優(yōu)選地是，上述生物素化過程在低于10℃的溫度下完成，最佳是在大約4℃或者更低。在此溫度下，生物素化的效率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。有利地是，細(xì)胞表面的生物素化的反應(yīng)時(shí)間在30-60分鐘內(nèi)。如果抗生物素蛋白通過細(xì)胞表面的生物素標(biāo)記被捕獲到細(xì)胞表面，更加優(yōu)選地是這些細(xì)胞在含有至少50μg/ml，更優(yōu)選地是100μg/ml的抗生物素蛋白溶液中進(jìn)行培養(yǎng)，術(shù)語“抗生物素蛋白”是指根據(jù)本發(fā)明的抗生物素蛋白。抗生物素蛋白分子通常具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。如果用生物素標(biāo)記對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行包被，然后以超出共價(jià)連接于細(xì)胞表面的生物素標(biāo)記的量，培養(yǎng)抗生物素蛋白，一個(gè)生物素標(biāo)記將結(jié)合一個(gè)抗生物素分子，留有三個(gè)空著的生物素標(biāo)記結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步優(yōu)選地是，將共價(jià)連接于細(xì)胞表面并使抗生物素蛋白非共價(jià)地固定在細(xì)胞表面上的生物素部分通過間隔基部分連接至細(xì)胞表面，所述間隔部分例如直鏈烷基鏈，其延伸超過10，更優(yōu)選地是至少20，最佳的是至少30。根據(jù)本發(fā)明的方法的下一步驟中，將包含至少一個(gè)抗體結(jié)合域的生物素化多肽與抗生物素蛋白標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并且結(jié)合至連接在細(xì)胞表面上的抗生物素蛋白。根據(jù)本發(fā)明，抗體結(jié)合域并不是衍生自免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的抗原結(jié)合部位或其互補(bǔ)的決定部位。它是一種非免疫球蛋白源的抗體結(jié)合多肽。這種多肽可以例如是A蛋白(Surolia，A.等，1982，A蛋白天然的遍在抗體(ProteinANature’sunversal，antibody)，TIBS7，74-76；Langone，J.，1982，金黃色葡萄球菌的A蛋白和相關(guān)的免疫球蛋白受體(ProteinAofstaphylococcusaureusandrelatedimmoglobulinreceptors)，Adv.inImmunology，32p156-241)，G蛋白或蛋白L。蛋白L來自于鏈球菌屬，其具有通過k輕鏈的相互作用而結(jié)合的能力，而不對(duì)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生干擾(Kastern，W.等，1992，L蛋白的結(jié)構(gòu)和重復(fù)的免疫球蛋白輕鏈結(jié)合域的鑒定(StructureofproteinLandidentificationofarepeatedimmunoglobulinlight-chainbindingdomain)，J.Biol.chem..267，12820-12825)，因而其可以結(jié)合所有種類的Ig，也可以結(jié)合單鏈可變片段(ScFv)和Fab片段。根據(jù)本發(fā)明，使用包含多肽的上述抗體結(jié)合域可以增強(qiáng)分泌檢測(cè)的靈敏度，能夠從低產(chǎn)細(xì)胞或非生成細(xì)胞中充分地區(qū)分出高產(chǎn)細(xì)胞克隆。本發(fā)明的分泌檢測(cè)方法也能夠簡(jiǎn)便、快速地評(píng)價(jià)細(xì)胞系的穩(wěn)定性。在細(xì)胞系的開發(fā)過程中進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞系穩(wěn)定性評(píng)價(jià)需要對(duì)200-300個(gè)克隆進(jìn)行克隆分析，這需要6到7個(gè)星期的時(shí)間。與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，作為本申請(qǐng)主題的檢測(cè)方法具有足夠的靈敏度，可以對(duì)數(shù)以千計(jì)的低產(chǎn)或非生成細(xì)胞的亞群體進(jìn)行分辨和定量，從而可以在僅僅5小時(shí)內(nèi)給出關(guān)于細(xì)胞系穩(wěn)定性的信息。