專利名稱：抗體制備與篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于制備并便利地篩選抗體、特別是單克隆抗體的抗原呈遞方法。
由雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體具有多方面的意義，許多文獻對此作過很透徹描述(Bazin，“大鼠雜交瘤與大鼠單克隆抗體”，CRC出版社，1990年，515頁；Goding，“單克隆抗體原理與實踐”，第3版，學術出版社，1996年，492頁；Shepherd和Dean，“單克隆抗體”，牛津大學出版社，2000年，479頁)。這些抗體在診斷與預防和/或治療應用中都是有效的。本發(fā)明廣泛地涉及體內(nèi)與體外免疫。
免疫應答針對的物質(zhì)是一種具有一個或多個表位或一個或多個與至少一種載體分子偶聯(lián)的半抗原的天然分子或人工合成的分子。在抗原制劑種可以添加一種佐劑。這種抗原制劑(在下面也稱作“抗原”)相應于免疫學手冊中的經(jīng)典定義。本發(fā)明范圍內(nèi)考慮的免疫應答涉及在免疫學手冊中描述的那些免疫應答，具體而言是引起抗體合成的那些免疫應答。
自從骨髓瘤細胞與經(jīng)過免疫的動物的淋巴樣細胞之間的細胞融合技術產(chǎn)生以來，大量的實驗室生產(chǎn)出了針對抗原決定簇的單克隆抗體。Khler和Milstein(1975年，《自然》，第256卷，第495頁)建立了第一個分泌單克隆抗體的雜交瘤的模型，其是一個鼠科的模型。后來擴展到大鼠(Galfé等人，1979年，277，131)，并且現(xiàn)在還廣泛應用。
不過，除了融合技術外，獲得單克隆抗體首先取決于使用的免疫方法以及對目的雜交克隆進行正確的篩選?？梢詫游矬w的免疫方法分為體內(nèi)或者體外兩大類，后者為選擇動物的某些細胞并將其與抗原一起進行培養(yǎng)。
還可分成三種免疫技術i)用純化的目的抗原進行免疫，ii)用呈遞目的抗原的細胞進行免疫，iii)DNA免疫，包括施用一種表達目的抗原的編碼基因的DNA序列(質(zhì)粒)。在這三種情況下，已經(jīng)認識到導致產(chǎn)生針對該抗原的抗體的免疫應答，需要同時活化特異性識別天然抗原的B淋巴細胞以及(更多地)特異性識別降解的、并由被稱為抗原呈遞者的細胞通過主要組織相容性復合體的分子以肽的形式而呈遞的抗原的T淋巴細胞。
這些不同方式的常規(guī)的免疫一直以來被描述了近百年，而體外免疫是近來的。例如可以列舉Mishell和Dutton所描述的小鼠方面的技術或多組人類方面的技術。
使用蛋白質(zhì)的免疫需要預先對抗原進行純化或需要制備重組形式的抗原，而這種重組形式的抗原往往不具有天然蛋白質(zhì)的構象以及轉錄后特性。
使用細胞的免疫的最大缺陷是產(chǎn)生的各種各樣抗體，它們不僅識別目的蛋白質(zhì)，而且還識別大量的由這些細胞呈遞的其它抗原，這樣使得表征所得到單克隆抗體就變得很困難。
最后，采用所謂裸露DNA方法的免疫已成功地得到應用(Costaglioga等人，《免疫學雜志》(Journal of Immunology)，1998，160，1458-1465)，但得到的免疫應答強度水平仍有限。事實上，這些方法需要在被免疫的對象的宿主細胞中表達該抗原蛋白質(zhì)的編碼基因，并且需要這種蛋白質(zhì)隨即被呈遞于所述宿主的表面上或被這些宿主分泌。另外，這些方法不能篩選所得到的克隆。
這些方法可應用于對例如大鼠、小鼠或任何其它能夠產(chǎn)生體液免疫或細胞應答的一種動物進行經(jīng)典的免疫，所述的免疫或應答可以是正常的或通過轉基因手段修飾的。其對于體內(nèi)免疫以及體外免疫而言都是有效的。
曾使用經(jīng)轉染的并在細胞膜上表達目的抗原的非免疫自體或同種異體小鼠細胞系對小鼠進行免疫而得到了單克隆抗體(Palmer d，Kevany M，Mackworth-Young C.，Batchelor R.，Lombardi G，Lechler R.使用表達人和小鼠II類主要組織相容性二聚體的L-細胞轉染子，產(chǎn)生與表征HLA-DR特異性單克隆抗體?！睹庖哌z傳學》(Immunogenetics)33(1)12-17(1991)。Thurau SR.，Wildner G，Kuon W，Weiss EH，Rithumuller G.在高轉染受體P815中HLA-B27的表達與免疫原性誘導針對HLA-B27的單克隆抗體的新方法?！督M織抗原》(tissue antigen)33(5)511-519(1989))。