優(yōu)選地抗體結(jié)合域來自A蛋白或G蛋白。葡萄球菌屬的A蛋白和鏈球菌屬的G蛋白是眾所周知的可特異性結(jié)合于抗體Fc段的蛋白質(zhì)試劑(Boyle，M.，細(xì)菌免疫球蛋白結(jié)合蛋白(BacterialImmunoglobulin-Bindingproteins)，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥1990)。它們?cè)趲缀跛袆?dòng)物物種或亞綱的IgG親和純化的生物技術(shù)中具有廣泛的應(yīng)用。葡萄球菌屬的A蛋白與IgGFc片段的結(jié)合位點(diǎn)與鏈球菌屬的G蛋白相似，其包括兩種情況，例如Deisenhofer等(1981，Biochemistry202361-2370)和Sauer-Eriksson等(1995，Structure3，265-278)表述的人IgG-Fc殘基252-254，433-435和311。而且，WO00/7428中描述了一種能結(jié)合細(xì)菌G蛋白的B1域多肽的分離抗體，其能結(jié)合IgG的Fab片段，但是不能結(jié)合IgG的Fc片段。使用B1域是本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例。通常，根據(jù)本發(fā)明的抗體結(jié)合域被用作分離結(jié)合域或者其它多肽部分的融合蛋白。其也可以融合例如A蛋白，G，L的幾個(gè)抗體結(jié)合域，或者是融合經(jīng)氨基酸取代、缺失、插入而人工制成的功能性變種的幾個(gè)抗體結(jié)合域。也可能采用例如A蛋白、G、L等各自的變種，所述變種帶有缺失或被截短。優(yōu)選地，所述多肽不含有或僅含有1-2個(gè)糖基位點(diǎn)，更優(yōu)選地是它不含有任何糖類。優(yōu)選地，在本發(fā)明中采用含有至少四個(gè)抗體結(jié)合點(diǎn)的多肽，最佳地是具有42kD分子量的完整的A蛋白。這些完整的A蛋白具有4-5個(gè)針對(duì)IgGFc片段的強(qiáng)親合力結(jié)合位點(diǎn)。與針對(duì)生物素部分的多價(jià)抗生物素蛋白一起，所述多肽使所結(jié)合的分泌抗體的量顯著放大，從而使信號(hào)得到放大。多肽的生物素化可以通過以上所描述的細(xì)胞表面生物素化的任一方法來獲得。另外，也可以將生物素部分結(jié)合至酪胺上，然后將其共價(jià)連接至多肽上，所述過程是在過氧化氫存在的條件下，由過氧化氫酶所產(chǎn)生的氧自由基催化所形成的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是可以直接采用一種多肽-抗生物素蛋白復(fù)合物，其中多肽帶有至少一個(gè)A蛋白或G蛋白的抗體結(jié)合域。多肽和蛋白質(zhì)部分的交聯(lián)在生化領(lǐng)域是眾所周知的，可以通過很多試劑來完成。(Fasold等，交聯(lián)蛋白質(zhì)的雙功能試劑(bifunctionalreagentsforthecrosslinkingofproteins)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(1971)，10795-801)。例如，通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯偶聯(lián)到賴氨酸的氨基上是本領(lǐng)域所公知的。本發(fā)明的定義和優(yōu)選實(shí)施例同樣適用此目的。優(yōu)選地，生物素部分通過間隔基連至多肽上，間隔臂的長(zhǎng)度至少是15，優(yōu)選地至少22，最佳是至少30。適宜的間隔臂為例如直鏈烷基部分。當(dāng)幾種生物素化分子結(jié)合到一種抗生物素復(fù)合物上時(shí)，這種延伸的間隔臂減少了位阻現(xiàn)象。更加優(yōu)選地是，本發(fā)明的包含多肽的抗體結(jié)合域至少攜帶有3個(gè)生物素部分，所述生物素部分共價(jià)結(jié)合于多肽或蛋白質(zhì)上，更優(yōu)選地是每個(gè)多肽或蛋白質(zhì)各自有至少6個(gè)生物素部分，最佳地是6-10個(gè)生物素分子。