本發(fā)明的目的是提供一種新的免疫方法，該方法能夠很容易地獲得非常特異性的免疫應答、并且容易對所生成的抗體進行篩選。這個目的可以借助一種抗體制備方法達到，該方法包括下述步驟a)通過核酸構建體轉染細胞系，該核酸構建體含有編碼待表達于所述細胞系細胞表面的目的多肽的目的核酸序列，b)用步驟(a)制備的細胞或用該細胞的膜制備針對目的多肽的抗體。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術語“膜”不加區(qū)別地系指根據(jù)本技術領域技術人員已知的技術得到的完整細胞膜和其碎片。
本發(fā)明方法中使用的細胞可以是永生細胞系，但也可以是長壽命的細胞，例如成纖維細胞。
根據(jù)優(yōu)選的實施方式，在轉染步驟(a)中使用的細胞系是免疫系統(tǒng)的細胞系，例如淋巴細胞系。
選擇這些免疫系統(tǒng)細胞對本發(fā)明的方法而言具有決定性的意義，因為它們能夠自然植入(colonize)淋巴器官，在其中產(chǎn)生免疫反應，導致抗體產(chǎn)生。此外，這種免疫使用的轉染細胞系還可以作為與B淋巴細胞融合的細胞系，該B淋巴細胞在其表面產(chǎn)生并表達針對由該轉染細胞系表達的抗原的抗體。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，可便利地達到兩類細胞之間的結合，這樣可改進融合產(chǎn)率。
可以采用本技術領域技術人員已知的任何免疫或分子生物學方法制備這些抗體，然后在步驟(b)對其進行篩選。便利地，步驟(b)如下進行(i)使用在其表面表達在步驟(a)中制備的目的多肽的轉染細胞、或使用它們的膜使動物免疫，(ii)將在其表面表達在步驟(a)中制備的目的多肽的轉染細胞或它們的膜，與含有能產(chǎn)生抗體的細胞的細胞群體進行接觸。
術語“能產(chǎn)生抗體的細胞”，它應該理解為任何能有效產(chǎn)生抗體的細胞以及任何具有抗體組裝與產(chǎn)生所必需的條件但卻未產(chǎn)生抗體的細胞，例如，可僅僅由于其處于不成熟的發(fā)育階段。
本發(fā)明尤其涉及一種抗體制備方法，其中步驟(a)中的經(jīng)轉染的細胞系與(i)中的經(jīng)免疫的動物或(ii)中使用的細胞是組織相容性的。
使用能夠產(chǎn)生抗體的任何動物的細胞，當然，如哺乳動物的細胞，可以實施本發(fā)明的方法。優(yōu)選地，使用一種免疫系統(tǒng)細胞系，例如淋巴細胞系。該轉染的細胞系可以是任何動物的細胞系，包括哺乳動物的細胞系，更具體地是人的細胞系。
作為特別實例，可以列舉嚙齒動物骨髓瘤細胞系，優(yōu)選地為大鼠骨髓瘤細胞系，最優(yōu)選地為LOU品系大鼠骨髓瘤細胞系，如在2000年11月29日保藏于巴斯德研究院(巴黎)國家微生物培養(yǎng)物保藏中心的、保藏號為I-2584的LOU IR 983 F/TEC大鼠骨髓瘤細胞系。
根據(jù)本發(fā)明第一個實施方式，使用含有編碼目的膜多肽的目的核酸序列的核酸構建體，進行步驟(a)的細胞系轉染。當然，該目的核酸序列被置于調(diào)節(jié)序列的控制下，所述調(diào)節(jié)序列能夠使目的多肽的表達增加，并能夠使其輸送到該轉染細胞的表面。
根據(jù)本發(fā)明第二個實施方式，使用一核酸構建體進行步驟(a)的細胞系轉染，該核酸構建體在同一個閱讀框內(nèi)含有編碼被稱為“輔助膜”的膜蛋白質(zhì)的核酸序列以及編碼目的多肽的目的核酸序列。當然，該編碼輔助膜蛋白質(zhì)的核酸序列和該目的核酸序列被置于調(diào)節(jié)序列控制下，所述調(diào)節(jié)序列能夠使目的多肽的表達增加，并能夠使其輸送到該轉染細胞的表面。該目的核酸序列可以被置于該編碼輔助膜蛋白質(zhì)的核酸序列之前、之后或之中。在這種實施方式中，該編碼輔助膜蛋白質(zhì)的核酸序列和該編碼目的多肽的目的核酸序列彼此可以直接連接起來，或可以用一個或多個相同或不同的連接核酸序列連接起來。其可以是編碼相對惰性的肽或多肽的連接的序列，該惰性的肽或多肽的目的僅僅是避免輔助膜蛋白質(zhì)與目的多肽之間的相互作用。連接核酸序列也可以編碼參與免疫應答的多肽。作為這樣一種連接序列的實例，可以列舉下述序列GGGGSGGGGSGGGGS。
用于轉染本發(fā)明方法步驟(a)的細胞系而使用的核酸構建體有利地包括一種選擇基因，例如一種抗生素如新霉素的抗性基因。
用于轉染本發(fā)明方法步驟(a)的細胞系而使用的核酸構建體，優(yōu)選地是適合于步驟(a)的轉染細胞系的細胞的核酸載體。
本發(fā)明的載體的一個具體的實例從其5′到3′包括-啟動子，如啟動子Srα，-前導序列，如小鼠CD80的細胞，-克隆選擇的多位點，其中插入了該目的多肽的基因，-連接核苷酸序列，-編碼膜多肽如小鼠的CD80的核苷酸序列，該序列前面可以有前導序列之如小鼠CD80的前導序列。
根據(jù)本發(fā)明的方法的特別優(yōu)選的實施方式，步驟(a)的轉染的細胞系與用于制備抗體的(i)或(ii)中使用的細胞是自體的、同基因的或同源的。
在步驟(a)的細胞系轉染后，有利地，在表達該輔助膜蛋白質(zhì)或該目的多肽的步驟(b)前，對該轉染子進行分析。
因此，在用該載體轉染細胞系并在相應于抗性基因的培養(yǎng)基中選擇后，通過流式細胞儀分析轉染子的輔助膜蛋白或目的多肽的表達，例如使用針對這些多肽的單克隆抗體進行分析。所選的克隆在其表面有目的多肽。
根據(jù)本發(fā)明方法步驟(b)使用的技術，采用本發(fā)明方法制備的抗體可以是多克隆的或單克隆的。
于是，本發(fā)明方法步驟(b)的第一種實施方式包括制備針對目的多肽的單克隆抗體。這種實施方式包括使用一種動物細胞的細胞融合技術，該動物細胞接受了在步驟(a)中制備的在其表面表達目的多肽的轉染細胞或它們的膜。這些細胞或它們的膜有利地單獨地或與一種佐劑配合，分一次或多次施用給動物。在進行免疫前對所述細胞進行放射性照射可有效降低或阻斷其分裂機制。在采用本技術領域技術人員熟知的在前面描述的技術使細胞免疫和融合后，例如采用流式細胞儀，通過比較表達表面蛋白質(zhì)的、但用不含目的多肽的載體(“空白”載體)轉染的細胞上的附著物與表達表面蛋白質(zhì)的、且用含目的多肽的載體轉染的細胞上的附著物，可以檢測出產(chǎn)生針對目的多肽的單克隆抗體的克隆。
本發(fā)明的方法與Khler和Milstein的制備雜交瘤細胞的技術相結合特別具有價值，該技術在小鼠、大鼠或在任何其它種屬中以不同的適應性合成出單克隆抗體，但本發(fā)明的方法與任何利用體內(nèi)(轉基因或非轉基因動物)或體外免疫的方法相結合也特別具有價值。利用完全組織相容性的系統(tǒng)是高度優(yōu)選的，但不排除在非組織相容性的系統(tǒng)中使用，在完全組織相容性的系統(tǒng)中
-由于在待免疫的系統(tǒng)與用來進行免疫的系統(tǒng)之間的主要抗原是相同的，免疫系統(tǒng)的價值將是部分保留的，-在進行除同種異型抗原或異種抗原以外的篩選方面，其價值實際上也是保留的。
因此，本發(fā)明方法步驟(b)的第二種實施方式包括將在步驟(a)制備的在其表面上表達目的多肽的轉染細胞(例如對HAT培養(yǎng)基敏感的IR983F或Sp2/O細胞)或所述細胞的膜與產(chǎn)生抗體的細胞進行接觸。由此，使用根據(jù)Khler和Milstein的經(jīng)典細胞融合技術，但也可使用合成例如人的抗體的轉基因動物，且事實上可使用來自未成熟的或記憶B淋巴細胞的、產(chǎn)生特異性抗體的任何系統(tǒng)，通過在體內(nèi)(例如采用人細胞轉移到免疫缺陷動物中)或體外培養(yǎng)中用抗原刺激，有可能使一種或多種來自這種免疫應答的B淋巴細胞永生，并且達到快速而簡單地篩選出來自利用各種技術所得到的克隆。在已經(jīng)產(chǎn)生所尋求特異性抗體的B淋巴細胞的情況下(活化的B淋巴細胞，前漿細胞、漿細胞等)，下面描述的方法在篩選來自永生細胞的抗體的層面上具有其價值。