多肽的這種生物素化程度的大小很容易由多肽中反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目(例如賴氨酸的氨基，半胱氨酸的巰基)，以及生物素試劑與進(jìn)行生物素化的多肽的比例來控制。根據(jù)本發(fā)明的第二檢測(cè)抗體可以是任何常見的，用熒光標(biāo)記的抗體或抗體片段，其能特異性地結(jié)合所分泌的第一抗體，其細(xì)胞克隆的表達(dá)通過本發(fā)明的方法進(jìn)行監(jiān)控。在本發(fā)明范圍內(nèi)，“檢測(cè)抗體”也可以解釋為含有第一和第二檢測(cè)抗體的任何適當(dāng)?shù)慕M合，而其中只有后者進(jìn)行了熒光標(biāo)記，這在相關(guān)技術(shù)中是經(jīng)常采用的，例如ELISA技術(shù)。同樣地，被第一分泌抗體識(shí)別的用熒光標(biāo)記的抗原也可以用于檢測(cè)。有利地是，在本發(fā)明的步驟b和步驟c之間，在細(xì)胞培養(yǎng)基中一段較短的干涉培養(yǎng)期間可以使細(xì)胞表面上的人工制得的抗體結(jié)合位點(diǎn)全部為分泌的抗體所飽和。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法，在用生物素化多肽培養(yǎng)細(xì)胞的過程中或者最遲在培養(yǎng)之后，將這些細(xì)胞在含有增粘劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。通過人為地增加培養(yǎng)物的粘度，從而防止細(xì)胞之間發(fā)生交叉干擾。這些試劑可以是例如甲基纖維素，PEG，淀粉，藻類多糖，細(xì)菌或植物，或膠質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，使用濃度至少為10％(w/w)的膠質(zhì)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的方法，在用生物素化多肽培養(yǎng)細(xì)胞的過程中或者最遲在培養(yǎng)之后，在用熒光標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行細(xì)胞染色之前，將細(xì)胞在含有非生物素化A蛋白的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，或者在含有本發(fā)明的另一種非捕獲性的、包含多肽的競(jìng)爭(zhēng)性抗體結(jié)合域的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其濃度至少為0.5μg/ml，更優(yōu)選地是濃度至少為4μg/ml，最優(yōu)選地是濃度至少為8μg/ml。有利地是，上述非捕獲性的、競(jìng)爭(zhēng)性A蛋白或類似物與增粘劑一起結(jié)合使用，從而防止細(xì)胞之間發(fā)生交叉干擾。優(yōu)選地是，根據(jù)本發(fā)明的方法，在用熒光標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行細(xì)胞染色之前，在使所分泌的抗體結(jié)合至已固定在細(xì)胞表面上的生物素化多肽之后，在細(xì)胞中加入第三封閉抗體，例如其濃度至少為0.5到5μg/ml。所述第三封閉抗體能夠結(jié)合至生物素化多肽的剩余抗體結(jié)合位點(diǎn)上，但是其不能被檢測(cè)中所使用的、用熒光標(biāo)記的第二抗原或抗體識(shí)別和結(jié)合。這種措施有利于進(jìn)一步消除克隆之間的后期交叉干擾，因而提高了本發(fā)明檢測(cè)的靈敏度和識(shí)別力。不言而喻，上述措施可以與其他措施結(jié)合使用，例如為了共同增強(qiáng)檢測(cè)的識(shí)別能力和靈敏度，聯(lián)合使用增粘劑和/或競(jìng)爭(zhēng)性非生物素化A蛋白及其類似物。實(shí)施例在所有實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞都取自批培養(yǎng)細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)階段，用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞染色計(jì)數(shù)技術(shù)進(jìn)行分析，它們的存活能力超過95％。1.對(duì)比實(shí)驗(yàn)采用由NSO骨髓瘤細(xì)胞系衍生的6A1(100)3細(xì)胞系。