本發(fā)明的方法的步驟(b)的第三種實施方式包括-由產(chǎn)生抗目的多肽的抗體的B細胞，分離出編碼的所述抗體的每個鏈的核酸序列，-在宿主中表達所述核酸序列。
本發(fā)明的方法可以包括在步驟(b)后，通過讓所述抗體與下述細胞接觸而測試得到的抗體識別目的多肽的能力的試驗-步驟(a)中轉染的細胞，和/或-用與步驟(a)中使用的核酸相同但無目的核酸序列的核酸構建體轉染的細胞。
本發(fā)明的方法的卓越之處在于，它能夠使來自同一有機體的細胞永生，例如來自同一人類個體的細胞，可采用非常經(jīng)典的Epstein-Barr病毒技術使所述人類個體的B淋巴細胞永生，且使自同一血樣中或自其他時間收集并凍存的、或是自其他能夠收集到足夠量的來自同一個體的細胞的組織中收集的其它細胞永生。除了永生的細胞，可以使用長壽命的細胞，例如成纖維細胞，來實施本發(fā)明的方法。
通過選擇適合的細胞系和表達系統(tǒng)，本發(fā)明的方法能夠表達細胞中的抗原，而這些細胞不僅具有與待免疫細胞的I類組織相容性，而且還選擇表達II類組織相容性分子的細胞。在后一種情況下，這些轉染細胞能夠?qū)⒖乖腡細胞表位，如果它存在的話，呈遞給免疫系統(tǒng)的CD4 T淋巴細胞。
本發(fā)明的方法的卓越之處還在于，它不需要認識、也不需要預先制備靶向抗體必須能夠與之特異性結合的多肽序列甚或整個分子。事實上，當用適當構建體編碼的抗原被呈遞給免疫系統(tǒng)時(適當?shù)膭游锘蚣毎苽湮?，抗原本身在體內(nèi)或在體外系統(tǒng)中被認為是外來的，因此絕大部分抗體實際上是針對該抗原的。不同的理論對于在免疫應答過程中生成的全部或部分抗體是否針對引入免疫系統(tǒng)的抗原持有不同觀點。在實際中，當大多數(shù)抗體是針對所使用的抗原時，免疫應答被認為是特異性的。在本發(fā)明的情況下，抗體可以是針對引入的抗原以及由核酸構建體引入的抗原。通過適當轉染獲得具有除所研究的抗原外的全部轉染細胞抗原的適當對照細胞，可以避免與這個問題相關的缺陷。
最后，本發(fā)明方法的卓越之處還在于，它能夠顯著地簡化目的抗體的篩選步驟。只需將原細胞系、或用不含有編碼所述抗原的核酸的同樣核酸構建體轉染的細胞系的細胞，與用整合了編碼所述抗原的核酸的核酸構建體轉染的細胞系的細胞進行對照，比較兩者與待試驗的培養(yǎng)物上清液中的抗體的結合情況即可?？梢允褂靡活惙Q之FACS(熒光抗體細胞分析器)的儀器進行這類比較。使用熒光素標記的且能與第一抗體結合用第二抗體可以很容易檢測出作為靶向的第一抗體的存在。這類技術在專門實驗室是通常采用的。能給出對照細胞與轉染細胞之間差別的所有其它方法都可以采用。
本發(fā)明的方法在所有需要產(chǎn)生單克隆抗體或甚至多克隆抗體的領域都可找到應用，它們可以在研究中應用于診斷或治療。從直接治療觀點來看，本發(fā)明的方法可以用于病人免疫，其中必須保證能夠嚴格控制接種于病人的轉染細胞的命運。因此，例如使用轉染經(jīng)處理的自體細胞系，或使用所述細胞系的細胞的膜片段，本發(fā)明的方法可以用于誘導病人的免疫應答。
本發(fā)明還涉及如前面定義的能在本發(fā)明方法中使用的核酸構建體。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明方法步驟(a)得到的細胞，以及含有它們的組合物，或含有它們膜的組合物以及含有用本發(fā)明方法得到抗體的組合物。最后，本發(fā)明涉及施用于一對象的治療與診斷方法，該方法包括使用編碼有治療或診斷意義的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，在體內(nèi)實施本發(fā)明的方法。
通過閱讀下面非限制性地給出實施本發(fā)明方法的實施例，將體會到本發(fā)明的其它優(yōu)點與特征。
實施例I1)方法使用質(zhì)粒pBJ LL177，采用電穿孔方法轉染非分泌的骨髓瘤細胞系IR983F，該細胞系與LOU/C大鼠及其第一代雜種，如LOU/C XOKAMOTO和LOU/C X PVG/C大鼠是組織相容性的(Azuma M，Cayabyab M，Buck D Phillips JH和Lanier LL.CD28與B7相互作用共刺激由小靜止性T淋巴細胞介導的初級異源增生反應和細胞毒作用?！禞.Exp.Med.》，175353-360，1992)。
該質(zhì)粒(ATCC號99595)得自ATCC，編碼人的CD80，受啟動子SRα控制(Takabe Y，SeikiM，F(xiàn)ujisawa JF，Hoy P，Yokota K，Arai KI，Yoshida M和Arai N.SRα啟動子由猿病毒40早期啟動子和1型人T-細胞白血病長末端重復的R-U5片段組成的高效和多用途的哺乳動物cDNA表達系統(tǒng)。《Mol.Cell.Biol.》，8466-472.1988)。這種質(zhì)粒還具有新霉素抗性基因。
電穿孔條件在濃度10微克/毫升質(zhì)粒的500毫升培養(yǎng)基中5百萬個細胞接受300伏脈沖。
在含有新霉素(1毫克/毫升)的培養(yǎng)基中選擇后，用單克隆抗體抗-CD80 BB1(Pharmingen)、采用流式細胞儀分析轉染子的人CD80的表達。得到表面表達人CD80最多的克隆。
LOU/C大鼠接受兩次(中間間隔兩周)腹膜內(nèi)注射陽性IR 983F CD80(每次注射2×107個細胞)，該細胞經(jīng)過銫源輻照，劑量為2.5Gy，并且在第一次注射時細胞經(jīng)完全弗氏佐劑乳化，在第二次注射時細胞經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化。第二次免疫后兩個周，免疫動物的血清中出現(xiàn)識別表達人CD80的IR983F、但不識別正常IR983F的抗體。
LOU/C鼠還接受兩次(中間間隔兩周)足底內(nèi)注射陽性IR 983F CD80(每只爪注射107個細胞)，該細胞經(jīng)過銫源輻照，劑量為2.5Gy，并且在第一次注射時細胞經(jīng)完全弗氏佐劑乳化，在第二次注射時細胞經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化。第二次免疫后四天，抽取腘淋巴結(popliteal ganglia)，這些細胞與IR983F融合。
得到了十七株雜交瘤細胞，這些細胞產(chǎn)生可識別表達人CD80的IR983F、但不識別未轉染的IR983F的單克隆抗體。三株是同種型(isotype)IgG1，九株是同種型IgG2a，四株是同種型IgG2b和一株是同種型IGM。
這些抗體還能識別同樣表達CD80的DAUDI人B細胞系。
2)結果上面描述的方法能夠得到只是針對膜蛋白質(zhì)的抗體。為了將這種方法推廣到所有蛋白質(zhì)中，制備出一種表達載體，它能夠使得在IR983F表面上表達一種多肽。這種載體從5′到3′分別含有-啟動子Srα，-小鼠CD80的引導序列，-克隆位點Sfi I/Not I，其能夠插入編碼目的多肽的基因，-編碼輔助多肽連接鏈的核酸序列，所述輔助多肽連接鏈具有基序GGGGSGGGGSGGGGS，-不含有引導序列的小鼠CD80的編碼部分。該載體還有新霉素抗性基因。
在用這種載體轉染IR983F并在含有新霉素的培養(yǎng)基中選擇后，用小鼠單克隆抗-CD80抗體、采用流式細胞儀分析轉染子的小鼠CD80的表達。
表達小鼠CD80的克隆必然在其表面表達下述多肽序列膜-小鼠CD80-GGGGSGGGGSGGGGS-目的多肽-NH2。
在細胞免疫與融合后，采用流式細胞儀方法，通過比較用“空”載體轉染的IR983F與用含有與小鼠CD80融合克隆的目的序列的載體轉染的IR983F的抗體附著情況，可以檢測產(chǎn)生針對目的多肽的單克隆抗體的克隆，所述的“空”載體中，目的序列沒有被克隆，因此不表達小鼠CD80。
采用“空”表達載體或者含有炭疽桿菌基因的表達載體轉染IR983F細胞。
在含有新霉素(1毫克/毫升)的培養(yǎng)基中選擇后，得到了表達小鼠CD80的轉染子，可使用單克隆抗體MCA 1586F(Serotec)，采用流式細胞儀方法檢測這些轉染子。
得到表面表達人CD80最多的克隆。
然后使用這些轉染子對動物進行免疫。