它是一種GS-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(Bebbington，C.等，1992，以谷氨酸合成酶(GS)基因作為可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記的來自骨髓瘤細(xì)胞的重組抗體的高水平表達(dá)(High-levelexpressionofarecombinantantibodyfrommyelomacellsusingaglutaminesynthetase(GS)geneasanamplifiableselectablemarker)，Bio/Technology10169-175)，其分泌人類嵌合IgG抗體cB372.3，所述抗體特異性結(jié)合于乳腺癌腫瘤抗原TAG73。按照Holmes等人(ibd)所公開的方法對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行處理。然而結(jié)果令人失望，所述分泌細(xì)胞以及未經(jīng)處理的陰性對(duì)照細(xì)胞系(NSO細(xì)胞系，ECACCNo.85110503)在熒光強(qiáng)度上并沒有觀察到可重復(fù)的、具有顯著意義的差別。同樣，對(duì)非生成性GS轉(zhuǎn)染的骨髓瘤細(xì)胞系，以及在細(xì)胞外部加入人IgG進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也沒有觀察到在平均熒光強(qiáng)度上存在有顯著差異。2.分泌檢測(cè)2.1分泌抗體的捕獲圖1對(duì)分泌抗體的捕獲和檢測(cè)原理進(jìn)行了示意性地描述。分泌嵌合抗體cB72.3的6A1(100)3細(xì)胞系再次被篩選作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。分泌基質(zhì)的組成如下。用25mL，pH8的PBS對(duì)1076A1(100)3細(xì)胞系進(jìn)行沖洗，然后重懸浮于1mL含有1mg/mlNHS-LC-生物素的生理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)PBS(pH8)溶液中(目錄號(hào)為21336，琥珀酰亞胺基-6-(生物素氨基酸)正己酸酯；Pierce，羅克福德，IL/U.S.A)。接著在4℃下培養(yǎng)40分鐘，用PBS(pH7)沖洗兩次，重新懸浮于1mLPBS(pH7)中。加入128ul1mg/ml的neutravidinTM的溶液，在室溫下培養(yǎng)細(xì)胞15分鐘，接著進(jìn)一步用50mLPBS(pH)洗滌。重懸浮于1mLpH7的PBS中，然后加入非生物素化的A蛋白至終濃度為1μg/mL，在室溫下培養(yǎng)5分鐘。接著加入52ul1mg/ml生物素化的A蛋白(Pierce，羅克福德，IL/U.S.A.；每個(gè)蛋白質(zhì)攜帶6-10個(gè)生物素標(biāo)記)溶液，在室溫下再培養(yǎng)15分鐘。用于培養(yǎng)的生物素化A蛋白的濃度并不是飽和的。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)證實(shí)，即使生物素化A蛋白的濃度為120μg/mL，結(jié)合仍未達(dá)到飽和(數(shù)據(jù)未顯示)。接著用適當(dāng)體積的純化cB72.3IgG配制陽(yáng)性對(duì)照樣品，濃度為6.6μg/mL。用作陰性對(duì)照的樣品由不含生物素/抗生物素蛋白/捕獲A蛋白親和基質(zhì)的細(xì)胞組成。這些樣品像其它樣品一樣進(jìn)行處理，即先在分泌基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。所有用于分泌檢測(cè)的樣品都進(jìn)行以下程序細(xì)胞重懸于10mL分泌基質(zhì)中(細(xì)胞培養(yǎng)基，如Holmes，P等人在“通過高產(chǎn)量親合捕獲表面展示技術(shù)篩選高分泌者的改進(jìn)的細(xì)胞系發(fā)展”(Improvedcelllinedevelopmentbyahighthroughputaffinitycapturesurfacedisplaytechniquetoselectforhighsecretors)，J.ofImmunologicalmethods，230(1999)，141-147中所述的富含10％明膠的用于培養(yǎng)NSO6A1(100)-3細(xì)胞系的培養(yǎng)基)。