例如，LOU/C大鼠接受兩次(中間間隔兩周)足底內(nèi)注射陽性IR983F-CD80(每只爪107個細胞)，該細胞是經(jīng)含有炭疽桿菌基因的表達載體轉染的，且在第一次注射時經(jīng)完全弗氏佐劑乳化，在第二次注射時經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化。第二次免疫后四天，收集腘淋巴結，將這些細胞與IR983F融合。
由此得到了雜交瘤細胞，其產(chǎn)生的單克隆抗體可識別被含有炭疽桿菌基因的載體轉染的陽性IR983F-CD80，但不識別只是被“空”載體轉染的陽性IR983F-CD80。
實施例III1)方法使用質(zhì)粒pBJ CD94，采用電穿孔方法轉染非分泌的骨髓瘤細胞系IR983 F。通過代替質(zhì)粒pBJLL177中克隆的CD28基因，構建這種質(zhì)粒。這種質(zhì)粒還具有新霉素抗性基因。
電穿孔條件在含有濃度為10微克/毫升的質(zhì)粒的500微升培養(yǎng)基中的5百萬個細胞接受300伏脈沖。
在含有新霉素(1毫克/毫升)的培養(yǎng)基中選擇后，用HP-3D9抗-CD94單克隆抗體(Pharmingen)、采用流式細胞儀分析轉染子的人CD94的表達。得到表面表達人CD94最多的克隆。
LOU/C大鼠接受兩次(中間間隔兩個月)腹膜內(nèi)注射陽性IR 983FCD80(每次注射2×107個細胞)，該細胞經(jīng)過銫源輻照，劑量為2.5Gy，且在第一次注射時經(jīng)完全弗氏佐劑乳化，并在第二次注射時經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化。第二次免疫后兩周，經(jīng)過免疫的動物的血清出現(xiàn)識別表達人的CD94的IR983F、但不識別正常IR983F的抗體。
LOU/C大鼠還接受兩次(中間間隔兩周)足底內(nèi)注射陽性IR 983FCD94(每只爪107個細胞)，該細胞經(jīng)過銫射線輻照，劑量為2.5Gy，且在第一次注射時經(jīng)完全弗氏佐劑乳化，并在第二次注射時經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化。第二次免疫后四天，抽取腘淋巴結，將這些細胞與IR983F或表達人CD94的IR983F融合。
通過將2千6百萬淋巴結細胞與IR983F進行融合，得到八株產(chǎn)生人抗-CD94單克隆抗體、但不識別非轉染IR983F的雜交瘤細胞。通過將2千萬淋巴結細胞與表達人CD94的IR983F進行融合，得到十七株產(chǎn)生人抗-CD94抗體的雜交瘤細胞。
所有這些抗體均同時識別IR983F CD94和表達CD94的人NK。
這些克隆的同種型是3株IGM，IgG1，15株IgG2a，5株IgG2b，1株IgG2c。
使用表達人配體CD134的IR983F作為免疫細胞系。通過將3千萬淋巴結細胞與IR983F進行融合，得到四株產(chǎn)生抗-CD134L抗體的雜交瘤細胞。使用3千萬表達人CD134的細胞進行融合時，得到十株產(chǎn)生抗-CD134L抗體的雜交瘤細胞。所有這些抗體均同時識別IR983F CD134L和表達CD134L的人B淋巴細胞。
實施例IV例如采用Dounce勻漿方法得到IR983F膜(Koizumi K，Shimizu KT，Nishida K，Sato C，Ota K，Yamamada N.《Biochim-Biophys.Acta》，649393-403，1981)。
LOU/C大鼠接受三次皮下注射相當于4千萬表達人CD70的IR983F細胞，每次間隔兩天。
在第一次注射后十天，采用流式細胞儀，在經(jīng)過免疫的動物的血清中檢測到特異性識別表達人CD70的IR983F細胞的單克隆抗體。
實施例V使用SP2/O細胞作為能在本發(fā)明方法的步驟(a)株被轉染的細胞系，可以實施本發(fā)明的方法。
這個
具體實施例方式
的實施例描述如下材料完全的RPMI培養(yǎng)基-一瓶500毫升RPMI-5毫升L-谷氨酰胺-500微升慶大霉素(50毫克/毫升)電穿孔培養(yǎng)基(適量至300毫升，無菌蒸餾水)-0.3M肌醇(16.2克)+1毫摩爾磷酸二氫鉀(40.82毫克)+0.1毫摩爾醋酸鈣(4.74毫克)+0.5毫摩爾醋酸鎂(32.17毫克)。
后-電穿孔培養(yǎng)基(適量至300毫升，無菌蒸餾水)132毫摩爾氯化鈉(2.13克)+8毫摩爾氯化鉀(178.9克)+10毫摩爾磷酸二氫鉀(408毫克)+0.1毫摩爾醋酸鈣(4.74毫克)+0.5毫摩爾醋酸鎂(32.17毫克)。
方法-自培養(yǎng)瓶取樣進行SP2/O細胞計數(shù)。
-收集1×107個細胞。
-將收集的細胞在1300rpm下離心5分鐘。
-在37℃下將沉淀物重懸在1毫升電穿孔緩沖液中。
-根據(jù)這種情況添加10微克CD40L或添加質(zhì)粒CD94。用最初克隆在BCMGSneo-TRAP中的CD40L基因取代質(zhì)粒PBJ LL177中的克隆的CD28基因，由此構建質(zhì)粒PBJ-CD40L(TRAP克隆，人T細胞CD40的配體?！禘ur.J.Immunol.》，223191-3194.1992)。
-得到的懸浮液用加壓抽吸進行勻漿。
-收集400微升懸浮液。
-在400微升錐形管中，在350V、5ms、一次脈沖條件下，在存在所述質(zhì)粒的情況下，對細胞懸浮液進行電穿孔。
-往管中添加1毫升37℃的后-電穿孔培養(yǎng)基。
-該懸浮液在室溫下培養(yǎng)10分鐘。
-收集管中內(nèi)容物，將這些細胞懸浮液重懸在無酚紅的RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen)中。
然后，這些細胞再按照每孔200微升的量分配在96孔培養(yǎng)板中。
將它們在含5％CO2的空氣中于37℃培養(yǎng)24小時。
通過每孔添加150微升含有0.5毫克/毫升遺傳霉素(Geneticin)(Invitrogen)的完全RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen)，對培養(yǎng)基進行更換。
這些細胞再在5％CO2氣氛下于37℃培養(yǎng)。
由此得到經(jīng)質(zhì)粒轉染的細胞(具有遺傳霉素抗性)。
根據(jù)這種情況，采用FACS分析經(jīng)該質(zhì)粒轉染的細胞，以便測定CD40L或CD94在膜上的表達。
結果由按照上述方法進行的實驗可得到-一個表達CD40L的轉染的SP2/O克隆(SP2/O-CD40L)
-三個表達CD94的SP2/O克隆(SP2/O-CD94-F4，SP2/O-CD94-F1和SP2/O-CD94-D2)。
序列表<110>泰克諾法姆公司<120>抗體制備與篩選方法<130>11379PCT<140>PCT/FR01/xxxxxx<141>2002-04-03<150>FR01/04525<151>2001-04-03<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>其他_特征<222>(1)..(15)<223>避免輔助膜蛋白與目的多肽之間發(fā)生相互作用的連接鏈的實例<400>1Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 1權利要求
1.抗體制備方法，該方法包括下述步驟a)通過一種核酸構建體轉染細胞系，該核酸含有編碼表達于所述細胞系細胞表面的目的多肽的目的核酸序列，b)用步驟(a)中制備的細胞或用該細胞的膜制備針對所述目的多肽的抗體。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(a)中經(jīng)轉染的細胞系是免疫系統(tǒng)的細胞系，優(yōu)選地淋巴細胞系。
3.根據(jù)權利要求1或2中任一權利要求所述的方法，其特征在于用通過以下步驟得到的B細胞制備步驟(b)的抗體(i)使用在其表面表達在步驟(a)制備的目的多肽的轉染細胞，或使用該細胞的膜使動物免疫，(ii)讓在其表面表達在步驟(a)制備的目的多肽的轉染細胞或該細胞的膜，與含有能產(chǎn)生抗體的細胞的細胞群體進行接觸。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(a)中轉染的細胞系與在(i)中免疫的動物或在(ii)中使用的細胞是組織相容性的。