該培養(yǎng)基還含有8μg/mL的非生物素化A蛋白(Sigma，UK)，用以捕獲從生成細(xì)胞擴(kuò)散出的抗體，從而防止它們結(jié)合到非生成細(xì)胞上。細(xì)胞于4℃在分泌培養(yǎng)基中培養(yǎng)15分鐘。2.2熒光標(biāo)記用最終稀釋為1/500的鼠抗人κ輕鏈FITC復(fù)合物(Sigma，UK)檢測(cè)所結(jié)合的分泌抗體。按照2.1進(jìn)行處理的細(xì)胞在25mLPBS(pH7)中洗滌一次，加入320ul1mg/ml的鼠IgG封閉抗體(Sigma，UK)，與細(xì)胞混合，并培養(yǎng)5分鐘。接著用25mLPBS(pH7)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行第二次洗滌，并重懸于1mLPBS中。加入5ul1mg/ml鼠抗人κ輕鏈FITC檢測(cè)抗體(Sigma，UK)，培養(yǎng)15分鐘，在25mLPBS中再次洗滌后，細(xì)胞重懸于1mLPBS中，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。2.3流式細(xì)胞術(shù)在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行如上文所述的染色后，采用激發(fā)和檢測(cè)波長(zhǎng)為488nm和515nm的CoulterEpicsEliteflow流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。采用側(cè)向散射光和前向散射光來確定進(jìn)入的存活細(xì)胞群，測(cè)量該細(xì)胞群的熒光水平(和抗體結(jié)合數(shù)量)。(A)陰性對(duì)照(也就是沒有親和基質(zhì))、(B)具有被親和基質(zhì)捕獲的分泌抗體的細(xì)胞、(C)在細(xì)胞外部加入被親和基質(zhì)捕獲的純化IgG而進(jìn)行培養(yǎng)的陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞都在圖2中以細(xì)胞計(jì)數(shù)和熒光強(qiáng)度顯示出來。分泌細(xì)胞B的平均熒光為19.3，其與陰性對(duì)照A相比平均熒光增加了50倍。陽(yáng)性對(duì)照C的平均值為59.5，與陰性對(duì)照相比增加了125倍。表1給出了根據(jù)圖2的平均熒光數(shù)值。表13.對(duì)比實(shí)施例對(duì)與細(xì)胞表面分泌抗體相結(jié)合的生物素化捕獲抗體的效力與生物素化A蛋白的效力進(jìn)行了比較。在比較實(shí)驗(yàn)中，除了在培養(yǎng)中使用不含有任何增粘劑的PBS，以替代所有樣品的分泌基質(zhì)，其他嚴(yán)格按照第二部分進(jìn)行分泌檢測(cè)，。除了之前描述的標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照(A)，陽(yáng)性對(duì)照(C)，和cB72.3分泌性細(xì)胞(D)指外，用生物素化鼠抗人IgGFc特異性捕獲抗體(Sigma，UK)取代生物素化A蛋白制備出另一樣品(B)，其濃度為50μg/ml，培養(yǎng)15分鐘后固定到細(xì)胞表面，該濃度接近于飽和濃度，可以與前面實(shí)驗(yàn)中使用的A蛋白的量進(jìn)行比較。接著，樣品(B)與外源加入的人IgG一起進(jìn)行培養(yǎng)，按照上文所述的對(duì)陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行處理的步驟對(duì)樣品(B)進(jìn)行處理。在圖3中顯示了所有樣品的分布，與圖2一樣，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光分析，顯示細(xì)胞計(jì)數(shù)和熒光強(qiáng)度(圖3A陰性對(duì)照，B捕獲抗體，C陽(yáng)性對(duì)照，A蛋白，D分泌的cB72.3，A蛋白)。根據(jù)圖3中的分布，在表2中列出熒光強(qiáng)度的平均數(shù)值。人IgG模型產(chǎn)品(樣品B)的捕獲抗體的使用與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，平均熒光增加5倍。然而，當(dāng)使用A蛋白(樣品C)時(shí)，平均熒光增加80倍，因此證明了A蛋白比捕獲抗體更加有效。