5.根據(jù)上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特征在于在步驟(a)，用核酸構建體轉染細胞系，該核酸構建體含有編碼目的膜蛋白質(zhì)的目的核酸序列。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于將所述的目的核酸序列置于調(diào)節(jié)序列控制下，該調(diào)節(jié)序列能夠使所述的目的多肽的表達增加，并能夠使其輸送到該轉染細胞的表面。
7.根據(jù)權利要求1-4中任一權利要求所述的方法，其特征在于在步驟(a)，用核酸構建體轉染細胞系，該核酸構建體在同一個閱讀框內(nèi)含有編碼膜蛋白質(zhì)的核酸序列和編碼目的多肽的目的核酸序列。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述編碼膜蛋白質(zhì)的核酸序列和目的核酸序列被置于調(diào)節(jié)序列控制下，該調(diào)節(jié)序列能夠使所述的目的多肽的表達增加，并能夠使其輸送到該轉染細胞的表面。
9.根據(jù)權利要求7或8中任一權利要求所述的方法，其特征在于所述目的核酸序列被置于該編碼膜蛋白的核酸序列之前、之后或之中。
10.根據(jù)權利要求7-9中任一權利要求所述的方法，其特征在于所述編碼膜蛋白質(zhì)的核酸序列與編碼目的多肽的目的核酸序列由一或多個相同或不同的連接核酸序列而連接。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征在于其中一個連接核酸序列編碼參與免疫應答的多肽。
12.根據(jù)權利要求1-11中任一權利要求所述的方法，其特征在于轉染步驟(a)的細胞系時使用的核酸構建體包括選擇基因，例如耐抗生素的基因。
13.根據(jù)上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特征在于轉染步驟(a)的細胞系時使用的核酸構建體是適合于步驟(a)轉染細胞系的細胞的核酸載體。
14.根據(jù)權利要求1-13中任一權利要求所述的方法，其特征在于所述的轉染細胞系與制備抗體時在(i)或(ii)中使用的細胞是自體的、同基因的或同源的。
15.根據(jù)上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特征在于該細胞系轉染后，分析表達膜蛋白質(zhì)或目的多肽的轉染子。
16.根據(jù)上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特征在于在步驟(b)中采用細胞融合技術自一種動物細胞制備單克隆抗體，該動物接受了在步驟(a)中制備的、在其表面表達目的多肽的、轉染的細胞或該細胞的膜。
17.根據(jù)權利要求1-15中任一權利要求所述的方法，其特征在于步驟(b)包括-自產(chǎn)生針對所述目的多肽的抗體的B細胞中分離出編碼所述抗體的每個鏈的核酸序列，-在宿主中表達所述核酸序列。
18.根據(jù)上述權利要求中任一權利要求所述的方法，其特征在于在步驟(b)后，通過將得到的抗體與下述細胞接觸以測試所述抗體識別所述目的多肽的能力-在步驟(a)中轉染的細胞系的細胞，和/或-用與步驟(a)中使用的核酸構建體相同但不含所述目的核酸序列的核酸構建體轉染的細胞系的細胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的是一種抗體制備方法，該方法包括下述步驟a)用一種核酸構建體轉染細胞系，該核酸構建體含有編碼表達于所述細胞系的細胞表面的目的多肽的目的核酸序列，b)用步驟(a)中制備的細胞或用該細胞的膜制備針對目的多肽的抗體。
文檔編號C12N1/15GK1511163SQ02807746
公開日2004年7月7日 申請日期2002年4月3日 優(yōu)先權日2001年4月3日
發(fā)明者埃爾韋·巴贊, 楊尼克·尼澤, 尼澤, 埃爾韋 巴贊 申請人:泰克諾法姆公司