當(dāng)此技術(shù)用于捕獲和檢測(cè)所分泌的cB72.3時(shí)，A蛋白也非常有效，與陰性對(duì)照相比，平均熒光大約增加55倍。嚴(yán)格按照Holmes等人(ibd)所述而制得的樣品與陰性對(duì)照相比，沒有增加(沒有給出數(shù)據(jù))。表2比較實(shí)驗(yàn)B與C，D的數(shù)據(jù)，清楚地看出用A蛋白取代捕獲抗體使得檢測(cè)的靈敏度和結(jié)合能力顯著提高。理論上，與捕獲抗體相比，A蛋白應(yīng)該具有兩個(gè)多余的結(jié)合位點(diǎn)(總數(shù)4)，因而允許有雙倍的分泌抗體發(fā)生結(jié)合至A蛋白上(理論上，強(qiáng)度增強(qiáng)2倍)。由于強(qiáng)親和力結(jié)合抗體超出A蛋白的結(jié)合親和力大約一階，該期望值就構(gòu)成了一個(gè)理論最大值。相反，令人驚奇的是，由于尚未知曉的原因，實(shí)際所觀察到的A蛋白對(duì)捕獲抗體的強(qiáng)度增強(qiáng)大約為15-20倍，大大超過了理論預(yù)期值。圖1b比較了捕獲抗體結(jié)合外源性加入的IgGFc部分的結(jié)合能力，以及A蛋白結(jié)合該外源性IgG的結(jié)合能力。樣品基本按照本節(jié)本部分的描述進(jìn)行制備，所不同的是，用于培養(yǎng)的捕獲抗體和A蛋白的量都加倍了，以確保飽和結(jié)合。在確定體積的細(xì)胞團(tuán)中加入純化IgG抗體，以確保培養(yǎng)過程加入準(zhǔn)確的預(yù)定濃度的外源IgG。權(quán)利要求1.篩選分泌第一抗體的細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a)將抗生物素蛋白連接到細(xì)胞的細(xì)胞表面；b)將所述細(xì)胞與含有至少一個(gè)功能性抗體結(jié)合域的生物素化多肽一起培養(yǎng)；c)將細(xì)胞與第二抗體或抗原一起培養(yǎng)，該第二抗體或抗原是熒光標(biāo)記的并且識(shí)別和結(jié)合第一抗體上的抗原表位；d)篩選結(jié)合了一定量第二抗體的熒光標(biāo)記的細(xì)胞，優(yōu)選通過熒光分析流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行篩選。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化多肽為G蛋白或A蛋白。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在細(xì)胞表面被共價(jià)生物素化后，優(yōu)選在低于10℃進(jìn)行生物素化后，將抗生物素蛋白結(jié)合到細(xì)胞表面。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在與生物素化多肽一起進(jìn)行培養(yǎng)期間或最遲在培養(yǎng)之后，將細(xì)胞培養(yǎng)在含有增粘劑的培養(yǎng)基中。5.篩選分泌第一抗體的細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a)將抗生物素蛋白連接到細(xì)胞的細(xì)胞表面，其中，抗生物素蛋白結(jié)合于含有至少一個(gè)功能性抗體結(jié)合域的多肽，所述結(jié)構(gòu)域優(yōu)選來自G蛋白或A蛋白；b)將細(xì)胞與第二抗體或抗原一起培養(yǎng)，該第二抗體或抗原是熒光標(biāo)記的并且識(shí)別和結(jié)合第一抗體上的抗原表位；c)篩選結(jié)合了一定量第二抗體的熒光標(biāo)記的細(xì)胞，優(yōu)選通過熒光分析流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行篩選。全文摘要一種篩選高水平抗體生成細(xì)胞的方法，包括將A蛋白或G蛋白附著于細(xì)胞表面上的步驟，從而捕獲所分泌的可溶性抗體。通過常規(guī)的方法對(duì)捕獲抗體進(jìn)行熒光染色，然后進(jìn)行FACS分析，從而篩選出低豐度高產(chǎn)單細(xì)胞。文檔編號(hào)G01N33/53GK1545621SQ02814754公開日2004年11月10日申請(qǐng)日期2002年7月19日優(yōu)先權(quán)日2001年7月27日發(fā)明者A·雷切爾,R·辛格,A雷切爾申請(qǐng)人:隆薩集團(tuán)股份公司